Expressão de uma variante LINE-1 endonuclease no câncer gástrico: a sua associação com os parâmetros clínico

Expressão de uma variante endonuclease LINE-1 em cancro gástrico: a sua associação com os parâmetros clínico da arte abstracta
Fundo Quanto tempo intercaladas element-1 nuclear (LINE-1 ou L1), o mais abundante e única família autonomamente ativa de retrotransposões não-LTR no genoma humano, expressa não apenas nas linhas germinativas, mas também nos tecidos somáticos. Ele contribui para a instabilidade genética, envelhecimento e doenças relacionadas à idade, como o câncer. O nosso estudo anterior identificados no adenocarcinoma gástrico humano um GCRG213 transcrição regulada positivamente, a qual compartilhada 88% de homologia com a sequência de L1 humana e continha um domínio endonucleas1 apurínico /apirimidinico conservada putativo.
Métodos
A imuno-histoquímica foi levada a cabo usando um monoclonal de ratinho anti anticorpo -sangue humano proteína GCRG213 (GCRG213p) produzido no nosso laboratório, em tissue microarray construída com amostras de 175 pacientes de adenocarcinoma gástrico. Foi avaliada a correlação entre a expressão GCRG213p e os parâmetros clínico do paciente. expressão GCRG213p em linhas celulares de cancro gástrico foram estudados por meio de análise Western blot. L1 estado de metilação do promotor de células de cancro gástrico foi testado utilizando PCR específicos de metilação. BLASTP foi usado no servidor Explosão NCBI para identificar sequência GCRG213p a quaisquer alinhamentos na proteína bancos de dados do Banco de Dados.
Resultados
maioria câncer gástrico primário, metástases linfáticas e glândulas metaplasia intestinal gástrica mostrou imuno GCRG213p positivo. Alta GCRG213p imunocoloração pontuação no câncer gástrico primário foi positivamente correlacionada com a diferenciação do tumor (bem diferenciado, p = 0,001), a classificação de Lauren (tipo intestinal, p < 0,05) e um início idade tardia de adenocarcinoma gástrico (≥65 anos; p < 0,05). expressão GCRG213p não tem nenhuma associação com outros parâmetros clínico, incluindo a sobrevivência. análise de transferência de Western de expressão GCRG213p em células de cancro gástrico indicou que GCRG213p nível foi superior em linhas celulares de cancro gástrico do que em linha normal humana imortalizada epitélio gástrico célula GES-1. metilação parcial de L1 em ​​células de cancro gástrico foi confirmada por PCR específicos de metilação. análise programa BLASTP revelou que o péptido GCRG213p partilhada% 83,0 alinhamento com a região C-terminal de L1 de endonuclease (L1-PT). GCRG213p possui a sequência de resíduos importantes que compõem as características conservadas da L1-PT.
Conclusões
GCRG213p pode ser uma variante de L1-PT, um membro funcional da família de L1-PT. Superexpressão de GCRG213p é comum em ambos câncer e metástase ganglionar gástrico primário. Estes resultados fornecem evidências de expressão L1 somáticas no cancro gástrico, e as suas consequências potenciais na forma de tumor.
Palavras-chave
gástrica carcinoma longo intercaladas nuclear element-1 endonuclease proteína GCRG213 Tissue microarray fundo Quanto tempo intercaladas elemento nuclear -1 (LINHA-1 ou L1) é a família mais abundante e apenas autonomamente activa de retrotransposões não-LTR no genoma humano e compreende cerca de 17% do genoma humano [1]. A grande maioria dos cerca de 500.000 cópias totais de L1 no genoma humano não são capazes de transposição no seu próprio devido a diferentes mecanismos como truncamentos e mutações de inactivação. No entanto, um número estimado de 80-100 de comprimento total L1 retrotransposição competentes (RC-L1) estão presentes numa típica genoma humano diplóide, e um pequeno número, denominado "L1 quente" exibem altas eficiências de retrotransposição [2].
