Expression of LINE-1-endonukleaasi variantti mahasyövän: sen yhdessä kliinis parameters

ilmentymisen LINE-1-endonukleaasi variantti mahasyövän: sen yhdessä kliinis parametrien
tiivistelmä
tausta
Long lomassa ydin- elementti- 1 (LINE-1 tai L1), runsain ja ainoastaan ​​itsenäisesti aktiivinen perheen ei-LTR retrotransposoneja ihmisen perimässä, ilmaistuna paitsi ituratoihin vaan myös somaattisissa kudoksissa. Se edistää geneettinen epävakaus, ikääntyminen ja ikääntymiseen liittyvät sairaudet, kuten syöpä. Meidän edellisessä tutkimuksessa tunnistettu ihmisen mahalaukun adenokarsinooman ilmen- tymisen lisääntymisen transkripti GCRG213, joka jakoi 88% homologia ihmisen L1-sekvenssin ja sisälsi oletetun säilyneitä apurinic /apyrimidinic endonucleas1 domain. Tool Menetelmät
immunohistokemia suoritettiin käyttäen monoklonaalista hiiren anti -ihmisen GCRG213 proteiini (GCRG213p) tuotettujen vasta laboratoriossamme, kudosten microarray rakennettu yksilöitä 175 mahalaukun adenokarsinoomaa potilaille. Korrelaatio GCRG213p ilmaisun ja potilaan kliinispatologiset parametrit arvioitiin. GCRG213p ilmentyminen mahasyövässä solulinjoissa tutkittiin käyttäen Western blotting-analyysi. L1-promoottori metylaatiostatuksen mahalaukun syövän solujen testattiin metylaatiospesifinen PCR. BLASTP käytettiin NCBI Blast palvelin tunnistaa GCRG213p sekvenssin tahansa linjauksia Protein Data Bank tietokantoja.
Tulokset
Useimmat ensisijainen mahasyövän, imusolmukemetastaaseja ja mahalaukun suoliston metaplasia rauhaset positiivisesti GCRG213p immunoreaktiivisuutta. Korkea GCRG213p immunovärjäyty- pisteet ensisijaisen mahasyövän korreloi positiivisesti kasvaimen erilaistumiseen (no eriytetty, p = 0,001), Lauren luokittelu (suoliston tyyppi, p < 0,05) ja myöhäinen ikä puhkeamista mahalaukun adenokarsinooman (≥65 v; p <0,05). GCRG213p ilmaisu ei ole yhdessä muiden kliinis parametrit, mukaan lukien selviytyminen. Western blotting-analyysi GCRG213p ilmentymisen mahasyövässä soluissa osoitti että GCRG213p taso oli korkeampi mahasyövän solulinjoissa kuin ihmisen normaali mahan epiteelin kuolemattomaksi solulinja GES-1. Osittainen metylaatio L1 mahasyövän soluissa varmistettiin metylaatiospesifistä PCR. BLASTP-ohjelma-analyysi paljasti, että GCRG213p peptidi jaettu 83,0% linjassa C-terminaalisen alueen L1 endonukleaasi (L1-EN). GCRG213p sekvenssi hallussaan tärkeitä jäämiä, jotka muodostavat konservoituneen ominaisuudet L1-EN.
Johtopäätökset
GCRG213p voisi olla variantti L1-EN, toiminnallinen jäsen L1-EN perhe. Yliekspressio GCRG213p on yhteinen sekä ensimmäisen mahasyövän ja imusolmuke etäpesäke. Että tulokset osoittivat somaattisten L1 ilmaisun mahasyövän, ja sen mahdollisia vaikutuksia muodossa kasvain.
Avainsanat
mahakarsinoo- Long välissä ydin- elementti-1-endonukleaasi GCRG213 proteiinia Tissue mikrosirujen Background
Long lomassa ydin- elementti -1 (LINE-1 tai L1) on runsain ja ainoastaan ​​itsenäisesti aktiivinen perheen ei-LTR retrotransposoneja ihmisen perimän ja käsittää noin 17% ihmisen genomin [1]. Valtaosa noin 500.000 kappaletta yhteensä L1 ihmisen perimässä eivät kykene osaksi omasta takia erilaisia ​​mekanismeja, kuten katkaisut ja inaktivoivat mutaatiot. Kuitenkin arviolta 80-100 täyspitkä, retrotranspositiossa toimivaltainen L1s (RC-L1s) ovat läsnä tyypillisessä diploidinen ihmisen perimässä, ja pieni määrä, kutsutaan "hot L1s" osoittavat suurta retrotranspositiossa hyötysuhde [2].
