Expressie van een LINE-1 endonuclease variant bij maagkanker: de associatie met klinisch-pathologische parameters

Expressie van een LINE-1 endonuclease variant bij maagkanker: de associatie met klinisch-pathologische parameters
Abstracte achtergrond
Long afgewisseld nucleaire element- 1 (LINE-1 of L1), de meest voorkomende en slechts autonoom actieve familie van niet-LTR retrotransposons in het menselijk genoom, niet alleen tot uiting in de kiem lijnen, maar ook in somatische weefsels. Het draagt ​​bij tot genetische instabiliteit, veroudering en leeftijd gerelateerde ziekten, zoals kanker. Onze vorige studie die in de menselijke adenocarcinoom een ​​opgereguleerd transcript GCRG213, waarvan 88% homologie gedeeld met menselijke L1 sequentie en bevatte een vermeende geconserveerde apurinische /apyrimidinische endonucleas1 domein.
Methods
Immunohistochemie werd uitgevoerd met behulp van een monoklonaal muis anti uitgevoerd humaan GCRG213 eiwit (GCRG213p) antilichaam geproduceerd in ons laboratorium, op tissue microarray gebouwd met monsters van 175 patiënten met adenocarcinoom van de maag. De correlatie tussen GCRG213p meningsuiting en de patiënt clinicopathologische parameters geëvalueerd. GCRG213p expressie in maagkanker cellijnen werden onderzocht met behulp van Western blotanalyse. L1 promoter methylatie status van maagkanker cellen werd getest met behulp van methylatie-specifieke PCR. BLASTP werd gebruikt bij de NCBI Blast server om GCRG213p sequentie te identificeren om eventuele optimalisaties in de Protein Data Bank databases.
Resultaten
meeste primaire maagkanker, lymfkliermetastasen en maag-darm metaplasie klieren toonde positieve GCRG213p immunoreactiviteit. Hoge GCRG213p immunokleuring score in de eerste maagkanker was positief gecorreleerd met tumor differentiatie (goed gedifferentieerd, p = 0,001), de indeling Lauren's (intestinale type, de p < 0,05) en een late leeftijd begin van adenocarcinoom van de maag (≥65 jaar; p <0,05). GCRG213p meningsuiting heeft geen associatie met andere klinische en parameters, met inbegrip van overleving. Western blotting analyse van GCRG213p expressie bij maagkanker cellen bleek dat GCRG213p hoger bij maagkanker cellijnen dan in humane normale maag epitheel geïmmortaliseerde cellijn GES-1 was. Gedeeltelijke methylering van L1 bij maagkanker cellen werd bevestigd door methylatie-specifieke PCR. BLASTP programma analyse bleek dat GCRG213p peptide gedeeld 83,0% aanpassing aan het C-terminale gebied van L1 endonuclease (L1-EN). GCRG213p sequentie bezit de belangrijke resten die de geconserveerde kenmerken van L1-NL samen te stellen.
Conclusies
GCRG213p zou een variant van L1-NL, een functioneel lid van L1-EN familie. Overexpressie van GCRG213p is gebruikelijk in zowel de primaire maagkanker en lymfeklieren metastase. Deze bevindingen leveren het bewijs van somatische L1 expressie bij maagkanker, en de mogelijke gevolgen in de vorm van de tumor.
Sleutelwoorden
Maagcarcinoom Long afgewisseld element-1 endonuclease GCRG213 eiwit Tissue microarray Achtergrond nucleaire
Long afgewisseld nucleaire element -1 (LINE-1 of L1) is de meest voorkomende en slechts autonoom actieve familie van niet-LTR retrotransposons in het menselijk genoom en omvat ongeveer 17% van het menselijke genoom [1]. De overgrote meerderheid van de ongeveer 500.000 totale kopieën van L1 in het humane genoom niet in staat zijn de omzetting op zichzelf door verschillende mechanismen, zoals truncaties en inactiverende mutaties. Echter schatting 80-100 full-length, retrotransposition bevoegde L1s (RC-L1s) zijn aanwezig in een typische diploïde humane genoom, en een klein aantal, zogenaamde "hot L1s" vertonen een hoge efficiëntie retrotransposition [2].
