Izraz LINE-1 endonukleazo variante pri raku želodca: njena zveza s clinicopathological parametri

Izraz LINE-1 endonukleazo variante pri raku želodca: njena zveza s clinicopathological parametri
Abstract
ozadju
Long vrinjeni jedrske element-1 (LINE-1 ali L1), najbolj bogat in le samostojno aktivno družinsko od retrotransposons brez LTR v človeškem genomu, izraženo ne samo v zarodnih linij, ampak tudi v somatskih tkivih. Prispeva k genetske nestabilnosti, staranje, in s starostjo povezane bolezni, kot je rak. Naša predhodna študija je opredeljeno v človeški adenokarcinomom želodca molekul prepis GCRG213, ki delijo 88% homologije s človeško zaporedje L1 in je vseboval domnevni ohranjeno apurinic /apyrimidinic endonucleas1 domeno.
Metode
imunohistokemija je bila izvedena z uporabo anti monoklonsko miške -človeški GCRG213 beljakovin (GCRG213p) protitelo, pridobljeno v našem laboratoriju, na tkiva mikromrež zgrajene z vzorci iz 175 bolnikov adenokarcinomom želodca. Korelacija med GCRG213p izražanja in bolnikov clinicopathological parametrov je bila ovrednotena. GCRG213p izraz v želodcu raka celičnih linijah so raziskovali uporabo metodo Western blot analizo. L1 stanje promotor metilacija želodčnih rakavih celic smo testirali z uporabo metilacijskega specifični PCR. BLASTP je bila uporabljena pri Blast strežniku NCBI ugotoviti GCRG213p zaporedje za vse trase v beljakovinskimi zbirk podatkov banke.
Rezultati
Most primarnim rakom želodca, bezgavkah in želodca intestinalno metaplazijo žlez pokazala pozitivno GCRG213p radioinkorporacijo. Visoka GCRG213p imunskim barvanjem rezultat primarnega raka želodca je v pozitivni korelaciji z diferenciacijo tumorja (dobro diferenciran, p = 0,001), klasifikacija Lauren (črevesne tipa, p < 0,05) in pozni starosti nastopu adenokarcinomom želodca (starih 65 let; p <0,05). GCRG213p izraz nima povezave z drugimi clinicopathological parametrov, vključno preživetje. Western blot analiza GCRG213p izražanja v želodcu rakavih celic, je pokazala, da je bila stopnja GCRG213p višja v želodcu raka celičnih linijah kot v humani normalni želodca epitelijskega nesmrtno celično linijo GES-1. Delna metilacije L1 v želodčnih rakavih celic smo potrdili metilacije specifične PCR. BLASTP program za analizo pokazala, da GCRG213p peptid deljena 83,0% prilagajanje C-mejnemu območju L1 endonukleazo (L1-EN). GCRG213p poseduje zaporedje pomembne ostanke, ki sestavljajo ohranjenih lastnosti L1-EN.
Sklepi
GCRG213p je lahko varianta L1-EN, funkcionalne član L1-EN družino. Čezmerno GCRG213p je pogost v osnovnem želodčnega raka in bezgavk metastaz. Te ugotovitve predložiti dokaze o somatskih L1 izražanja v raka želodca, in njegove morebitne posledice v obliki tumorja.
Ključne besede
želodca karcinom Long vrinjeni jedrske element 1 endonukleazo GCRG213 nebeljakovinske tkiva mikromrež ozadju
Long vrinjeni jedrske element -1 (LINE-1 ali L1) je najbolj bogat in le samostojno aktivna družina retrotransposons niso LTR v človeškem genomu in obsega okoli 17% človeškega genoma [1]. Velika večina od približno 500.000 vseh kopij L1 v človeškem genomu niso sposobni prenosa same zaradi različnih mehanizmov, kot so truncations in inaktivacijskih mutacij. Vendar pa je po ocenah 80-100 celovečernih, retrotransposition pristojni L1s (RC-L1s) so prisotni v tipičnem diploidno človeškega genoma, in majhno število, imenovano "vroče L1s" kažejo visoke retrotransposition povečanje učinkovitosti [2].