Human RC-L1s on noin 6,5 kb ja koodata kaksi proteiinia (ORF1p ja ORF2p) tarvitaan retrotranspositioon [3]. ORF1p on 40 kDa proteiini, RNA sitovan [4] ja nukleiinihapon kaperoni- toimintaa [5]. ORF2p on 150 kDa: n proteiinin endonukleaasilla (L1-EN) [6] ja käänteistranskriptaasia (L1-RT) [7] toimintaa. L1 elementti voi integroitua satoja tuhansia genomista paikoissa kello löyhästi määritellyn konsensus site (5'-TTTT /AA-3 '), joka on pilkottu sisäisesti L1-EN [8]. Isäntä rajoittaa leviäminen tällaisten elementtien transkription ja transkription jälkeisen hiljentäminen mekanismeja, jotka vähentävät aktiivisuutta siedettävän tason [9].
L1 ilmaistuna paitsi ituratoihin vaan myös somaattisissa kudoksissa. On ehdotettu, että jopa vähäinen somaattisen DNA aiheuttamia vaurioita L1 toimintaa on potentiaalia edistää geneettinen epävakaus, ikääntyminen ja ikääntymiseen liittyvät sairaudet, kuten syöpä [10, 11]. L1-ORF1 ja ORF2 ilmentyivät erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, kuten rintasyövän, haimasyövän ja pahanlaatuisten itusolukasvaimet jne [12-14]. L1 hypometylaatio havaittiin erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, kuten pään ja kaulan, ruokatorven ja mahasyöpä, ja syöpää edeltävät vauriot [15, 16]. Aste L1 hypometylaatio liittyi myös pitemmälle ja huonompi ennuste [17, 18].
L1 aiheuttama vaikutus soluihin ei todennäköisesti rajoittaa vain täysin aktiivisia elementtejä. Vaikka L1 elementtien puutteellinen ORF1 koodaavat alueet voisi tehdä RNA joka jatkosten ilmaista toimiva ORF2 useita kielteisiä vaikutuksia solujen [19]. Monet kudokset tuottavat käännettävissä saumattu ORF2 (SpORF2) transkriptio [20]. Silmukoitua L1 transkripti, joka sisältää integrantti- käänteiskopioijaentsyymin sekvenssi ORF2, havaittiin olevan olennainen ihmisten hepatoomasolulinjaa lisääntymistä [21].
Aiempi tutkimus [22] havainnut ilmen- tymisen lisääntymisen transkriptio, nimeltään mahasyövän liittyvä geeni 213 (GCRG213) , ihmisen mahalaukun adenokarsinoomaa. BLAST-analyysi GCRG213 osoittamassa järjestyksessä 88% homologia ihmisen LI ja paljasti otaksuttu konservoitunut verkkotunnuksen, apurinic /apyrimidinic endonucleas1 (APE), in GCRG213-ORF. Uusin etsimään päivitetyn GenBanktietopankista osoittaa GCRG213-ORF sisältää L1-EN konservoitunut domeeni. Seuraavassa käsitellään tämänhetkisiin tutkimus, joka on vahvistanut GCRG213 proteiini (GCRG213p) ilmentyminen mahasyövän solulinjoissa käyttämällä monoklonaalisia hiiren anti-GCRG213p tuotettujen vasta laboratoriossamme (Geriatric instituutti, Kiina PLA General Hospital, Peking, Kiina). Lisäksi, immunohistokemia (IHC) kohdistetaan kudokseen microarray (TMA) käytettiin arvioimaan GCRG213p ilmentymistä mahasyövän ja normaalin mahan limakalvon. Lisäksi analyysit tehtiin nähdä, jos on olemassa jokin korrelaatio GCRG213p ilmaisun ja kliinis parametrit ja selviytymistä. Tool Menetelmät
Potilaat
Potilaat, joille tehtiin gastrectomy mahalaukun syövän PLA General Hospital, Peking, Kiina 1991-2003 pidettiin ehdokkaita tähän tutkimukseen. Näytteenotto kriteerit olivat seuraavat: sukupuoli (uroksen tai naaraan), ikä (20 vuotta tai vanhempi); vastadiagnosoidun (tapaus) mahakarsinoo- ilman esikäsittelyä; diagnoosi histologisesti varmistettu; parafiiniin kasvain, pariksi ympäröivän ei-kasvaimen mahalaukun limakalvon kudoksissa saatavilla, karsinoomat metastaattinen on imusolmuke, jos mahdollista; ja positiivinen seurannan tulokset aikaan TMA rakentamisen. Tämän seurauksena 175 tapausta rekrytoitiin tässä tutkimuksessa, joka käsittää 144 miestä ja 31 naista (27 ~ 84 vuotta, keskimääräinen = 58,58 vuotta). Joukossa kuusikymmentä seitsemän tapausta on karsinoomien mukana imusolmuke etäpesäke, ja kuusi tapausta formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut normaali mahan kudoksissa saatiin myös ei-kasvain potilailla, jotka leikattiin koska hyvänlaatuinen mahasairauksia.
