Iskazivanje LINE-1 endonukleaze varijanti u rak želuca: njegova povezanost s kliničkopatološkim parametrima

Iskazivanje endonukleaze varijante LINE-1 u karcinomu želuca: njegova povezanost s kliničkopatološkim parametrima
apstraktne pregled pozadini pregled Long mjestimice nuklearni elementa-1 (LINE-1 ili L1), najrasprostranjeniji i samo autonomno aktivna obitelj od ne-LTR retrotransposons u ljudskom genomu, izražena ne samo u zametnih linije nego i somatskim tkivima. To doprinosi genetskoj nestabilnosti, starenje i bolesti povezanih sa starenjem, poput raka. Naša prethodna studija identificiran je kod ljudskog želučanog adenokarcinoma upregulated transkript GCRG213 koji dijele 88% homolognosti sa humanim L1 sekvencom i sadrži pretpostavljenu konzervirani apurinic /apyrimidinic endonucleas1 domene. Pregled Methods
imunohistokemija je provedena upotrebom monoklonskog mišjeg anti humani GCRG213 proteina (GCRG213p) antitijelo proizvedeno u našem laboratoriju, na microarray tkiva, izgrađene s primjercima iz 175 bolesnika želučanog adenokarcinoma. ocijenjena je korelacija između ekspresije GCRG213p i bolesnika kliničkopatološkim parametara. Izraz GCRG213p u želučanim staničnim linijama karcinoma su upotrebom Western blot-analizu. L1 promotor metilacije status želučanih stanica raka testirana je pomoću metilacija specifičan PCR. BLASTP je korišten u NCBI Blast poslužitelj za prepoznavanje GCRG213p slijed na bilo poravnanja u bazama podataka Data Bank proteina. Pregled Rezultati
Most primarni karcinom želuca, metastaza u limfnim čvorovima i želučanih intestinalne metaplazije žlijezde su pokazali pozitivan GCRG213p imunoreaktivnost. Visoka GCRG213p imunološko rezultat u primarni karcinom želuca je pozitivno korelirana s tumora diferencijacije (dobro diferencirani, p = 0,001), Lauren je klasifikacija (crijevna tipa, p < 0,05) i kasnog početka dobi želučanog adenokarcinoma (≥65 god; p <0,05). GCRG213p izraz nema povezanosti s drugim kliničkopatološkim parametrima, uključujući opstanak. Western blot analiza ekspresije GCRG213p u želučanih stanica raka pokazala da GCRG213p razina je viša u želučanim staničnim linijama karcinoma nego u ljudske normalne želučanog epitela besmrtnim linijskim stanicama GES-1. Djelomična metilacija L1 u želučanim stanicama raka potvrđena je metilacije specifičan PCR. BLASTP program za analizu pokazala da GCRG213p peptid dijeli 83,0% usklađivanje s C-terminalnog područja L1 endonukleazom (L1-en). GCRG213p slijed posjeduje važne ostatke koje čine očuvanog obilježja L1-HR. Pregled Zaključci
GCRG213p može biti varijanta L1-HR, funkcionalni član L1-EN obitelji. Prekomjerna ekspresija GCRG213p je zajedničko u oba primarna rak želuca i limfnih čvorova metastaze. Ovi rezultati pružaju dokaze o somatskim L1 izražavanja u rak želuca, i njegovih mogućih posljedica u obliku tumora. Pregled Ključne riječi pregled, karcinom želuca Long mjestimice nuklearne Element-1 endonukleaze GCRG213 tkivnih proteina Microarray pozadini pregled Long mjestimice nuklearni elementa -1 (LINE-1 ili L1) je najrasprostranjeniji i samo autonomno aktivni obiteljski ne-LTR retrotransposons u ljudskom genomu i obuhvaća oko 17% ljudskog genoma [1]. Velika većina od oko 500.000 ukupnih primjeraka L1 u ljudskom genomu nisu sposobni za prenošenje na vlastitu zbog različitih mehanizama kao što su skraćene i inaktivaciju mutacija. Međutim, procjenjuje 80-100 full-length, retrotransposition nadležna L1s (RC-L1s) prisutni su u tipičnom diploidne ljudskog genoma, a mali broj, nazvao "vruće L1s" pokazuju visoki retrotransposition učinkovitosti. [2] pregled Ljudsko RC-L1s oko 6,5 kb i kodiranje dva proteina (ORF1p i ORF2p) potrebne za retrotransposition [3]. ORF1p je 40-kDa protein s RNA obvezujuća [4] i kiselina pratioc aktivnosti nukleinske [5]. ORF2p je 150-kDa protein sa endonukleaze (L1-HR) [6] i reverzne transkriptaze (L1-RT) [7] aktivnostima. L1 element može integrirati u nekoliko stotina tisuća genomske lokacije, na labavo definirane konsenzus mjesto (5'-TTTT /AA-3 '), koji je presječen, od L1-HR [8]. Domaćin ograničava širenje takvih elemenata transkripcije i post-transkripcijskih utišavanje mehanizme koji smanjuju aktivnost na podnošljivih razina [9]. Pregled L1 izražena ne samo u zametnih linije nego i somatskim tkivima. Pretpostavlja se da je čak i niske razine somatskih oštećenja DNA zbog djelovanja L1 imaju potencijal da doprinese genetske nestabilnosti, starenje i bolesti povezanih sa starenjem, poput raka [10, 11]. L1-ORF1 i ORF2 je regulirana kod različitih malignih bolesti kao što su rak dojke, rak gušterače i malignih tumora zametnih stanica, itd [12-14]. L1 hypomethylation opažena kod različitih malignih bolesti kao što su glava i vrat, karcinoma jednjaka i želuca, te predmalignih lezija [15, 16]. Stupanj L1 hypomethylation je također bio povezan s više poodmakloj fazi i lošijom prognozom [17, 18]. Pregled L1-inducirane utjecaj na stanice nije vjerojatno ograničena samo na potpuno aktivnih elemenata. Čak L1 elementi s neispravnih ORF1 kodiranje regijama mogli napraviti RNA koja splices izraziti funkcionalnog ORF 2 s nizom negativnih posljedica za stanicu [19]. Mnogi tkiva proizvode prevesti spojeni ORF2 (SpORF2) prijepis [20]. Spojeni L1 transkript koji uključuje dio cjeline povratne transkriptaze slijed ORF 2, utvrđeno je da je neophodna za proliferaciju ljudske hepatoma stanične [21].
Naših prethodnih studija [22] identificirali regulira prema gore prijepis, pod nazivom rak želuca povezane gena 213 (GCRG213) u ljudske želučane adenokarcinoma. BLAST analiza GCRG213 slijedu pokazuje 88% homologije s ljudskim LI i otkrio navodni konzervirani domenu, apurinic /apyrimidinic endonucleas1 (APE), u GCRG213-ORF. Naš najnoviji pretraživanje ažurirane GenBank baze podataka pokazuje GCRG213-ORF sadrži L1-HR očuvan domene. U radu naše sadašnje studiju koja je potvrdila GCRG213 proteina (GCRG213p) izraz u želučanom staničnim linijama karcinoma pomoću monoklonskih miša anti-GCRG213p antitijela proizvedena u laboratoriju (Gerijatrijski institut Kina PLA Opća bolnica, Peking, Kina). Dodatno, imunohistokemijom (IHH) nanosi na microarray tkiva (TMA) je korištena za evaluaciju ekspresije GCRG213p u karcinomu želuca i normalnom želučane sluznice. Daljnje analize su provedene vidjeti ako ima bilo korelacija između ekspresije GCRG213p i kliničkopatološkim parametara i opstanak.