Humana RC-L1 são cerca de 6,5 kb e codificam duas proteínas (ORF1p e ORF2p) necessários para retrotransposição [3]. ORF1p é uma proteína de 40 kDa com a ligação de ARN [4] e actividades chaperonas ácido nucleico [5]. ORF2p é uma proteína de 150 kDa com a endonuclease (L1-PT) [6] e transcriptase reversa (RT-L1) [7] actividades. elemento de L1 pode integrar-se várias centenas de milhares de locais genómicos, a um local de consenso de vagamente definida (5'-TTTT /AA-3 '), o qual é cortado por L1-PT [8]. O hospedeiro limita a propagação de tais elementos através de mecanismos de silenciamento transcricional e pós-transcricional que reduzem a actividade a níveis toleráveis ​​[9].
L1 expressa não apenas nas linhas germinativas, mas também nos tecidos somáticos. Sugere-se que mesmo baixos níveis de danos no DNA somática devido à atividade L1 têm o potencial de contribuir para a instabilidade genética, envelhecimento e doenças relacionadas à idade, como câncer [10, 11]. L1-ORF1 e ORF2 foram regulados positivamente em uma variedade de doenças malignas, como câncer de mama, câncer de pâncreas e tumores de células germinativas malignos, etc. [12-14]. L1 hipometilação foi observada em uma variedade de doenças malignas como o cabeça e pescoço, esôfago e estômago, e em lesões pré-malignas [15, 16]. O grau de L1 hipometilação também foi associado a uma fase mais avançada e pior prognóstico [17, 18].
Influência induzida L1 a células não é provável limitada apenas aos elementos totalmente ativas. Mesmo os elementos L1 com regiões de codificação ORF1 defeituosos pode fazer um ARN que emendas para expressar um ORF2 funcional com um número de consequências negativas para a célula [19]. Muitos tecidos produzir transcrição traduzível ORF2 emendado (SpORF2) [20]. Um transcrito de L1 spliced ​​que inclui sequências de transcriptase reversa integrante da ORF2, verificou-se ser essencial para a proliferação de células de hepatoma humano [21].
O nosso estudo anterior [22] identificou uma transcrição regulada positivamente, o chamado gene relacionada com o cancro gástrico 213 (GCRG213) , no adenocarcinoma gástrico humano. análise BLAST de sequência GCRG213 indicou 88% de homologia com LI humana e revelou um domínio conservado putativa, apurínico /apirimidínico endonucleas1 (APE), em GCRG213-ORF. Nossa mais recente pesquisa do banco de dados GenBank atualizada mostra GCRG213-ORF contém uma L1-PT conservada domínio. Este artigo relata o nosso presente estudo que confirmou a expressão da proteína GCRG213 (GCRG213p) em linhas celulares de cancro gástrico, utilizando anticorpos anti-GCRG213p monoclonal produzido em nosso laboratório (Instituto de Geriatria, China PLA General Hospital, Beijing, China). Adicionalmente, imuno-histoquímica (IHC) aplicado sobre tissue microarray (TMA) foi usada para avaliar a expressão GCRG213p no cancro gástrico e mucosa gástrica normal. Outras análises foram realizadas para ver se há alguma correlação entre a expressão GCRG213p e os parâmetros clínico e sobrevivência.
Métodos
Pacientes
Pacientes submetidos à gastrectomia por câncer gástrico em PLA General Hospital, Beijing, China 1991-2003 foram considerados como candidatos para este estudo. Os critérios de amostragem foram os seguintes: sexo (masculino ou feminino), idade (20 anos ou mais); recém-diagnosticados (incidente) carcinoma gástrico sem tratamento prévio; diagnóstico confirmado histologicamente; parafina tumor incorporado, emparelhado circundante não tumorais tecidos da mucosa gástrica disponíveis, com carcinomas metastáticos para linfonodo se possível; e os resultados de acompanhamento positivos no momento da construção TMA. Como resultado, 175 casos foram recrutados neste estudo, compreendendo 144 homens e 31 mulheres (27 ~ 84 anos, com média = 58,58 anos). Entre eles, sessenta e sete casos têm carcinomas acompanhado com metástase ganglionar, e seis casos de-fixados em formalina, tecidos gástricos normais embebidos em parafina, também foram obtidas de pacientes não-tumorais que foram operados por causa de doenças gástricas benignas.