Väestörakenteen , elämäntapa ja kliinis tietoja näytteestä tapauksia on esitetty taulukossa 1. Kaikki kasvaimet luokiteltiin ja lavastettuja mukaan tarkistetut ohjeet ajama International Union syöpää vastaan. Seurannan tehtiin arvioimaan heidän uusimman olosuhteet vuonna 2005 kuulemalla asiansa asiakirjoja tai puheluita potilaille (tai heidän perheenjäsenensä, tai perheen harjoittajat). Minimaalinen välein 18 kuukauden hyväksyttiin, ja mediaani seuranta-ajan potilaille, jotka olivat yhä elossa loppuun mennessä 2005 oli 46 kk (vaihteluväli oli minimistä 18 suurinta 129 kuukautta). Elinaika laskettiin alkaen leikkaus kuolinpäivästä tai päivästä viimeinen tunnettu alive.Table 1 kliinis parametrit mahasyövän tutkittujen potilaiden kudosten microarray
N (%)
GCRG213p negatiivinen
GCRG213p positiivinen
P arvo
Sukupuoli
Mies
144 (82,28%)
31
113
0,111
Nainen
31 (17,72%)
11
20
Age
< 65 vuotta
104 (59,43%)
31
73
0,029
≥65 vuotta
71 (40.57%)
11
60
Tupakointi
Kyllä
45 (27.27%) B 7
38
0,278
Ei
120 (72,73%)
30
90
Drinking
Kyllä
28 (16.97%)
2
26
0,060
ei
137 (83,03%)
35
102
Suvussa kasvaimen
Kyllä
14 (8,43%)
2
12
0,639
Ei
152 (91,57%)
36
116
Kasvain sijainti
Sydän
48 (27.43%)
8
40
0,360
Body
37 (21,14%) B 10
27
antrum
90 (51.43%)
24
66
Tuumorin koko (cm) B ≤1
11 (6,29%) B 3
8
0,506
1-3
42 (24.00%)
13
29
> 3
122 (69.71%)
26
96
syvyys invaasion
T1
46 (26.28%)
12
34
0,635
T2
21 (12,00%) B 7
14
T3
33 (18,86%) B 6
27
T4
75 (42.86%)
17
58
Imusolmukeoireiden yhteydessä
Kyllä
75 (42.86%)
16
59
0,592
Ei
100 (57,14%)
26
74
Grade kasvaimen erilaistumiseen
Well
10 (5,71%)
0
10
0,001
Kohtalainen
40 (22,86%) B 4
36
Poor
103 (58.86%)
27
76
sinettisormus solu
22 (12.57%)
11
11
Kasvaimen vaihe (TNM) B 0
21 (12,00%)
3
18
0,217
Ia
14 (8,00%) B 6
8
Ib
41 (23,43%) B 10
31
II
60 (34,29%)
17
43
IIIa
39 (22.28% )
6
33
Lauren luokittelun
Suoliston tyyppi
153 (87,43%)
31
122
0,015
Diffuusi tyyppi
22 (12.57 %)
11
11
Kaarileikkaus marginaali
Presence
6 (3,43%)
0
6
0,361
Absence
169 (96,57% )
42
127
mikrovaskulaarisia invaasio
Presence
20 (11,43%) B 5
15
0,911
Absence
155 (88,57%)
37
118
status
elossa
121 (71,18%)
30
91
0,483
kuollut
49 (28.82%)
9
40
5 vuoden pysyvyys
< 5 v
47 (43.93%)
12
48
0,871
> = 5 v
60 (50.07%) B 10
37
lupa antoivat eettisen komitean PLA General Hospital, Peking, Kiina käyttää kudosten ja tiedot tämän projektin. Tietoinen suostumus saatiin myös potilaille.
Tissue microarray rakentaminen, GCRG213p immunohistokemiallisella värjäyksellä ja arviointi
kudossiruina (TMA) muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. Näytteistä käytettävissä, kuusi kudoksen array lohkot valmistettiin, joista jokainen sisältää 30 tapauksissa, joissa kasvain, normaali ja imusolmukkeiden kudoksissa, jos käytettävissä.
Antigeenin hakua on TMA dioja, ja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudosleikkeiden suoritettiin paineen liesi hoito 10 min antigeenin hakea liuosta (10 mmol /l natriumsitraattia, pH 6,0). Monoklonaalinen hiiren anti-ihmis GCRG213p vasta-aine, joka on tuotettu laboratoriossamme [24], lisättiin laimennuksella 1: 200 ja inkuboidaan 2 h huoneenlämpötilassa. Levyjä inkuboitiin sitten 1 h sekundäärinen vasta-aine. EnVision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) käytettiin visualisoimaan vasta-aineen sitoutuminen, ja dioja myöhemmin vastavärjät- hematoksyliinillä. PBS-vasta värjäys näytettä käytettiin tausta-ohjaus.