Metode pregled pacijenata
Pacijenti koji su podvrgnuti gastrektomije za rak želuca u PLA općoj bolnici, Peking, Kina od 1991. do 2003. godine smatrani su kandidati za ovu studiju. Kriteriji za uzorkovanje su kako slijedi: spol (muškarci ili žene), dob (20 godina ili stariji); nedavno dijagnosticiran (incident) karcinom želuca, bez prethodne obrade; Dijagnoza histološki potvrđena; uklopljeno u parafin tumora, u paru okolini netumorskih želučane sluznice tkiva na raspolaganju, s karcinomima koji metastaziraju u limfnom čvoru, ako je moguće; i pozitivne praćenja rezultata u vrijeme TMA gradnje. Kao rezultat toga, 175 slučaja su regrutirani u ovoj studiji, koja se sastoji 144 muškaraca i 31 žena (27 ~ 84 godina, srednja vrijednost = 58.58 godina). Među njima, šezdeset sedam slučajeva imaju karcinome s pridruženim limfnog čvora metastazama i šest slučajeva formalinom fiksiranih, u parafin ugrađenih tkiva normalnih želučanih također su dobiveni od ne-tumorskih pacijenata koji su operirani zbog benignih želučane bolesti.
Demografski , način života i kliničkopatološkim podataka u slučajevima uzorka prikazane su u tablici 1. Svi tumori su klasificirane i postavljena u skladu sa smjernicama zagovara Međunarodne unije protiv raka. Follow-up je napravljen za procjenu njihove najnovije uvjeta u 2005 od strane konzultantske njihovom slučaju dokumente ili putem telefonskih poziva pacijenata (ili članova njihovih obitelji ili obiteljske medicine). Usvojena je minimalni razmak od 18 mjeseci, a medijan praćenja vremena za pacijente koji su još bili živi do kraja 2005. godine bio je 46 mjeseci (raspon je od minimalno 18 do maksimalnih 129 mjeseci). Vrijeme preživljavanja je izračunata od datuma operacije do datuma smrti ili zadnji datum poznat alive.Table 1 kliničkopatološkim parametri pacijenata s rakom želuca studirao u microarray tkiva
N (%)
GCRG213p negativna
GCRG213p pozitivno
P vrijednost
Spol pregled muški pregled 144 (82.28%)
31 pregled 113 pregled 0.111
Ženski pregled, 31 (17.72%)
11 pregled, 20 pregled Age izvoznici < 65 godina pregled 104 (59.43%)
31 pregled, 73 pregled 0,029
≥65 godine pregled, 71 (40.57%)
11 pregled, 60 pregled Pušenje pregled Da
45 (27.27%) pregled, 7 pregled 38 pregled 0.278
Ne pregled 120 (72.73%)
30 pregled, 90 pregled Pijenje
Da
28 (16.97%)
2 pregled, 26 pregled 0.060 pregled Ne pregled 137 (83,03%)
35 pregled 102 pregled obiteljska povijest tumora pregled Da pregled 14 (8,43%), pregled 2 pregled, 12 pregled 0,639
Ne pregled 152 (91,57%) pregled, 36 pregled 116 pregled tumora lokacija pregled srčanom pregled, 48 (27.43%)
8 pregled 40 pregled 0.360
Body pregled, 37 (21.14%)
10 pregled, 27 pregled antruma pregled, 90 (51.43%)
24 pregled, 66 pregled, veličina tumora (cm) pregled ≤1 pregled, 11 (6,29%) pregled 3
8
0.506 pregled, 1-3 pregled 42 (24,00%)