Demográfico , estilo de vida e os dados clínico-patológicos para os casos da amostra foram apresentados na Tabela 1. Todos os tumores foram classificados e encenado de acordo com as orientações revistas defendida pela União Internacional contra o Câncer. O acompanhamento foi feito para avaliar as suas últimas condições em 2005 por consultar os seus documentos de casos ou através de telefonemas para pacientes (ou seus familiares ou médicos de família). Um intervalo mínimo de 18 meses foi adotado, eo tempo médio de follow-up para os pacientes que ainda estavam vivos até o final de 2005 foi de 46 meses (o intervalo foi a partir do mínimo de 18 a no máximo 129 meses). O tempo de sobrevida foi calculado a partir da data da cirurgia para a data da morte ou a data do último conhecido alive.Table 1 parâmetros clínico de pacientes com câncer gástrico estudado em tissue microarray
N (%)
GCRG213p negativo
GCRG213p valor positivo P
Sexo Masculino

144 (82,28%)
31
113
0,111
fêmea
31 (17,72%)
11
20
Age Art < 65 ano
104 (59,43%)
31
73
0,029
≥65 ano
71 (40,57%)
11
60
fumar
Sim
45 (27,27%)
7
38
0,278
No
120 (72,73%)
30
90
Beber
Sim
28 (16,97%)
2
26
0,060
Sem
137 (83,03%)
35
102 história
Família de tumor
Sim
14 (8,43%)
2
12
0,639
No
152 (91,57%)
36
116
localização do tumor
Cardiac
48 (27,43%)
8
40
0,360
corpo
37 (21,14%)
10
27
Antrum
90 (51,43%)
24
66
tamanho do tumor (cm)
≤1
11 (6,29%) Sims 3
8
0,506
1-3
42 (24,00%)
13
29 Restaurant > 3
122 (69,71%)
26
96
profundidade de invasão
T1
46 (26,28%)
12
34
0,635
T2
21 (12,00%)
7
14
T3
33 (18,86%)
6
27
T4
75 (42,86%)
17
58
linfonodal
Sim
75 (42,86%)
16
59
0,592
Sem
100 (57,14%)
26
74
grau de diferenciação do tumor
Bem
10 (5,71%)
0
10
0,001
Moderado
40 (22,86%)
4
36
Pobre
103 (58,86%)
27
76
células em anel de sinete
22 (12,57%)
11
11
estágio do tumor (TNM)
0
21 (12,00%)
3
18
0,217
Ia
14 (8,00%)
6
8
Ib
41 (23,43%)
10
31
II
60 (34,29%)
17
43
IIIa
39 (22,28% )
6
33
classificação de Lauren
tipo intestinal
153 (87,43%)
31
122
0,015
difusa tipo
22 (12,57 %)
11
11 margem
ressecção
Presença
6 (3,43%)
0
6
0,361
Ausência
169 (96.57% )
42
127
microvascular invasão
Presença
20 (11,43%)
5
15
0,911
Ausência
155 (88,57%)
37
118
Estado
vivo
121 (71,18%)
30
91
0,483
mortos
49 (28,82%)
9
40
5 anos de sobrevida Art < 5 anos
47 (43,93%)
12
48
0,871 Art > = 5 anos
60 (50,07%)
10
37
A permissão foi dada pela comissão de ética do Hospital Geral PLA, Beijing, China para usar o tecido e os dados para este projeto. O consentimento informado foi também obtido a partir dos pacientes.
construção Tissue microarrays, coloração imuno-histoquímica e análise GCRG213p
As micromatrizes de tecidos (TMAs) foram construídos como descrito previamente [23]. A partir das amostras disponíveis, foram preparadas seis blocos de matriz de tecido, cada um contendo 30 casos com tumor, tecidos normais e linfáticos nó se disponível.