Erityiset kelta-ruskea immuunivärjäykseen GCRG213p on yksinomaan sijaitsee sytoplasmassa. Se pisteytettiin itsenäisesti ja pidennetyn tavalla kaksi tutkijaa (GJ ja XL). Välinen tarkkailija erimielisyyksiä (noin 6% kaikista tapauksista) tarkistettiin toisen kerran, jonka jälkeen ratkaiseva tuomio molemmat tarkkailijat. Muodollinen pisteytys tehtiin näistä yksi tutkija (WG). Värjäytymisintensiteettiä luokiteltiin 0 (poissa), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) ja 3 (voimakas). Prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen pisteytettiin 0 (0% positiivinen), 1 (1-30%), 2 (31-60%), ja 3 (> 60%). Yhdistetty arvioitaessa värjäytymisen intensiteettiä ja laajennus käytettiin arvioimaan GCRG213p ilme. Pisterajat kun lasketaan yhteen (voimakkuus + extension) on 0, ja suurin oli 6 [25]. Yleisarvosanaksi ≥2 katsottiin GCRG213p positiivinen.
Western blotting-analyysi
Mahasyöpää solulinjojen SGC-7901, BGC-823 ja ihmisen normaali mahan epiteelin kuolemattomaksi solulinja GES-1 viljeltiin, kerättiin ja lyysattiin kanssa RIPA puskuria jäällä ennen kuin sille Western blotting-analyysi. Proteiinipitoisuus havaittiin Bradfordin menetelmällä, jossa BSA: ta (Sigma-Aldrich), kuten standardin. Yhtä suuret määrät solu-uutetta (40 ug) altistettiin 8% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvolle (Bio-Rad) vasta-blottauksella. Membraani blokattiin sitten, inkuboitiin hiiren anti-GCRG213p-vasta-ainetta (1: 500) ja 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, jonka jälkeen inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Signaali visualisoitiin parannetun kemiluminesenssidetektiolla reagenssia. Hiiren anti-β-aktiini-vasta-ainetta (1: 5000, Sigma) havaittiin samanaikaisesti latauskontrollina.
Havaitseminen metylaatiostatuksen LINE-1 MSP
validointi LINE-1 metylaatiostatuksen suoritettiin käyttäen metylaatiospesifinen PCR (MSP). Kokonais-DNA: SGC-7901, BGC-823, MGC803 ja GES-1-soluja uutettiin ohjeiden mukaisesti ja DNA: n eristämiseksi kit. DNA oli bisulfiitti modifioitu kuten aiemmin on kuvattu [26] 16 tunnin ajan 50 ° C: ssa. Bisulfiitti-muunnetaan DNA PCR-monistettiin käyttämällä Taq-polymeraasia (Invitrogen, USA). Käytetyt alukkeet olivat [27]:
Linea: metyloimatonta LINE-1 eteenpäin pohjamaali, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: metyloimatonta LINE-1 reverse-aluke, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
LINEc: metyloitu LINE-1 eteenpäin pohjamaali, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
vuorattu: metyloitu LINE-1 reverse-aluke, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG.
PCR-monistus-olosuhteet olivat: 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30 s, 58 ° C, 45 s, 72 ° C, 61s, 40 sykliä; 72 ° C, 10 min. Tuloksena saadut PCR-tuotteet tehtiin näkyviksi 2% agaroosigeelillä. Metyloitua DNA-standardien Zymo Research käytettiin positiivisena kontrollina, kaksinkertainen tislattua vettä negatiivisena kontrollina.
Sekvenssin samankaltaisuuden ja konservoituneet verkkotunnuksen
PSI-Blast käytettiin NCBI Blast palvelimen [28] (haku päivämäärä: 20 th tammikuu 2012) tunnistamiseksi GCRG213p järjestyksessä tahansa linjauksia Protein Data Bank tietokannat mukaan lukien kaikki ei-tarpeeton GenBank CDS käännöksiä, ATE, SwissP-, PIR ja PRF. Se suoritettiin tavallisella alkuperäisen BLASTP hakua.