Human RC-L1s okoli 6,5 kb in kodiranje dveh proteinov (ORF1p in ORF2p), ki so potrebne za retrotransposition [3]. ORF1p je 40-kDa protein z RNA vezavo [4] in kisline varuha dejavnosti nukleinske [5]. ORF2p je 150-kDa protein z endonukleazo (L1-EN) [6] in reverzne transkriptaze (L1-RT) [7] aktivnosti. L1 element se lahko vključijo v več sto tisoč genomske lokacijah na ohlapno opredeljenega konsenza mestu (5'-TTTT /AA-3 '), ki so zarezane z L1-EN [8]. Gostiteljica omejuje širjenje takih elementov, ki jih transkripcijskih in post-transkripcijskih mehanizmov za dušenje zvoka, ki zmanjšujejo dejavnost dopustne ravni [9].
L1 izražene ne le v zarodnih linij, ampak tudi v somatskih tkivih. Predlaga se, da imajo tudi nizke ravni somatskih poškodbe DNK zaradi L1 dejavnosti lahko prispevajo k genetske nestabilnosti, staranje, in s starostjo povezane bolezni, kot so rak [10, 11]. L1-ORF1 in ORF2 bila povečana pri številnih malignih bolezni, kot so rak dojke, rak trebušne slinavke in malignimi tumorji zarodnih celic, itd [12-14]. L1 Hipometilacija opazili v različnih malignih bolezni, kot na primer glave in vratu, požiralnika in želodca raka, in predrakavih lezij [15, 16]. Stopnja L1 hipometilacije je bila povezana tudi z bolj napredni fazi in slabšo prognozo [17, 18].
L1-inducirane vpliv na celice, se verjetno ne bo omejena le na polno aktivnih elementov. Tudi L1 elementi z napako ORF1 kodirajo regije bi lahko dal RNA, ki spoji izraziti funkcionalno ORF2 z vrsto negativnih posledic za celice [19]. Veliko tkiva proizvajajo prevesti spojeni ORF2 (SpORF2) prepis [20]. Prstasto L1 Prepis ki vključuje Del celote reverzne transkriptaze zaporedje ORF2, je bilo ugotovljeno, da je bistvenega pomena za širjenje človeškega hepatom celic [21].
Naš prejšnjo študijo [22] opredelila molekul prepis, imenovan želodčnega raka, povezanega z gen 213 (GCRG213) v človeške želodčne adenokarcinom. Analiza BLAST od GCRG213 nakazanem zaporedju 88% homologijo s humanim LI in razkrila domnevne ohranjeno domeno, apurinic /apyrimidinic endonucleas1 (APE), v GCRG213-ORF. Naš najnovejši iskanje posodobljene baze podatkov GenBank kaže GCRG213-ORF vsebuje L1-SL ohranjena domeno. V prispevku so naše sedanje raziskavo, ki je potrdila, da GCRG213 beljakovin (GCRG213p) izraz v želodcu raka celičnih linijah s pomočjo monoklonskih miške anti-GCRG213p protitelesa, proizvedenega v našem laboratoriju (Ambulantna zavod, Kitajska PLA General Hospital, Peking, Kitajska). Poleg tega, imunohistokemija (IHK) uporablja tkiva mikromrež (TMA) je bila uporabljena za oceno GCRG213p izražanja z rakom želodca in normalno želodčne sluznice. Nadaljnje analize so bile izvedene, da vidim, če je kakšna povezava med GCRG213p izražanja in clinicopathological parametrov in preživetje.