Menselijke RC-L1s zijn ongeveer 6,5 kb en coderen voor twee eiwitten (ORF1p en ORF2p) die nodig zijn voor retrotransposition [3]. ORF1p is een 40-kDa eiwit met RNA-bindende [4] en nucleïnezuur chaperone activiteiten [5]. ORF2p is een 150 kDa eiwit met endonuclease (L1-EN) [6] en reverse transcriptase (RT-L1) [7] activiteiten. L1 element kan integreren in honderdduizenden genomische locaties op een los bepaalde consensus plaats (5'-TTTT /AA-3 '), die inkepingen door L1-EN [8]. De gastheer beperkt de verspreiding van deze elementen door transcriptionele en post-transcriptionele silencing mechanismen die activiteit reduceren tot aanvaardbare niveaus [9].
L1 niet alleen tot uiting in de kiem lijnen, maar ook in somatische weefsels. Gesuggereerd wordt dat zelfs lage niveaus van somatische DNA schade door L1 activiteit kan bijdragen tot genetische instabiliteit, veroudering en leeftijd gerelateerde ziekten, zoals kanker [10, 11]. L1-ORF1 en ORF2 werden opgereguleerd in diverse kwaadaardigheden, zoals borstkanker, pancreaskanker en kwaadaardige kiemceltumoren, etc. [12-14]. L1 hypomethylatie waargenomen in diverse kwaadaardigheden zoals hoofd en nek, slokdarm en maag kanker, en premaligne laesies [15, 16]. De mate van L1 hypomethylatie werd ook geassocieerd met een verder gevorderd en slechtere prognose [17, 18].
L1 geïnduceerde invloed cellen is waarschijnlijk niet alleen beperkt tot een minder actieve elementen. Zelfs L1 elementen defecte ORF1 coderende gebieden kan een RNA splits die een functionele ORF2 met een aantal negatieve gevolgen voor de cel [19] te drukken. Veel weefsels produceren vertaalbaar gesplitst ORF2 (SpORF2) transcript [20]. Een gesplitst L1 transcript die integrant reverse transcriptase sequentie van ORF2 omvat, bleek essentieel voor de menselijke hepatoma celproliferatie [21] te zijn.
Onze vorige studie [22] die een opgereguleerd transcript, genaamd maagkanker gerelateerde gen 213 (GCRG213) , in de menselijke adenocarcinoom van de maag. BLAST analyse van GCRG213 sequentie aangegeven 88% homologie met menselijke LI en onthulde een vermoedelijke geconserveerd domein, apurinische /apyrimidinische endonucleas1 (APE), in GCRG213-ORF. Onze nieuwste onderzoek van de geactualiseerde GenBank-database toont GCRG213-ORF bevat een L1-EN geconserveerd domein. Dit document meldt onze huidige studie dat de uitdrukking GCRG213 eiwit (GCRG213p) bij maagkanker cellijnen heeft bevestigd door het gebruik van monoklonale muizen anti-GCRG213p antilichaam geproduceerd in ons laboratorium (Geriatrische instituut, China PLA General Hospital, Beijing, China). Bovendien immunohistochemie (IHC) toegepast tissue microarray (TMA) werd gebruikt om expressie GCRG213p evalueren maagkanker en normale maagslijmvlies. Verdere analyses werden uitgevoerd om te zien of er een verband bestaat tussen GCRG213p expressie en clinicopathologische parameters en overleving.
Methods
Patiënten
Patiënten die gastrectomy in het algemeen ziekenhuis PLA ondergaan voor maagkanker, Beijing, China 1991-2003 werden als kandidaten voor deze studie. De bemonstering criteria waren: geslacht (mannen en vrouwen), leeftijd (20 jaar of ouder); nieuw gediagnosticeerde (incident) maagcarcinoom zonder voorafgaande behandeling; diagnose histologisch bevestigde; paraffine ingebedde tumor, gekoppeld rond niet-tumorale maagslijmvlies weefsels mogelijk, met carcinomen metastatische lymfeknoop indien mogelijk; en positieve follow-up resultaten bij de TMA constructie. Als resultaat werden 175 gevallen gerekruteerd in deze studie, die 144 mannen en 31 vrouwen (27 ~ 84 jaar, gemiddelde = 58,58 jaar). Onder hen, zevenenzestig gevallen carcinomen vergezeld lymfeknoop metastase en zes gevallen van met formaline gefixeerd paraffine werden normale gastrische weefsels eveneens verkregen uit niet-tumor patiënten die geopereerd door goedaardige maagaandoeningen.