Tilastollinen
Chi-square test tai Fisherin todennäköisyys käytettiin arvioimaan suhdetta GCRG213p ilmaisun ja kliinis muuttujia. Kokonaiselossaoloaika tutkittiin GCRG213p ilmaisutapoja Kaplan-Meier käyrät. Kaikki p-arvot olivat kaksipuolisia ja pidettiin tilastollisesti merkittävinä, jos p < 0,05. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Tulokset
GCRG213p ekspressiokuvioita normaaleissa mahan limakalvoa ja mahalaukun adenokarsinoomaa
Distinct GCRG213p värjäytyminen havaittiin ensisijaisen mahalaukun adenokarsinoomat, imusolmukkeiden etäpesäke kasvaimia, ja ei-kasvaimen mahalaukun limakalvon (kuvio 1). Ei-kasvaimen mahalaukun limakalvon esopheageal mahalaukun risteys ja antrum-alueella, sytoplasmaan eriytetyn pinnan epiteelin ja limakalvojen rauhasten oli negatiivinen värjäytyminen, mutta positiivinen GCRG213p värjäytyminen havaittiin tyvikalvon normaalin rauhaset. 133 175 ensisijaisen mahalaukun adenokarsinoomia, ja 51 67 kasvainten metastaattista ja imusolmuke positiivisesti GCRG213p immunologista, joka sijaitsi sytoplasmassa karsinoomasoluja. Kuvio 1 GCRG213p ilmentymisestä ihmisen pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten mahalaukun limakalvon. Molemmat (A) ensisijainen mahalaukun adenokarsinooman (100 x) ja (B) adenokarsinooma tunkeutunut osaksi imusolmuke (100 x) osoitti positiivisen GCRG213p stainging sytoplasmassa; (A ') ja (B ") osoitti, että suuremmalla suurennuksella (400 x) alueelta (A) ja (B). (C) Ei-pahanlaatuinen mahalaukun epiteelin, positiivista värjäytymistä havaittiin tyvikalvon mutta ei sytoplasmassa; GCRG213p immunoreaktiivisuus havaittiin sytoplasmassa mahalaukun suoliston metaplasiaa rauhaset (nuolella) (100 x); (C) osoitti, että suuremmalla suurennuksella (400 x) siltä alueelta (C).
Mukaan Lauren luokitusta, mahalaukun syöpä on jaettu kahteen histologista tyyppiä: suoliston-tyyppiä tai diffuusi-tyyppiä. Meillä on 153 suoliston-tyypin tapauksista ja 22 hajanainen-tye tapauksissa tässä tutkimuksessa. Niistä 153 suoliston-tyyppinen tapauksissa 34 suoliston metaplasiaa ja 28 intraepiteliaalisten neoplasia näytteitä Lähin tarkennusetäisyys syöpään tunnistettiin. Ikä (vuosi, keskiarvo ± SD) Suolen-tyyppinen ryhmä suoliston metaplasiaa (59,67 ± 12,30) oli vanhempi kuin diffuusi-tyyppinen ryhmä (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 34 suoliston metaplasiaa, ja 27 28 matala- /korkealaatuisesta intraepiteliaalisten neoplasia osoitti GCRG213p immunoreaktiivisuus. Useimmat positiivisia tapauksia osoitti lievää tai kohtalaista värjäytymistä (taulukko 2) .table 2 GCRG213 ilmentymistä mahalaukun kudosnäytteistä
Ryhmät
Number
GCRG213 ilmaisu
Kaiken pisteet ‡
PR§ (%)
0-1
2-3
4-5

6
kuin kasvaimen mahalaukun epiteelin
112
112
0
0
0
0.00
Intestinaalinen metaplasiaa
34
3
18
11
2
91.18 *
Matala- /korkealaatuisesta intraepiteliaalinen neoplasia
28
1
17
10
0
96.43 *
adenokarsinooma ilman LNM †
100
26
50
21
3
74.00 *
adenokarsinooma kanssa LNM
75
16
40
16
3
78,67 *
kasvaimen metastaattinen ja imusolmuke
67
16
42
8
1
76,12 *
† LNM
Imusolmuke etäpesäke; ‡ Kaiken pisteet lasketaan (intensiteetti pisteet) plus (prosenttia soluista positiivinen pistemäärä) menetelmissä kuvatulla tavalla; §PR
Positiivinen nopeudella.
* Verrattuna ei-tuumori- mahalaukun limakalvon, p < 0,001.