Metode
pacientov
Bolniki, ki so šli skozi želodca zaradi raka želodca v PLA splošne bolnišnice, Peking, Kitajska od leta 1991 do leta 2003 so bile upoštevane kandidatov za ta študij. Kriteriji za vzorčenje, so bili naslednji: spol (moški ali ženske), starost (20 let ali več); novo diagnosticirani (incident), želodčni rak, brez predhodne obdelave; diagnoza histološko potrjena; parafin vgrajeni tumor, v paru, ki obkroža na voljo non-tumorskega izvora želodčne sluznice tkiva, s karcinomom metastatskih da bezgavke, če je to mogoče; in pozitivne nadaljnji rezultati v času TMA gradnje. Kot rezultat, je bilo 175 primerov zaposleni v tej študiji, ki obsega 144 moških in 31 žensk (27 ~ 84 let, srednja = 58.58 let). Med njimi šestdeset sedmih primerih so karcinomov skupaj z bezgavkah metastaze, in šest primerov formalinu določen, so-parafin vgrajeni normalno želodca tkiva dobiti tudi pri bolnikih, ki niso tumorja, ki že delujejo na zaradi benignih želodčnih bolezni.
Demografske so življenjski slog in clinicopathological podatki za primere, v vzorcu je prikazano v tabeli 1. Vse tumorji so bile razvrščene in zastavljeni po revidiranih smernic Mednarodne zveze zagovarja proti raku. Nadaljnje ukrepanje je bila, da ocenijo svoje najnovejše razmere v letu 2005 po posvetovanju svojih primerov dokumente ali preko telefonske klice bolnikov (ali njihovih družinskih članov, ali družinske zdravnike). Sprejet je bil minimalen interval od 18 mesecev, mediana spremljanja čas za bolnike, ki so bili še živi do konca leta 2005 je bilo 46 mesecev (razpon je bil od najnižje 18 do maksimalnih 129 mesecev). Preživetja pa je bila izračunana od datuma operacije do dneva smrti ali od dneva zadnje znane alive.Table 1 Clinicopathological parametri bolnikov z rakom želodca študiral v tkivnih mikromrež
N (%)
GCRG213p negativni
GCRG213p pozitiven
P vrednost
spolov
moški
144 (82.28%)
31
113
0,111
ženski
31 (17,72%)
11
20
Starost
< 65 letnik
104 (59,43%)
31
73
0,029
≥65 leto
71 (40,57%)
11
60
Kajenje
Da
45 (27,27%)
7
38
0,278
Ne
120 (72,73%)
30
90
pitno
Da
28 (16,97%)
2
26
0,060
Ne
137 (83,03%)
35
102
Družinska anamneza tumorja
Da
14 (8,43%)
2
12
0.639
Ne
152 (91,57%)
36
116
Tumor lokacija
srčnih
48 (27.43%)
8
40
0.360
telo
37 (21,14%)
10
27
antruma
90 (51,43%)
24
66
velikost tumorja (cm)
≤1
11 (6,29%)
3
8
0,506
1-3
42 (24,00%)
13
29
> 3
122 (69,71%)
26
96
Globina invazije
T1
46 (26.28%)
12
34
0,635
T2
21 (12,00%)
7
14
T3
33 (18,86%)
6
27
T4
75 (42,86%)
17
58
bezgavko vpletenosti
Da
75 (42,86%)
16
59
0,592
št
100 (57,14%)
26
74
stopnja diferenciacije tumorja
No
10 (5,71%)
0
10
0.001
Zmerna
40 (22.86%)
4
36
Poor
103 (58,86%)
27
76
pečatni prstan celico
22 (12,57%)
11
11
tumorja faza (TNM)
0
21 (12,00%)
3
18
0,217
Ia
14 (8,00%)
6
8
Ib
41 (23,43%)
10
31
II
60 (34,29%)
17
43
IIIa
39 (22.28% )
6
33
Lauren je uvrstitev
črevesne vrste
153 (87,43%)
31
122
0,015
razpršeni tip
22 (12,57 %)
11
11
Resekcija stopnja
prisotnosti
6 (3,43%)
0
6
0,361
Odsotnost
169 (96.57% )
42
127
Mikrovaskularni invazije
prisotnosti
20 (11,43%)
5
15
0,911
Odsotnost
155 (88,57%)
37
118
Status
živ
121 (71,18%)
30
91
0,483
mrtev
49 (28,82%)
9
40
5 letno preživetje
< 5 yR
47 (43,93%)
12
48
0,871
> = 5 yr
60 (50,07%)
10
37
gradivo je podana z etičnega odbora Splošne bolnišnice PLA, Peking, Kitajska uporabljajo tkiva in podatke za ta projekt. Privolitev bili pridobljeni tudi od bolnikov.