Recuperação Antigen de lâminas TMA, e, cortes de tecido embebidos em parafina fixadas em formalina foram realizados por pressão fogão tratamento durante 10 minutos numa solução de recuperação de antigénio (/L de tampão citrato de sódio 10 mmol, pH 6,0). anticorpo anti GCRG213p humana monoclonal de rato, que foi produzido no nosso laboratório [24], foi adicionado numa diluição de 1: 200 e incubou-se durante 2 horas à temperatura ambiente. As lâminas foram então incubadas durante 1 h em anticorpo secundário. Um kit EnVision (Dako, Carpinteria, CA, EUA) foi usada para visualizar a ligação do anticorpo, e as lâminas foram subsequentemente contrastadas com hematoxilina. A PBS-única amostra de coloração foi utilizado como um controlo de fundo.
Imunocoloração amarelo-castanho específico para GCRG213p foi localizado exclusivamente no citoplasma. Ele foi marcado de forma independente e de forma cega por dois investigadores (GJ e XL). As discordâncias entre observadores (cerca de 6% do total de casos) foram revistos por uma segunda vez, seguido por um julgamento conclusivo por ambos os observadores. pontuação formal foi posteriormente realizada por um investigador (WG). A intensidade da coloração foi classificada como 0 (ausente), 1 (fraca), 2 (moderada), e 3 (forte). A percentagem de células coradas positivamente foi pontuada como 0 (0% positivo), 1 (1-30%), 2 (31-60%), e 3 (> 60%). Combinado a avaliação da intensidade da coloração e extensão foi utilizado para avaliar a expressão GCRG213p. A pontuação mínima quando somados (intensidade + extensão) foi de 0, eo máximo foi de 6 [25]. GCRG213p pontuação global de ≥2 foi considerado positivo.
Análise Western blot
linhas celulares de cancro gástrico, incluindo SGC-7901, BGC-823 e a linha celular humana normal epitélio gástrico imortalizado GES-1 foram cultivadas, colhidas e lisadas com o tampão RIPA em gelo antes de ser submetido a análise de transferência de Western. A concentração de proteína foi detectada pelo método de Bradford com BSA (Sigma-Aldrich) como padrão. Quantidades iguais de extracto de células (40 ^ g) foram submetidas a 8% de SDS-PAGE e transferidos para membrana de difluoreto de polivinilideno (Bio-Rad) para blotting anticorpo. A membrana foi então bloqueada, incubada com anticorpo de ratinho anti-GCRG213p (1: 500) durante 2 horas à temperatura ambiente, seguido por incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente. O sinal foi visualizado com um reagente de detecção de quimioluminescência aumentada. O anticorpo-β-actina anti-rato (1: 5000, Sigma). Foi detectada simultaneamente como um controlo de carga
Detecção do estado de metilação de LINHA-1 com MSP
Validação do estado da linha 1-metilação foi levada a cabo usando metilação específicas de PCR (MSP). O ADN total da SGC-7901, BGC-823, e MGC803 GES-1 células foi extraído de acordo com as instruções do kit de extracção de ADN. O DNA foi modificado com bissulfito como descrito anteriormente [26] durante 16 h a 50 ° C. ADN-bissulfito convertido foi amplificado por PCR usando a polimerase Taq (Invitrogen, EUA). Iniciadores utilizados foram [27]:
Linea: não metilado-1 LINHA forward primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: não metilado LINE-1 iniciador inverso, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
LINEc: metilado LINE-1 forward primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
forrado: metilado lINE-1 iniciador inverso, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
condições de amplificação de PCR foram:. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30 s, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61s, 40 ciclos; 72 ° C, 10 min. Os produtos de PCR resultantes foram visualizados num gel de agarose a 2%. Metilados Padrões de DNA de Zymo Research foram utilizados como controle positivo, água bidestilada como controle negativo
similaridade de sequência e conservada pesquisa de domínio
PSI-explosão foi usado no servidor NCBI explosão [28] (data de pesquisa:. 20 de janeiro de 2012) para identificar sequência GCRG213p a quaisquer alinhamentos na proteína bancos de dados banco de dados, incluindo todos os não-redundantes GenBank CDS traduções, PDB, SwissProt, PIR e PRF. Foi realizado com uma pesquisa BLASTP inicial padrão.