Demografische , lifestyle en clinicopathologische gegevens voor de steekproef gevallen werden weergegeven in tabel 1. Alle tumoren werden geclassificeerd en gefaseerde volgens de herziene richtlijnen bepleit door de Internationale Unie tegen kanker. De follow-up werd gemaakt om hun nieuwste omstandigheden in 2005 te evalueren door het raadplegen van hun zaak documenten of door middel van telefoongesprekken aan patiënten (of hun familieleden, of huisartsen). Een minimaal interval van 18 maanden is vastgesteld, en de mediane follow-up tijd voor patiënten die aan het einde van 2005 nog in leven waren, was 46 maanden (het bereik was van het minimum 18 tot de maximale 129 maanden). Overlevingstijd werd berekend vanaf de datum van de operatie om de datum van overlijden of de datum laatst bekende alive.Table 1 klinisch-pathologische parameters van maagkanker patiënten onderzocht in weefsel microarray
N (%)
GCRG213p negatieve
GCRG213p positieve
P-waarde
Geslacht
Man
144 (82,28%)
31
113
0,111
Female
31 (17,72%)
11
20
Age Restaurant < 65 bouwjaar 104 (59,43%)
31
73
0.029
≥65 bouwjaar 71 (40,57%)
11
60
roken Ja
45 (27,27%)
7
38
0,278
Geen
120 (72,73%)
30
90
Drinking
Ja
28 (16,97%) 2
26
0,060
geen
137 (83.03%)
35
102
Familie geschiedenis van de tumor
Ja
14 (8,43%) 2
12
0,639
Geen
152 (91,57%)
36
116
Tumor locatie
Cardiac
48 (27,43%)
8
40
0.360
body
37 (21,14%)
10 | 27
Antrum
90 (51,43%)
24
66
Tumor grootte (cm)
≤1
11 (6,29%)
3
8
0,506
1-3
42 (24.00%)
13
29 Restaurant > 3
122 (69,71%)
26
96
Diepte van de invasie
T1
46 (26,28%)
12
34
0,635
T2
21 (12,00%)
7
14
T3
33 (18,86%)
6
27
T4
75 (42,86%)
17
58
lymfeklieren
Ja
75 (42,86%)
16
59
0,592 verhuur No
100 (57,14%)
26
74
Grade van tumordifferentiatie
Well
10 (5,71%)
0
10 | 0,001
Matige
40 (22,86%)
4
36
Poor
103 (58,86%)
27
76
Signet ring cel
22 (12,57%)
11
11
Tumor stadium (TNM)
0
21 (12,00%)
3
18
0,217
Ia
14 (8,00%)
6
8
Ib
41 (23,43%)
10 | 31
II
60 (34,29%)
17
43
IIIa
39 (22,28% )
6
33
indeling Lauren's
Intestinal soort
153 (87,43%)
31
122
0.015
Diffuse soort
22 (12,57 %)
11
11
resectie marge
Presence
6 (3,43%)
0
6
0,361
Absence
169 (96,57% )
42
127
microvasculaire invasie
Presence
20 (11,43%)
5
15
0,911
Absence
155 (88,57%)
37
118
Status
levend
121 (71,18%)
30
91
0,483
dood
49 (28,82%)
9
40
5 jaars overleving Restaurant < 5 jr
47 (43,93%)
12
48
0,871
> = 5 jr
60 (50,07%)
10 | 37
toestemming is gegeven door de ethische commissie van de PLA General Hospital, Beijing, China aan het weefsel en de gegevens voor dit project te gebruiken. Informed consent werd ook verkregen van de patiënten.
Tissue microarray bouw, GCRG213p immunohistochemische kleuring en beoordeling
Het weefsel microarrays (TMA) werden geconstrueerd zoals eerder [23] beschreven. Uit de beschikbare monsters werden zes weefselarray blokken bereid, die elk 30 gevallen tumor en normale lymfeknoop weefsel, indien beschikbaar.