Tissue mikromrež gradnje, GCRG213p Imunohistokemijsko in oceno
tkivnih mikromrež (TMAs) je bila zgrajena kot prej [23] opisano. Iz vzorcev, ki so na voljo, smo pripravili šest tkiva zaporedji blokov, od katerih vsaka vsebuje 30 primerov s tumorji, normalnih in bezgavk tkiv če so na voljo.
Antigen pridobivanje TMA diapozitivov in, profili tkiva-parafin vgrajeni-formalinom določen bile izvedene s pritiskom zdravljenje štedilnik 10 minut v raztopini pridobivanja antigena (10 mmol /l natrijevega citrat, pH 6,0). Monoklonsko miši proti človeški GCRG213p protitelo, ki je bil izdelan v našem laboratoriju [24], dodamo v razredčenju 1: 200 in inkubiramo 2 uri pri sobni temperaturi. Drsniki smo nato inkubirali 1 uro pri sekundarnih protiteles. Predstavljate kit (Dako, Carpinteria, CA, ZDA) je bila uporabljena za vizualizacijo protitelesa zavezujoča in diapozitivi so bili nato jih nasprotno z hematoksilinom. PBS samo obarvanje vzorec smo uporabili kot kontrolo v ozadju.
Posebno rumeno-rjave imunskim barvanjem za GCRG213p je nahajal izključno v citoplazmi. dosegel je bilo neodvisno in v slepo način z dvema preiskovalcev (GJ in XL). Nesoglasja so med opazovalec (približno 6% vseh primerov), so bili pregledani za drugič, sledi trdnih sodbi obeh opazovalcev. Formalno sedaj je bil nato izvaja en raziskovalec (WG). Intenzivnost obarvanja je bil kategoriziran kot 0 (odsoten), 1 (šibko), 2 (zmeren) in 3 (močno). Odstotek pozitivno obarvanih celic smo ocenili kot 0 (0% pozitivno), 1 (1-30%), 2 (31-60%) in 3 (> 60%). Kombinirana ocenjevanje od barvanja intenzivnosti in razširitev je bila uporabljena za oceno GCRG213p izraz. Minimalna ocena, če povzamemo (intenzivnost + podaljšek) je 0, največja je bila 6 [25]. Skupna ocena ≥ 2 je zdelo GCRG213p pozitiven.
Blot analiza Western
želodca linij rakavih celic, vključno SGC-7901, BGC-823 in humani normalni želodca epitelijskega nesmrtno celično linijo GES-1 so bili kultivirani, zbirajo in lizirali z RIPA buffer na ledu, nato pa so podvrženi Western blot analizo. Koncentracijo proteina smo zaznali z metodo Bradfordu z BSA (Sigma-Aldrich) kot standarda. Enaka količina celičnega ekstrakta (40 ug) so bili izpostavljeni 8% SDS-PAGE in prenesli v poliviniliden difluorid membrano (Bio-Rad) za blot protiteles. Membrana smo nato blokirali, inkubiranih z miško anti-GCRG213p protitelesa (1: 500) za 2 uri pri sobni temperaturi, čemur sledi inkubacija s hrenovo peroksidazo konjugiranih sekundarnega protitelesa za 1 uro pri sobni temperaturi. Signal smo vizualizirali z izboljšano reagentom odkrivanje kemiluminescenca. Anti-β-aktina protitelesa miška (1: 5000, Sigma). Je bila odkrita istočasno kot nadzor nakladanje
Odkrivanje metilacijskega statusa LINE-1 s PPN
potrjevanju statusa LINE-1 metilacije je bila izvedena s pomočjo metilacije specifične PCR (PPN). Skupaj DNA SGC-7901, je bila BGC-823, MGC803 in GES-1 celice pridobljeni v skladu z navodili kompleta za ekstrakcijo DNA. DNA je bisulfit modificiran kot je opisano predhodno [26] za 16 ur pri 50 ° C. Bisulfit-pretvorimo DNK je bila PCR pomnožili z uporabo Taq polimerazo (Invitrogen, ZDA). Temeljni premazi, ki se uporabljajo so [27]:
LINEA: nemetiliran LINE-1 naprej primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: nemetiliran LINE-1 reverse primer, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
LINEc: metilira LINE-1 naprej primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC
podložene: metiliranih LINE-1 reverzno premaz, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
PCR pomnoževanja pogoji so bili:. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30 s, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61s, 40 ciklov; 72 ° C, 10 min. Dobljene PCR produkti so bili vizualizirali na 2% agaroznem gelu. Denaturirani DNK Standardi iz Zymo raziskave smo uporabili kot pozitivno kontrolo, dvojno destilirano vodo kot negativno kontrolo
Zaporedje podobnosti in ohranjeni iskanje domene
PSI-Blast je bila uporabljena pri NCBI Blast strežniku [28] (datum iskanje. 20 th januarja 2012), da prepoznajo GCRG213p zaporedje za vse trase v Protein baz banka podatkov, vključno z vsemi neodvečnih GenBank CDS prevodi, PPP, SwissProt, PIR in PRF. izvedena je bila s standardno začetno iskanje BLASTP.
Statistična analiza
test hi-kvadrat ali natančna verjetnost Fisherjev je bila uporabljena za oceno razmerja med GCRG213p izražanja in clinicopathological spremenljivk. Celokupno preživetje je pregledal GCRG213p izražanja s Kaplan-Meier krivulj. Vse p vrednosti so bile dvostranski in velja za statistično pomembna, če p < 0,05. Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo SPSS 13.0 za Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Opazili rezultate
GCRG213p izraz vzorci v normalnem želodčne sluznice in adenokarcinomom želodca
razlikuje GCRG213p obarvane v primarnih želodčnih adenokarcinomov, limfna vozlišče metastaze tumorjev in brez protitumorski želodčni sluznici (slika 1). V ne-tumorskemu želodčne sluznice od križišča esopheageal-želodca in antruma področju citoplazmo diferencirane površinske epitela in sluznicah žlez pokazala negativno obarvanje, toda pozitivna GCRG213p obarvanje je bilo opaziti v bazalni membrani normalnih žlez. 133 175 primarnih želodca adenokarcinomov, in 51 v 67 tumorjev metastaznih na bezgavke pokazala pozitiven GCRG213p radioinkorporacijo, ki je bila nahaja v citoplazmi na celic karcinoma. Slika 1 GCRG213p izražanje v humani maligni in brez malignega želodčne sluznice. Sta (A) primarna želodčni adenokarcinom (100 x) in (B) adenokarcinom vdrla v bezgavke (100 x) je pokazala pozitivno GCRG213p stainging v citoplazmi; (A) in (B), pokazale večjo povečavo (400 x) iz prostora v (A) in (B). (C) v ne-maligne želodca epitelij, je bil pozitiven obarvanje opazili bazalne membrane, vendar ne v citoplazmi; GCRG213p radioinkorporacijo je bila odkrita v citoplazmi želodca intestinalno metaplazijo žlez (arrowed) (100 ×); . (C) je pokazala večjo povečavo (400 ×) iz prostora v (C)