Association between GCRG213 ilmaisun ja kliinis parametrit
korkea GCRG213p immunovärjäyty- pisteet ensisijaisen mahasyövän korreloi positiivisesti kasvaimen erilaistumiseen (p = 0,001) (kuvio 2). Samaan aikaan, GCRG213p ilmentyminen korreloi Lauren luokittelu (p < 0,05). Niiden positiivisten GCRG213p värjäytymistä vuotiaiden ryhmässä (> = 65 vuotta) oli korkeampi kuin ei-vuotiaiden ryhmässä (< 65 v) (60/71 = 84,51% vs. 73/104 = 70,19%, p < 0,05). Kuitenkin GCRG213p ekspressiota ei havaittu liittyvän muiden kliinis parametrit kuin taulukossa 1 (p > 0,05). Kun 67 potilasta sekä primaarikasvaimen ja imusolmukkeiden etäpesäkekasvainten yksilöitä, GCRG213p oli positiivinen 51 imusolmuke etäpesäke näytteet ja 52 primaarikasvaimen näytteet (76,12% vs. 77,61%), vastaavasti, mikä osoittaa, että kohonnut GCRG213p ilmentyminen imusolmuke metastaattisen kasvain on yhtäpitävä GCRG213p ilmaisua ensisijainen mahakarsinoo-. GCRG213p ilmentyminen imusolmukemetastaaseja liittyi myös laatuja kasvaimen erilaistumiseen (p = 0,015), mutta ei muiden kliinis parametrien (p > 0,05). Kuvio 2 korrelaatio GCRG213p Immunovärjäyksen pisteet ensisijainen mahasyövän kasvaimen erilaistumista. Kaiken Score (OS) immunovärjäyksen on suurempi hyvin erilaistunut syöpään kuin että huono-eriytetty (p = 0,001).
Suhde GCRG213 ilmaisun pelastautumiskoulutukseen
Seuranta tietoa ei ole saatavissa 175 mahasyövän potilaat ajan pituus vaihtelee 18 kuukaudesta 14 vuoteen. Kaiken eloonjäämisluvut ovat seuraavat: 91,42% (1 vuosi), 78,28 %% (2 vuotta), 56.57% (3 vuotta), 39.43% (4 vuotta), ja 23,43% (5 vuotta). Keskimääräinen elinaika on 41 kuukautta.
Perustuen GCRG213p ilmaisun primaarikasvaimia, ei ollut merkitsevää eroa potilaiden välillä on GCRG213p negatiivinen luokkaan verrattuna GCRG213 positiivinen luokka (X
2
= 2,072, p = 0,558). Samoin ei havaittu korreloivan GCRG213p ilmaisun imusolmuke etäpesäke ja eloonjäämisen (X
2
= 3,272, p = 0,195).
GCRG213p ilmentymistä pahanlaatuinen ja normaali mahan limakalvon solulinjojen
Western blotting määritykset suoritettiin mahalaukun syöpäsolujen kuten SGC-7901, BGC-823 ja ei-pahanlaatuisten mahalaukun limakalvon solulinjaa GES-1, jotta edelleen vahvistaa tasauspyörästön ilmaus GCRG213p. Proteiini bändit noin 35 kDa tunnistettiin. Kolme testatuissa solulinjoissa ilmaisi GCRG213p eri tasoilla. GCRG213p tason todettiin korkeampi syövän solulinjoissa kuin GES-1 (kuva 3). Tämä havainto vastaa kanssa IHC tulos tässä tutkimuksessa, ts GCRG213p havaittiin yli-ilmentynyt mahasyövän. Kuvio 3 Western blotting-analyysi kokosolu-uutetta mahalaukun pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten solujen anti-GCRG213p vasta-aine. Ilmentävät GCRG213p proteiini bändit 35-kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. Suodatin uudelleenseulottiin anti-β-aktiini-vasta-aine ohjata samasta lastaus (alapaneeli).
Metylaatiospesifinen PCR-analyysi LINE-1
Metylaatiospesifinen PCR (MSP) analyysit suoritettiin mahalaukun syöpäsolujen ja ei-pahanlaatuisten mahalaukun limakalvon solulinjaa GES-1, jotta testi L1 promoottori metylaatiostatus näissä solulinjoissa. Sen lisäksi mahasyöpä solulinjoista SGC-7901 ja BGC-823, tutkimme myös mahasyövän solulinja MGC-823, sillä tarkoituksena on tarjota lisätietoja L1 metylaatio mahasyövän solulinjoissa. PCR-tuotteet monistettiin metyloidut-spesifisiä alukkeita (MSPM) ja metyloimattoman-spesifisiä alukkeita (MSPU) oli 116 bp: n ja 111 bp: n, vastaavasti. In GES-1-solut, PCR-tuote monistettiin MSPM, mutta ei MSPU, viittaa siihen, että L1 promoottorit GES-1-soluissa tehtiin täydellinen metylointi; In SGC-7901-solut, BGC-823-solut ja MGC-803-solut, vastaavat vyöhykkeet voidaan monistaa sekä MSPM ja MSPU, osoittaa osittaista metylaatio (kuvio 4). Kuva 4 Metylaatiospesifinen PCR (MSP) analyysi LINE-1. Agaroosigeelielektroforeesi MSP tuotteita. M: tuote monistettiin metyloituja aluketta; U: tuote monistettiin metyloitumattomilla aluketta. PC: positiivinen kontrolli, ihmisen metyloitua DNA standardi; W: kaksinkertainen tislattua vettä ohjaus. Huomaa, että GES-1 näytteet ainoastaan ​​näytä metyloidut PCR-tuotteet, ja MGC-803, SGC-7901 ja BGC-823 näytteistä sekä metyloitu ja metyloitumaton PCR-tuotteita.