Antigeenterugtrekking TMA glijbanen en in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselcoupes werden uitgevoerd door druk fornuis behandeling van 10 minuten per antigen retrieval oplossing (10 mmol /L natriumcitraat, pH 6,0). Monoklonale muis antihumaan GCRG213p antilichaam, dat werd geproduceerd in ons laboratorium [24], werd toegevoegd bij een verdunning van 1: 200 en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. De objectglaasjes werden vervolgens gedurende 1 h in secundair antilichaam. Een EnVision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) werd gebruikt om antilichamen te visualiseren binding en objectglaasjes werden vervolgens tegengekleurd met hematoxyline. Een PBS alleen kleuring monster werd gebruikt als een achtergrondcontrole.
Specifieke geelbruine immunokleuring voor GCRG213p werd uitsluitend in het cytoplasma. Het werd zelfstandig en in een geblindeerde wijze gescoord door twee onderzoekers (GJ en XL). De inter-observer meningsverschillen (ongeveer 6% van de totale gevallen) werden beoordeeld voor de tweede keer, gevolgd door een sluitende uitspraak van beide waarnemers. Formele scoring werd vervolgens door één onderzoeker (WG) uitgevoerd. De kleuringsintensiteit werd gecategoriseerd als 0 (afwezig), 1 (zwak), 2 (matig) en 3 (sterk). Het percentage van positief gekleurde cellen werd gescoord als 0 (0% positief), 1 (1-30%), 2 (31-60%) en 3 (> 60%). Gecombineerde evaluatie van kleurintensiteit en uitbreiding werd gebruikt om GCRG213p uitdrukking uit. De minimale score bij opgeteld (intensiteit + extensie) was 0, en het maximum was 6 [25]. Algemene score van ≥2 werd geacht GCRG213p positief.
Western vlekanalyse
Maagkanker cellijnen inclusief SGC-7901, BGC-823 en de menselijke normale maag epitheel geïmmortaliseerde cellijn GES-1 werden gekweekt, verzameld en gelyseerd met de RIPA buffer op ijs alvorens te worden onderworpen aan Western-blotanalyse. De eiwitconcentratie werd gedetecteerd door de werkwijze van Bradford met BSA (Sigma-Aldrich) gebruikt als standaard. Gelijke hoeveelheden celextract (40 ug) werden onderworpen aan 8% SDS-PAGE en overgebracht naar polyvinylideendifluoridemembraan (Bio-Rad) voor antilichamen blotting. Het membraan werd vervolgens geblokkeerd, geïncubeerd met muizen anti-GCRG213p antilichaam (1: 500) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur gevolgd door incubatie met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het signaal werd zichtbaar gemaakt met versterkte chemiluminescentie detectie reagens. De muis anti-β-actine antilichaam (1: 5000, Sigma). Tegelijkertijd werd gedetecteerd als ladingscontrole
Detectie van methylatiestatus van LINE-1 met MSP
Validatie van LINE-1 methylatiestatus werd uitgevoerd onder gebruikmaking methylatie-specifieke PCR (MSP). Totaal DNA van SGC-7901, BGC-823, MGC803 en GES-1-cellen geëxtraheerd volgens de instructies van DNA extractie kit. Het DNA werd bisulfiet gemodificeerd zoals eerder beschreven [26] van 16 uur bij 50 ° C. Bisulfiet geconverteerde DNA werd PCR-geamplificeerd met Taq polymerase (Invitrogen, USA). Primers waren [27]:
Linea: gemethyleerd LINE-1 forward primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: gemethyleerd LINE-1 reverse primer, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
LINEc: gemethyleerd LINE-1 forward primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
gevoerd: gemethyleerd LINE-1 reverse primer, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
PCR amplificatie omstandigheden waren:. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61s, 40 cycli; 72 ° C, 10 min. De resulterende PCR-producten werden zichtbaar gemaakt op een 2% agarosegel. Gemethyleerd DNA Normen uit Zymo Research werden gebruikt als positieve controle, dubbel gedistilleerd water als negatieve controle
Sequence gelijkenis en geconserveerd domein zoeken
PSI-Blast werd gebruikt bij de NCBI Blast server [28] (search datum. 20 e januari 2012) om GCRG213p sequentie te identificeren om eventuele optimalisaties in de Protein data Bank databases met inbegrip van alle niet-redundante GenBank CDS vertalingen, VOB, SwissProt, PIR en PRF. Het werd uitgevoerd met een standaard initiële BLASTP zoekopdracht.