Po klasifikaciji Lauren, je rak želodca razdeljen v dve histoloških tipov: črevesne tipa ali razpršenega tipa. Imamo 153 primerov črevesnega tipa in 22 difuzna-Tye primerov v tej študiji. Med primeri črevesne tipa 153, 34 črevesne metaplazijo in 28 intraepitelna vzorci neoplazije adjecent, da so bile ugotovljene rak. Starost (leto, povprečje ± SD) skupine na črevesno tipa z intestinalno metaplazijo (59,67 ± 12,30) je bila starejša od skupini difuzna tipa (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 od 34 intestinalno metaplazijo in 27 z dne 28. nizko /visoko stopnjo intraepitelijske neoplazije pokazala GCRG213p radioinkorporacijo. Večina pozitivnih primerov je pokazala, blago do zmerno obarvanje (tabela 2) .table 2 GCRG213 izraz v vzorcih želodčnega tkiva
skupin
Število
GCRG213 izraz
Skupna ocena ‡
PR§ (%)

0-1
2-3
4-5

6
ne protitumorski želodca epitelij
112
112
0
0
0
0.00
intestinalno metaplazijo
34
3
18
11
2
91.18 *
Low /high-grade intraepitelijske neoplazije
28
1
17
10
0
96,43 *
adenokarcinom brez LNM †
100
26
50
21
3
74.00 *
adenokarcinom z LNM
75
16
40
16
3
78,67 *
tumor metastatski na bezgavke
67
16
42
8
1
76,12 *
† LNM
limfnega vozla metastaze; ‡ Skupna ocena izračunana kot (rezultat intenzivnosti) plus (odstotkov celicah pozitiven izid), kot je opisano v metodah; §PR
Pozitivna stopnja
* V primerjavi z ne-tumorskemu želodčne sluznice, p <.; 0,001.
Zveza med GCRG213 izražanja in clinicopathological parametrov
Visoka GCRG213p imunskim barvanjem rezultat primarnega raka želodca je v pozitivni korelaciji z diferenciacijo tumorja (p = 0,001) (slika 2). Medtem pa je GCRG213p izraz povezana z razvrstitvijo Lauren (p < 0,05). Odstotek pozitivnih GCRG213p obarvanja v stari skupini (> = 65 yr) je bila višja kot v skupini, ki niso stari (< 65 yr) (60/71 = 84,51% v primerjavi z 73/104 = 70,19%, p < 0,05). Vendar GCRG213p izraz ni bilo ugotovljeno, da je povezana z drugimi clinicopathological parametrov, kot so tisti, navedeni v tabeli 1 (p > 0,05). Pri 67 bolnikih s tako primarnega tumorja in bezgavk metastaznih tumorskih vzorcev, GCRG213p je bil pozitiven v 51 bezgavko metastazami osebkov in 52 primarnih tumorskih vzorcev (76,12% v primerjavi s 77,61%), v tem zaporedju, kar pomeni, da povišana GCRG213p izraz v bezgavk metastatskim tumor je skladnih s GCRG213p izražanja v primarnega raka želodca. GCRG213p izraz v bezgavkah je bilo povezano tudi z ocenami diferenciacije tumorja (p = 0,015), ne pa tudi z drugimi clinicopathological parametrov (p > 0,05). Slika 2 Korelacija GCRG213p imunskim barvanjem rezultat v primarnim rakom želodca z diferenciacijo tumorja. Skupna ocena (OS) z imunskim barvanjem višja pri raku dobro diferenciranim, kot da je v slabem diferenciranih (p = 0,001).
Razmerje GCRG213 izražanja s preživetjem
Nadaljnje informacije so na voljo na 175 rakom želodca bolnikov za obdobja od 18 mesecev do 14 let. Splošne stopnje preživetja, so naslednji: 91.42% (1 leto), 78.28 %% (2 leti), 56.57% (3 leta), 39.43% (4 leta) in 23,43% (5 let). Stopnja Mediano preživetje je 41 mesecev.
Na GCRG213p izražanja v primarnih tumorjev, ni bilo značilnih razlik v preživetju med bolniki v GCRG213p negativni kategoriji v primerjavi z GCRG213 pozitivno kategorije (X
2
= 2,072, p = 0,558). Prav tako niso opazili korelacijo med GCRG213p izražanja v bezgavkah metastaz in preživetje (X
2
= 3,272, p = 0,195).