13 pregled, 29 izvoznici > 3
122 (69,71%)
26 pregled, 96
Dubina invazije pregled T1 pregled, 46 (26.28%)
12
34
0,635 pregled T2
21 (12,00%), pregled, 7 pregled 14 pregled T3 pregled, 33 (18.86%) pregled, 6
27 pregled T4 pregled, 75 (42,86%)
17 pregled, 58 pregled, zahvaćenost limfnih čvorova pregled Da
75 (42.86%)
16 pregled, 59 pregled 0,592 pregled Bez pregled 100 (57.14%)
26 pregled, 74 pregled Grade tumorske diferencijacije pregled Pa pregled 10 (5,71%)
0 pregled 10 pregled 0.001
umjerene pregled 40 (22.86%) pregled 4. pregled 36 pregled Loše pregled 103 (58.86%)
27 pregled, 76 pregled, pečatni prsten ćelije pregled, 22 (12.57%)
11 pregled, 11
Tumor faza (TNM) pregled, 0 pregled 21 (12,00%)
3 pregled 18 pregled 0,217 pregled la
14 (8,00%), pregled, 6 pregled 8
Ib
41 (23.43%)
10 pregled, 31 pregled II pregled, 60 (34.29%)
17
43
IIIa
39 (22.28% )
6 pregled 33 pregled, Lauren je klasifikacija pregled crijevnoj tipa pregled, 153 (87,43%), pregled, 31 pregled 122 pregled 0,015 pregled difuznim tipa pregled, 22 (12.57 %)
11 pregled, 11 pregled, Resekcija margina pregled prisutnosti pregled 6 (3,43%)
0 pregled 6 pregled 0,361
Odsutnost pregled 169 (96.57% )
42
127 pregled mikrovaskularne invazije
prisutnosti pregled, 20 (11,43%), pregled 5
15 pregled 0,911 pregled Odsutnost pregled 155 (88,57%) pregled, 37 pregled 118 pregled statusa pregled živ pregled 121 (71,18%)
30 pregled, 91 pregled 0,483 pregled mrtav pregled 49 (28.82%)
9 pregled 40 pregled, pet godina preživljavanja izvoznici < 5 god pregled, 47 (43.93%)
12
48
0.871 izvoznici > = 5 god pregled 60 (50,07%)
10 pregled, 37 pregled dopuštenje dao je etičkog povjerenstva PLA Opće bolnice, Beijing, China koristiti tkiva i podatke za ovaj projekt. Informirani pristanak je također dobiven od pacijenata. Pregled tkiva MicroArray izgradnju, GCRG213p imunohistokemijskih bojanja i procjenu
tkiva Microarrays (TMAs) konstruirani su kako je ranije [23] što je opisano. Iz uzoraka na raspolaganju, šest tkiva array blokovi pripremljeni su, svaki dio ima 30 slučajeva sa tumora, normalnim i limfnih čvorova tkiva ako je dostupna. Pregled Antigen dohvat TMA dijapozitiva, formalin-fiksna, sekcije tkiva parafin uklopljenih su provedena pomoću tlaka liječenje kuhalo 10 min u jednom dohvat antigen otopine (10 mmol /L natrijev citrat pufer, pH 6,0). Monoklonsko mišje anti humani GCRG213p antitijela, koji je dobiven u našem laboratoriju [24], je dodan u razrjeđenju 1: 200, te inkubirati 2 sata na sobnoj temperaturi. Stakalca su potom inkubirani tijekom 1 sata sa sekundarnim protutijelom. Predvidjeti kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) je korišten za vizualizaciju vezanje antitijela, i objektna stakalca su naknadno negativno hematoksilinom. PBS samo bojenje Uzorak je korišten kao pozadinsku kontrolu.