Statistische analyse
Chi-kwadraat test of Fisher's exacte waarschijnlijkheid werd gebruikt om de relatie tussen GCRG213p expressie en clinicopathologische variabelen te evalueren. Totale overleving werd onderzocht door GCRG213p expressie met Kaplan-Meier curves. Alle p-waarden waren met twee kanten en als statistisch significant als p < 0,05. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van SPSS 13.0 voor Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultaten
GCRG213p expressie patronen in normale maagslijmvlies en adenocarcinoom
Verschillende GCRG213p kleuring werd waargenomen in primaire maag adenocarcinomen, lymfe metastase tumoren, en niet-tumorale maagslijmvlies (figuur 1). In de niet-tumorale maagslijmvlies van esopheageal-gastrische overgang en antrum gebied, het cytoplasma van gedifferentieerde oppervlak epithelia en mucosale klieren kleuring was negatief, maar positief GCRG213p kleuring werd waargenomen in de basale membraan van de normale klieren. 133 van 175 primaire maag adenocarcinomen en 51 van de 67 tumoren metastatische lymfeknoop zich positief GCRG213p immunoreactiviteit, die was in het cytoplasma van de carcinoomcellen. Figuur 1 GCRG213p in humane kwaadaardige en goedaardige maagslijmvlies. Zowel (A) primaire maagdarmkanker (100 X) en (B) adenocarcinoom binnengedrongen in de lymfeklier (100 x) liet positieve GCRG213p stainging in het cytoplasma; (A) en (B) toonde de grotere vergroting (400 x) van het gebied (A) en (B). (C) In de niet-maligne maag epitheel werd positieve kleuring waargenomen in de basale membraan, maar niet in het cytoplasma; GCRG213p immunoreactiviteit gedetecteerd in het cytoplasma van maag intestinale metaplasie klieren (arrowed) (100 x); . (C) toonde de grotere vergroting (400 x) van het gebied (C)
Volgens Lauren indeling wordt maagkanker verdeeld in twee histologische types: intestinale-type of diffuse type. We hebben 153 intestinaal-type gevallen en 22 diffuse-tye gevallen in deze studie. Onder de 153 intestinale-type gevallen, 34 intestinale metaplasie en 28 intraepithelial neoplasie monsters grenzend aan de kanker werden geïdentificeerd. De leeftijd (jaar, gemiddelde ± SD) van de intestinale-type groep met intestinale metaplasie (59.67 ± 12.30) was ouder dan de diffuse-type groep (51.05 ± 11.29) (p = 0,004). 31 van 34 intestinale metaplasie, en 27 van 28 laag- /hoogwaardige intraepithelial neoplasie toonde GCRG213p immunoreactiviteit. Het merendeel van de positieve gevallen vertoonden milde tot matige kleuring (tabel 2) .table 2 GCRG213 expressie in weefselmonsters maag
Groepen
Aantal
GCRG213 uitdrukking
Overall score ‡
PR§ (%)
0-1
2-3
4-5

6
niet-tumorale maag epitheel
112
112
0
0
0
0,00
Intestinale metaplasie
34
3
18
11 2
91,18 *
Laag- /high-grade intraepithelial neoplasie
28 1
17
10 | 0
96,43 *
adenocarcinoom zonder LNM †
100
26
50
21
3
74.00 *
adenocarcinoom met LNM
75
16
40
16
3
78,67 *
tumor gemetastaseerd naar lymfeklieren
67
16
42
8 1
76.12 *
† LNM
lymfekliermetastasen; ‡ Overall score berekend als (intensiteit score) plus (percentage cellen positieve score), zoals beschreven in de methoden; §PR
positief tarief
* In vergelijking met niet-tumorale maagslijmvlies, p <.; 0.001.