GCRG213p izražanje pri malignih in normalnih želodčne sluznice celičnih linij
Western blotting teste smo izvedli na želodcu rakavih celicah, vključno SGC-7901, BGC-823 in ne-maligne želodčne sluznice celične linije GES-1, da bi nadalje preverili diferencialne ekspresije GCRG213p. so bile ugotovljene Beljakovinski pasovi okoli 35 kDa. Tri celične linije testirani izrazil GCRG213p na različnih ravneh. Stopnja GCRG213p je bila višja v linijah rakavih celic kot v GES-1 (slika 3). Ta ugotovitev se ujema z rezultatom IHC poročali v tej študiji, se pravi, GCRG213p bilo ugotovljeno, izraženi pri raku želodca. Slika 3 blot analiza Western ekstrakta celotnega celic iz želodca malignih in brez malignih celic, ki uporabljajo anti-GCRG213p protitelesa. Celice izražajo GCRG213p s beljakovin pasovih 35-kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. Filter je reprobed z anti-beta-aktina protitelesa za nadzor za enako nakladanje (spodnja slika).
Metilacije specifične PCR analizo LINE-1
metilacije specifične PCR (PPN) je bilo opravljenih analiz na želodčnih rakave celice in ne-maligne želodčni sluznični celične linije GES-1, da bi preverili stanje metilacijskega L1 promotor v teh celičnih linij. Poleg želodčnih raka celičnih linij SGC-7901 in BGC-823, smo raziskali tudi želodčni rak celičnimi linijami MGC-823, za namen zagotavljanja več informacij o L1 metilacije v želodcu raka celičnih linijah. Izdelke PCR, pomnoženi z metilnim specifičnih oligonukleotidov (MSPM) in nemetiliran specifičnih oligonukleotidov (MSPU) so bili s 116 bp in 111-bp oz. V ges-1 celic, je bil produkt PCR pomnožili s MSPM, vendar ne z MSPU, kar pomeni, da predlagatelji L1 v celicah GES-1 doživel popolno metilacije; V SGC-7901 celic, BGC-823 celic in MGC-803 celic, se lahko ustrezne pasovih je treba dopolniti z obema MSPM in MSPU, kažejo delni metilacije (slika 4). Slika 4 PCR (MSP) analiza metilacije specifična LINE-1. Agaroznega gela elektroforeza PPN izdelkov. M: izdelek pomnožili s metiliran specifične sesalno; U: izdelek pomnožili s nemetiliran-specifični primer. PC: pozitivna kontrola, standardni človek metilnega DNA; W: dvakrat destilirano nadzor nad vodo. Upoštevajte, da vzorci GES-1 kažejo zgolj metiliranih PCR izdelke, medtem ko je MGC-803, SGC-7901 in BGC-823 vzorci kažejo tako metiliranih in nemetilirane PCR produkte.
Bioinformatika identifikacijo GCRG213p kot član L1-EN družine
BLASTP program za analizo, kot je navedeno zgoraj, je pokazala, da GCRG213p peptid delijo 83,0% uskladitev s C-terminalne regije L1-EN. Ohranjeni Domain Iskanje po GCRG213p zaporedje v bazi podatkov ohranjeni domena NCBI idealno velik eksonukleazna /endonukleazno /fosfataza (EEP) superdružine, vključno endonukleazo domeni niso LTR retrotransposon LINE-1, eksonukleaza III (ExoIII) -Kot apurinic /apyrimidinic ( AP) endonukleazami, itd
nadaljnja analiza z uporabo BLASTP kaže, da so v GCRG213p zaporedju nekaj ostankov, ki so pomembni za ohranjenih lastnosti L1-EN, kot domnevni fosfat vezavno mesto [ionska vezave mestu] (Y115 /N145 /H230), domnevni metal vezavno mesto [ion vezavno mesto] (D229) in domnevni katalitsko site [aktivno mesto] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (slika 5). Slika 5 Uskladitev GCRG213p in L1-SL. Red pisava predstavlja visoko soglasje, modro ali črno pisavo predstavlja nizko soglasje. GCRG213p vsebuje ostanke (arrowed), ki so pomembni za dejavnost endonukleazo L1-EN.