Análise estatística
teste do qui-quadrado ou probabilidade exato de Fisher foi utilizado para avaliar a relação entre a expressão GCRG213p e variáveis ​​clínico-patológicas. A sobrevivência global foi examinada por expressão GCRG213p com curvas de Kaplan-Meier. Todos os valores de p foram dois lados e considerados estatisticamente significativos se p < 0,05. A análise estatística foi realizada usando SPSS 13.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultados padrões de expressão GCRG213p na mucosa gástrica normal e adenocarcinoma gástrico
coloração GCRG213p distinta foi observada em adenocarcinomas gástricos primários, linfa metástases de tumores, e na mucosa gástrica não tumoral (Figura 1). Na mucosa gástrica não-tumoral de junção esopheageal-gástrica e região do antro, o citoplasma do epitélio superficial diferenciada e glândulas mucosas mostraram coloração negativa, mas a coloração GCRG213p positiva foi observada na membrana basal das glândulas normais. 133 de 175 adenocarcinomas gástricos primários, e 51 de 67 tumores metastáticos para o nó de linfa mostrou imuno GCRG213p positivo, que foi localizado no citoplasma das células de carcinoma. Figura expressão 1 GCRG213p na mucosa gástrica malignas e não malignas humana. Ambos (A) adenocarcinoma gástrico primário (100 ×) e adenocarcinoma (B) invadiram no linfonodo (100 ×) mostrou GCRG213p positiva stainging no citoplasma; (A ') e (B') demonstrou a maior ampliação (400 ×) a partir da área em (A) e (B). (C) no epitélio gástrico não-maligno, coloração positiva foi observada na membrana basal, mas não no citoplasma; GCRG213p imunorreactividade foi detectada no citoplasma de glândulas gástricas metaplasia intestinal (seta) (100 x); . (C ') demonstrou a maior ampliação (400 ×) a partir da área em (C)
De acordo com a classificação de Lauren, cancro gástrico é dividido em dois tipos histológicos: tipo intestinal ou difundir-tipo. Temos 153 casos do tipo intestinal e 22 casos difusa-tye neste estudo. Entre os 153 casos do tipo intestinal, 34 metaplasia intestinal e 28 amostras de neoplasia intra-epitelial adjecent a foram identificados o câncer. A idade (anos, média ± SD) do grupo de tipo intestinal com metaplasia intestinal (59,67 ± 12,30) era mais velho do que o grupo do tipo difuso (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 de 34 metaplasia intestinal, e 27 de 28 de baixa /alta neoplasia intra-epitelial de grau mostrou GCRG213p imunorreactividade. A maioria dos casos positivos mostraram leve a coloração moderada (Tabela 2) .table expressão 2 GCRG213 em amostras de tecido gástrico
Grupos
Número
expressão GCRG213
Pontuação geral ‡
PR§ (%)
0-1
2-3
4-5

6
epitélio gástrico não-tumoral
112
112
0
0
0
0.00
intestinal metaplasia
34
3
18
11 Página 2
91,18 *
de Baixa /neoplasia intraepitelial de alto grau
28
1

• O consumo de álcool eo risco de câncer gástrico: um estudo de coorte de homens em Kaunas, na Lituânia, com até 30 anos de follow-up
• Indução de instabilidade cromossômica e câncer de estômago, alterando o padrão de expressão de genes checkpoint mitótico em camundongos expostos à indução areca-nut