Vereniging tussen GCRG213 expressie en clinicopathologische parameters
Hoge GCRG213p immunokleuring score in de eerste maagkanker was positief gecorreleerd met tumor differentiatie (p = 0,001) (figuur 2). Ondertussen werd GCRG213p expressie gecorreleerd met de indeling Lauren's (p < 0,05). Het percentage positieve kleuring GCRG213p bij ouderen groep (> = 65 jaar) hoger dan in de groep niet-verouderde (< 65 jaar) (60/71 = 84,51% vs. 73/104 = 70,19%, p < 0,05). Echter werd GCRG213p expressie niet in verband gebracht met andere clinicopathologische parameters zoals de in tabel 1 (p > 0,05) vermeld. Bij de 67 patiënten met zowel de primaire tumor en lymfeklieren uitgezaaide tumormonsters, GCRG213p was positief in 51 lymfeklier specimens en 52 primaire tumor specimens (76,12% tegen 77,61%), respectievelijk, wat aangeeft dat verhoogde GCRG213p expressie in lymfklier uitgezaaide tumor is overeenstemmend met GCRG213p expressie in het primair maagcarcinoom. GCRG213p expressie in lymfekliermetastasen werd ook geassocieerd met kwaliteiten van de tumor differentiatie (p = 0,015), maar niet met andere klinische en parameters (p > 0,05). Figuur 2 Correlatie van GCRG213p immunokleuring score in primaire maagkanker met tumor differentiatie. Overall Score (OS) van immunokleuring is hoger in de goed gedifferentieerde kanker dan die in de arme-gesplitste (p = 0,001).
Relatie van GCRG213 expressie met survival
Follow-up informatie beschikbaar was over 175 maagkanker patiënten voor een periode variërend van 18 maanden tot 14 jaar. Overall survival tarieven zijn als volgt: 91,42% (1 jaar), 78,28 %% (2 jaar), 56,57% (3 jaar), 39,43% (4 jaar) en 23,43% (5 jaar). De mediane overleving bedraagt ​​41 maanden.
Gebaseerd op GCRG213p expressie in primaire tumoren, was er geen significant verschil in overleving tussen patiënten in de GCRG213p negatieve categorie vergeleken met de GCRG213 positieve categorie (X
2
= 2,072, p = 0,558). Ook werd geen verband waargenomen tussen GCRG213p meningsuiting in lymfeklier metastase en overleving (X
2
= 3,272, p = 0,195).
GCRG213p expressie in maligne en normale maagslijmvlies cellijnen
Western blotting werden onderzocht aan maagkanker cellen inclusief SGC-7901, BGC-823 en niet-maligne maagslijmvlies cellijn GES-1, om de differentiële expressie van GCRG213p verder te valideren. Eiwitbanden van ongeveer 35 kDa geïdentificeerd. Drie geteste cellijnen tot expressie GCRG213p op verschillende niveaus. GCRG213p hoger was in de kankercellijnen gevonden dan in GES-1 (Figuur 3). Deze bevinding komt overeen met de IHC resultaat gemeld in deze studie, d.w.z. GCRG213p werd gevonden overexpressie bij maagkanker. Figuur 3 Western blot analyse van gehele celextract aan maag- maligne en niet-maligne cellen met behulp van anti-GCRG213p antilichaam. Cellen brengen GCRG213p met eiwitbanden van 35-kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. Het filter werd opnieuw gesondeerd met anti-β-actine antilichaam te controleren voor gelijke belasting (onderste paneel).
Methylering-specifieke PCR-analyse van LINE-1
methylatie-specifieke PCR (MSP) analyses werden uitgevoerd op maagkanker cellen en niet-maligne maagslijmvlies cellijn GES-1, om de L1 promoter methylatie status van deze cellijnen te testen. Afgezien van maagkanker cellijnen SGC-7901 en BGC-823, we ook bestudeerd maagkanker cellijn MGC-823, voor het doel van het verstrekken van meer informatie over de L1-methylatie bij maagkanker cellijnen. De PCR producten geamplificeerd met gemethyleerde primers (MSPM) en ongemethyleerde specifieke primers (MSPU) was 116 bp en 111 bp, resp. In GES-1-cellen, werd PCR product geamplificeerd met MSPM, maar niet met MSPU, wat suggereert dat L1 promoters in GES-1 cellen ondergingen volledige methylatie; In SGC-7901 cellen, BGC-823 cellen en MGC-803 cellen, kan de bijbehorende banden worden geamplificeerd met zowel MSPM en MSPU duiden op gedeeltelijke methylatie (figuur 4). Figuur 4 methylering-specifieke PCR (MSP) analyse van LINE-1. Agarose gelelektroforese van MSP producten. M: product versterkt met brandspiritus-specifieke primer; U: product versterkt met niet-gemethyleerd-specifieke primer. PC: positieve controle, human gemethyleerd DNA norm; W: dubbel gedestilleerd water controle. Merk op dat de GES-1 monsters uitsluitend tonen gemethyleerd PCR-producten, terwijl de MGC-803, SGC-7901 en BGC-823 monsters laten zien zowel gemethyleerd en niet-gemethyleerd PCR-producten.