Bioinformatiikka- tunnistaminen GCRG213p jäsenenä L1-EN perheen
BLASTP-ohjelma-analyysi, kuten edellä on mainittu, paljasti, että GCRG213p peptidi jaettu 83,0% linjassa C-terminaalinen alue L1-EN. Konservoituneet Domain Search of GCRG213p sekvenssin konservoituneet Domain tietokanta NCBI osuu suuri eksonukleaasi /endonukleaasi /fosfataasi (EEP) superperheen, myös endonukleaasi domain ei-LTR retrotransposonisekvenssin LINE-1, eksonukleaasi III (ExoIII-) kaltaisia ​​apurinic /apyrimidinic ( AP) endonukleaasit jne
Tarkempi analyysi käyttäen BLASTP osoittaa, että kyseessä on GCRG213p järjestyksessä jäämiä, jotka ovat tärkeitä konservoituneen ominaisuudet L1-EN, kuten otaksuttu fosfaatti sitoutumiskohtaan [ioni sitoutumiskohta] (Y115 /N145 /H230), oletetun metallia sitova kohta [ioni sitoutumiskohdan] (D229) ja oletetun katalyyttisen [aktiivisen] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (kuvio 5). Kuva 5 linjaus GCRG213p ja L1-EN. Punaisella edustaa korkea yksimielisyys, sininen tai musta fontti edustaa alhainen yksimielisyys. GCRG213p sisälsivät jäämiä (nuolella), jotka ovat tärkeitä endonukleaasiaktiivisuus L1-EN.
Keskustelu
On selvää, että L1 retrotranspositioon on sattunut somaattisilla ja sukusoluilla. Huolimatta siitä, että täyspitkä L1 mRNA: t ovat varmasti hallitseva lähde L1 retrotranspositioon, endogeeninen L1 ORF2 silmukoitumisvariantit mahdollisten biologista merkitystä löytyy ilmaista eri somaattisten kudoksissa. Belancio jne [20] havaittu SpORF2 transkriptio erilaisissa aikuisen ihmisen kudoksissa ja ilmaus SpORF2 mRNA esiintyy kudosspesifisiä vaihtelua. Siten L1 toiminto ei todennäköisesti rajoittaa vain täysin aktiivisia elementtejä. SpORF2 voi myös tuottaa toiminnallisia ORF2-proteiinia. Useimmat ei-LTR retrotransposoneja ovat APE-tyyppiä ei-LTR retrotransposoneja [29]. Kiderakenne analysoidaan ihmisen L1-FI ilmoittaa, että se on prototyyppi AP kaltainen retroposoni koodattuja endonukleaaseilla, joka nick DNA vaihteleva spesifisyys ja vastaavat miljoonia retroposoni lisäyksiä eukaryootti- genomien [30]. Sekä APE1 ja L1-EN kuuluvat suuret EEP superperheen joka jakaa saman proteiinin telineen ja sama katalyyttinen jäämiä.
Ottaen huomioon, että GCRG213p osakkeiden korkea rinnastus L1-EN, ja hänellä konservoituneita tähteitä, jotka ovat ratkaisevia L1 -EN fosfaattia sitova, metallia sitovat ja katalyyttinen aktiivisuus, ehdotamme, että GCRG213 on saumattu L1-ORF2. GCRG213p voisi olla toimiva jäsen L1-EN perhe, variantti L1-EN.