Specifični žutosmeđi imunološko GCRG213p isključivo se nalazi u citoplazmi. To je postignuto samostalno i na slijepo pomoću dva ispitivača (GJ i XL). Inter-promatrača neslaganja (oko 6% od ukupnog broja) su pregledani po drugi put, nakon čega slijedi konačni presude oba promatrača. Formalno bodovanja je naknadno provesti jedan istražitelj (WG). Intenzitet bojenja je kategoriziran kao 0 (nema), 1 (slabo), 2 (umjerena) i 3 (jaka). Postotak pozitivno obojenih stanica je ocijenjen kao 0 (0% pozitivnih), 1 (1-30%), 2 (31 - 60%) i 3 (> 60%). Kombinirani ocjenjivanja bojenja intenziteta i produžetak je korištena za evaluaciju ekspresije GCRG213p. Najmanja ocjena kada zbrajaju (intenzitet + produžetak) bio je 0, a maksimalna je 6 [25]. Ukupni rezultat od ≥2 se smatra GCRG213p pozitivan. Pregled, analiza Western blot pregled rak želuca staničnim linijama, uključujući SGC-7901, BGC-823 i ljudskog normalnog želučani epitel besmrtnim linijskim stanicama GES-1 kultivirane su, skupljene i lizirane s RIPA pufera na ledu i zatim se podvrgne Western blot analizi. Koncentracija proteina je otkriven pomoću Bradford metodom s BSA (Sigma-Aldrich) kao standarda. Jednake količine ekstrakta stanica (40 ug) su podvrgnuti 8% SDS-PAGE i prenesen je u polivinilidenfluorid membranu (Bio-Rad) na blotting antitijela. Membrana je potom blokira inkubira s mišjim anti-GCRG213p protutijelom (1: 500) tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi, zatim se inkubira sa peroksidaza-konjugiranog sekundarnog antitijela za 1 sat na sobnoj temperaturi. Signal je vidljivo s poboljšanom reagens za otkrivanje chemiluminescence. Anti-β-aktin antitijelo miša (1: 5000, Sigma), otkrivena je istovremeno kao kontrola doziranja pregled Detekcija metilacije stanja linija 1 sa MSP pregled validaciju stanja LINIJA 1 metilacije izvodi se koristeći metilacije specifičan PCR (MSP). Ukupna DNA sGC 7901, BGC-823, MGC803 i GES-1 stanice se ekstrahira u skladu s uputama za ekstrakciju DNA kompleta. DNA je bila bisulfit promjene kao što je opisano [26] 16 sati na 50 ° C. Bisulfit preveden je DNA PCR-amplificirani koristeći Taq polimeraze (Invitrogen, USA). Početnice korištene su [27]: pregled Linea: nemetiliran LINE-1 naprijed primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT, pregled LINEb: nemetiliran LINE-1 obrnuti primer, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA, pregled LINEc: metilirani LINE-1 naprijed primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
poredani: metiliranog line-1 zadnji primer, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG pregled uvjeti umnožavanja PCR bili su:. 4 ° C, 5 minuta; 94 ° C, 30-ih, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61s, 40 ciklusa; 72 ° C, 10 min. Rezultirajući PCR produkti su vizualizirani na agaroznom gelu 2%. korišteni su metilirani DNA Norme Zymo istraživanja kao pozitivna kontrola, dvostruko destilirane vode kao negativna kontrola pregled sličnosti u slijedu i konzervirani traženje domena pregled, PSI-BLAST je korišten u NCBI Blast server [28] (pretraživanje po datumu:. 20 siječnja 2012.) identificirati GCRG213p slijed na bilo poravnanja u protein Data Bank baze podataka, uključujući sve nisu suvišni GenBank CDS prijevoda, PDB, SwissProt, PIR i PRF. To je izvedena sa standardnim početno istraživanje BLASTP.
Statistička analiza
hi-kvadrat test ili Fisherov egzaktni vjerojatnost je upotrijebljen za procjenu odnosa između izraza GCRG213p i kliničkopatološkim varijabli. Sveukupno preživljenje je pregledao GCRG213p izrazom Kaplan-Meier krivulje. Sve p vrijednosti bile su dvostrani i smatra statistički značajna ako je p < 0.05. Statistička analiza provedena je pomoću SPSS 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).

• Konzumacija alkohola i rizik od raka želuca: kohorta studija muškaraca u Kaunas, Litva, s do 30 godina praćenja up
• Indukcija kromosoma nestabilnosti i raka želuca mijenjanjem ekspresije mitotičkih kontrolnim gena kod miševa izloženih Areca-nut