Bioinformatica identificatie van GCRG213p als lid van L1-EN familie
BLASTP programma-analyse, zoals hierboven vermeld, bleek dat GCRG213p peptide gedeeld 83,0% aanpassing aan het C-terminale gebied van L1-NL. Geconserveerde domein zoeker van GCRG213p sequentie in de geconserveerde domeindatabase van NCBI raakt de grote exonuclease /endonuclease /fosfatase (EEP) superfamilie, inclusief endonuclease domein van de niet-LTR retrotransposon LINE-1, exonuclease III (ExoIII) -achtige apurinische /apyrimidinische ( AP) endonucleasen, enz
Verdere analyse met behulp BLASTP blijkt dat er in GCRG213p volgorde bepaalde residuen die belangrijk zijn voor de geconserveerde eigenschappen van L1-eN zijn zoals fosfaat vermoedelijke bindingsplaats [ion bindingsplaats] (Y115 /N145 /H230), metalen vermoedelijke bindingsplaats [ion bindingsplaats] (D229) en vermeende katalytische plaats [actieve site] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (Figuur 5). Figuur 5 Afstemming van GCRG213p en L1-NL. Rode doopvont vertegenwoordigt hoge consensus, blauw of zwart lettertype vertegenwoordigt laag consensus. GCRG213p bevatte residuen (bewegwijzerd) die belangrijk zijn voor de endonuclease activiteit van L1-NL.
Discussie are China Het is duidelijk dat L1 retrotransposition gebeurtenissen hebben plaatsgevonden in somatische en geslachtscellen. Hoewel volledige lengte L1 mRNA zeker de dominante bron van L1 retrotransposition endogene L1 ORF2 splice varianten met potentiële biologische relevantie worden gevonden uitgedrukt in verschillende somatische weefsels. Belancio etc. [20] SpORF2 gedetecteerde transcript in verschillende volwassen menselijke weefsels en de expressie van mRNA SpORF2 vertoont weefselspecifieke variatie. Aldus L1 functie waarschijnlijk niet beperkt tot een minder actieve elementen. De SpORF2 kunnen ook functioneel ORF2 eiwit. De meeste niet-LTR retrotransposons zijn APE-type niet-LTR retrotransposons [29]. De kristalstructuur analyses van het menselijke L1-EN geven dat het een prototype voor AP-achtige retrotransposon gecodeerde endonucleasen, die nick DNA met variabele specificiteit en zijn verantwoordelijk voor miljoenen retrotransposon inserties in eukaryote genomen [30]. Zowel APE1 en L1-EN behoren tot de grote superfamilie EEP dat hetzelfde eiwit scaffold en dezelfde katalytische residuen deelt.