Yliekspressio L1 kasvaimissa ollut näyttävästi esillä [12-14]. Solu endogeeninen L1-RT nousee konstitutiivisena toiminnallinen komponentti kasvaimia tuottavassa soluissa ominaista korkea lisääntymistä ja alhainen eriyttäminen asema [31, 32]. On kuitenkin olemassa muutamia yksityiskohtaisia ​​tutkimuksia L1-EN ihmisen kasvain. Ergun jne. Käytetään anti-L1-EN-vasta-aineen havaitsemiseksi L1-ORF2 aikuisen ihmisen kudoksissa, he huomasivat vahva ORF2p ilmentymistä endoteelisoluissa verisuonten normaalin ihmisen eturauhasen, virtsarakon ja kiveksessä, mutta ei ORF2p ilmentymistä havaittiin syöpäsoluja tutkittu [33]. Oricchio jne [34] kertoi, että vakaa L1 RNA-interferenssi voi heikentää lisääntymistä ja edistää erilaistumista in A-375-melanoomasoluja. He myös havaittu vähentäminen L1-ORF2 proteiini. Mutta tutkijat eivät ole tunnistettu, onko leviämisen vaikutukset olivat L1-EN ja /tai L1-RT. Tähän mennessä ei ole raportissa todettiin roolista L1-EN soluproliferaatioon ja erilaistumista. Tässä tutkimuksessa olemme vahvisti, että GCRG213p ilmentyminen koholla mahasyövän at proteiini tasolla, niin solumallin ja kudosleikkeiden tutkittu, mikä on sopusoinnussa aiempien tutkimustulosten mRNA tasolla [22]. L1 tehdään hypometylaatio eri tuumorikudoksissa, mukaan lukien mahasyöpä [35]. Shigaki jne [36] käytetään bisulfiitti-pyrosekvensointi tekniikka määrällisesti L1 metylaatio tilaansa resektoidun mahasyövässä yksilöitä. He havaitsivat, että potilaalle tehtiin L1 hypometylaatio kokenut huomattavasti lyhyempi kokonaiselossaoloaikaa kuin ne, joilla hypermetylaation. Löysimme tässä tutkimuksessa, että L1 oli täysin metyloitu normaalissa mahan limakalvoa solulinjaa GES-1, mutta osittain metyloitu mahasyövän solulinjoissa. Nämä tulokset korreloivat GCRG213p ekspressiota mahasyövän solulinjoissa, siten antaa enemmän näyttöä luonteesta GCRG213 peptidin. Emme kuitenkaan voi tunnistaa korrelaation GCRG213p ilmaisun ja selviytymistä tässä tutkimuksessa. Epiteelinsisäisen neoplasia uskotaan olevan tärkeä askel pahanlaatuisen muutoksen mahalaukun adenokarsinooman, yliekspressio GCRG213p näiden rauhasten hiljaista mahdollisen roolin GCRG213p mahalaukun kasvaimen synnyssä. Korkea immunovärjäystä pistemäärä GCRG213p hyvin eriytetty mahasyövän ilmoittanut, että se saattaa olla mukana mahasyövässä erilaistumista.
Vaikka krooninen atrofinen gastriitti uskotaan olevan ikään liittyvä kokonaisuus, suoliston metaplasiaa pidettiin näyttöä atrofinen gastriitti, koska erikoistuneita rauhaset oli korvattu suoliston crypts, joten suoliston metaplasiaa pidettiin iästä. Ikä on tärkeä ohjaava tekijä kehittämiseen mahalaukun suoliston metaplasiaa, ja potilailla, joilla on maha- suolikanavan metaplasiaa olivat huomattavasti vanhempia kuin ilman metaplasiaa [37]. Suoliston metaplasiaa rauhaset näkyy laaja GCRG213p immuunivärjäystä tässä tutkimuksessa. Samalla olemme havaittu, että positiivinen nopeus GCRG213p mahasyövän kudoksissa vuotiaiden ryhmässä oli suurempi kuin ei-vuotiaiden ryhmässä. Nämä voivat merkitä sitä, että GCRG213p liittyy mahan limakalvoa ikääntymiseen ja ikääntymiseen liittyviä yhteisöjä. Ei ole tutkimuksen yhdistyksen välillä L1 ilmaisun ja ikä hetkellä, mutta keskimääräinen L1 metylaatio ei vaihdellut ajan mittaan [38, 39]. Uskotaan, että nicking genomi-DNA: n L1-EN voi aiheuttaa solun myrkyllisyyttä, mikä johtaa solusyklin pysähtymiseen, apoptoosin tai vanhenemista. Ulkosyntyisen täyspitkän L1 ja SpORF2 normaaleissa ihmisen fibroblasteissa, syöpäsolut ja aikuisen kantasoluja on johtanut havaittavissa DNA-vaurioita, ja tuloksena vanhenemista kaltainen fenotyyppi [20]. Niinpä epäillä, että kertynyt aktiivisuus GCRG213p, variantin L1-EN, voi edustaa potentiaalinen ikäsidonnaisten solutransformaatioon, mikä lopulta vaikuttaa solujen vanhenemista, tai vastakkaisesti, että out-of-ohjattu (pahanlaatuinen) Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Alkoholin kulutus ja mahalaukun syövän riski a kohorttitutkimuksessa miesten Liettuan Kaunasissa, jossa jopa 30 vuotta seurannassa
• Induktio kromosomi epävakauden ja mahasyöpä muuttamalla ekspressiokuviota mitoosi tarkistuspiste geenien hiirillä altistettiin areca pähkinä