Gezien het feit dat GCRG213p deelt hoge sequentie uitlijningen met L1-EN- en bezit geconserveerde residuen die cruciaal zijn voor L1 -NL fosfaatbinders, metalen binding en katalytische activiteit, stellen wij voor dat GCRG213 is een gesplitste L1-ORF2. GCRG213p kan een functioneel lid van L1-EN familie, een variant van L1-EN zijn. Ondernemingen De overexpressie van L1 in tumoren is algemeen voorgesteld [12-14]. De cellulaire endogene L1-RT voren als een constitutieve functionele component in tumorigene cellen gekenmerkt door een hoge proliferatie en een lage differentiatie status [31, 32]. Er zijn echter weinig gedetailleerde surveys van L1-NL in de menselijke tumor. Ergun etc. gebruikte anti-L1-NL antilichaam tegen het L1-ORF2 in volwassen menselijke weefsels te detecteren, vonden ze een sterke ORF2p expressie in endotheelcellen van de bloedvaten in de normale menselijke prostaat, urineblaas en de testis weefsel, maar geen ORF2p expressie werd waargenomen in de kankercellen bestudeerd [33]. Oricchio etc. [34] gemeld dat stabiele L1 RNA interferentie kunnen verminderen proliferatie en differentiatie bevorderen A-375 melanoomcellen. Zij namen een vermindering van L1-ORF2-eiwit. Maar onderzoekers hebben niet vastgesteld of de proliferatie effecten waren van L1-NL en /of L1-RT. Tot op heden is er geen rapport wordt de rol van L1-EN op celproliferatie en -differentiatie. In deze studie hebben we bevestigd dat GCRG213p expressie verhoogd in maagkanker op eiwitniveau, zowel in het celmodel en weefselcoupes bestudeerd, die in overeenstemming met onze eerdere studieresultaten op mRNA-niveau [22]. L1 ondergaan hypomethylatie in verschillende tumorweefsels, waaronder maagkanker [35]. Shigaki enz. [36] gebruikt bisulfiet Pyrosequencing technologie om L1 methylatie status van gereseceerde maagkanker monsters te kwantificeren. Zij vonden dat patiënten ondergingen L1 hypomethylatie ervaren significant kortere totale overleving dan die met hypermethylering. We vonden in deze studie dat L1 was volledig gemethyleerd in normale maagslijmvlies cellijn GES-1, maar werd gedeeltelijk gemethyleerd bij maagkanker cellijnen. Deze resultaten correleren met de GCRG213p expressiepatroon bij maagkanker cellijnen, voorzien dus meer gegevens over de aard van de GCRG213 peptide. We konden echter geen correlatie tussen GCRG213p expressie en overleving te identificeren in deze studie. Intra-epitheliale neoplasie wordt beschouwd als een belangrijke stap van maligne transformatie van gastrisch adenocarcinoom, overexpressie van GCRG213p in deze klieren impliceerde een mogelijke rol van GCRG213p gastrische oncogenese. De hoge score van immunokleuring GCRG213p in goed gedifferentieerde maagkanker aangegeven dat het betrokken kan zijn bij maagkanker differentiatie.
Terwijl chronische atrofische gastritis wordt dat een leeftijdsgebonden entiteit werd intestinale metaplasie als bewijs van atrofische gastritis, aangezien gespecialiseerde klieren was vervangen door intestinale crypten, zodat intestinale metaplasie werd als leeftijdsgebonden. Leeftijd speelt een belangrijke factor voor de ontwikkeling van het maag-intestinale metaplasie, en patiënten met maag- intestinale metaplasie waren beduidend ouder dan mensen zonder metaplasie [37]. Intestinale metaplasie klieren weergegeven uitgebreide GCRG213p immunokleuring in deze studie. Ondertussen namen wij waar dat de positieve verhouding van GCRG213p bij maagkanker weefsels bij ouderen groep was hoger dan in de groep niet-verouderde. Deze kunnen dat GCRG213p impliceren wordt geassocieerd met maagslijmvlies veroudering en leeftijd gerelateerde entiteiten. Er is geen onderzoek naar het verband tussen L1 meningsuiting en leeftijd op dit moment, maar de gemiddelde L1 methylatie niet variëren in de tijd [38, 39]. Er wordt aangenomen dat inkeping van genomisch DNA door de L1-EN celtoxiciteit, waardoor de celcyclus, apoptose of veroudering kan induceren. Expressie van exogeen volledige lengte L1 en SpORF2 in normale humane fibroblasten, kankercellen en volwassen stamcellen tot detecteerbare DNA-schade en resulteerde in de senescentie fenotype [20]. Dus vermoeden we dat geaccumuleerde activiteit van GCRG213p, een variant van L1-NL een potentiële bron voor leeftijdsgerelateerde cellulaire transformatie, die uiteindelijk bijdraagt ​​aan de celsenescentie of tegengesteld kunnen vormen, een out-of-gestuurde (maligne) Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Alcoholconsumptie en het risico op maagkanker: een cohort studie van de mannen in Kaunas, Litouwen, met maximaal 30 jaar follow-up
• Inductie van chromosomale instabiliteit en maagkanker door verandering van het expressiepatroon van mitotische checkpoint genen in muizen die zijn blootgesteld aan pinang