Pogovor
Jasno je, da je prišlo do L1 retrotransposition dogodki v somatskih in zarodnih celicah. Kljub dejstvu, da se celotna dolžina L1 mRNA zagotovo glavni vir L1 retrotransposition, endogeni L1 ORF2 spoj variante s potencialno biološko ustreznost so, izražene v različnih somatskih tkivih. Belancio itd [20] odkrijejo SpORF2 prepis v različnih odraslih človeških tkiv in izraz SpORF2 mRNA kaže spremembo tkiva specifične. Tako je funkcija L1 verjetno ne bo mogoče omejiti le v celoti aktivnih elementov. SpORF2 lahko proizvajajo tudi funkcionalno ORF2 beljakovin. Večina ne-LTR retrotransposons so APE tipa non-LTR retrotransposons [29]. Kristalno strukturo analize človeškega L1-EN kažejo, da je prototip AP podobne retrotransposon kodiran endonukleazami, ki nick DNK s spremenljivo specifičnost in so odgovorne za milijone retrotransposon vstavki v evkariontskih genomov [30]. Oba APE1 in L1-SL pripadajo veliki EEP naddružine, ki si deli isti beljakovin oder in iste katalitične ostanke.
Glede na dejstvo, da delnice GCRG213p visoko poravnav zaporedij z L1-EN in ima ohranjene ostanke, ki so ključnega pomena za L1 vezavo, kovinske zavezujoča in katalitična aktivnost -SL fosfat, predlagamo, da je GCRG213 spojeni L1-ORF2. GCRG213p je lahko funkcionalno član L1-EN družine, različica L1-EN.
Čezmernim L1 v tumorjih je pogosto predstavljen [12-14]. Celični endogeni L1-RT izkaže kot konstitutivni funkcionalne komponente v tumorogenih celicah značilna visoka orožja in nizkim statusom diferenciacija [31, 32]. Vendar pa obstaja nekaj podrobne raziskave L1-EN v človeški tumor. Ergun itd uporabljajo anti-L1-EN protitelesa za odkrivanje L1-ORF2 pri odraslih človeških tkiv, so našli veliko ORF2p izraz v endotelijskih celicah žil v normalne človeške prostate, sečnega mehurja in testisov tkiva, vendar ne ORF2p izraz so opazili pri rakave celice študiral [33]. Oricchio itd [34] so poročali, da bi lahko stabilno L1 RNA interferenca zmanjša proliferacijo in spodbuja diferenciacijo v A-375 celice melanoma. Prav tako opazili so zmanjšanje L1-ORF2 beljakovin. Toda raziskovalci niso opredeljene, ali so bili učinki orožja iz L1-EN in /ali L1-RT. Do danes, je dalo o vlogi L1-EN na celično proliferacijo in diferenciacijo nobeno poročilo. V tej študiji smo ponovno potrdili, da je bila GCRG213p izraz povišano raka želodca na ravni beljakovin, tako v celičnem modelu in odseki tkiva študiral, ki je v skladu z našimi prejšnjimi rezultati študije na ravni mRNA [22]. L1 opraviti hipometilacije v različnih tumorskih tkiv, vključno z rakom želodca [35]. Shigaki itd [36] uporabijo bisulfita pyrosequencing tehnologijo količinsko stanje L1 metilacijski v reseciranih želodčnih vzorcih raka. Ugotovili so, da imajo bolniki doživel L1 Hipometilacija doživela bistveno krajši skupno preživetje kot tisti z hypermethylation. Našli smo v tej študiji so bili L1 popolnoma metiliran v normalnem želodčna sluznica celične linije GES-1, vendar je bila delno metiliramo v želodčnih raka celičnih linijah. Ti rezultati korelaciji s GCRG213p izrazom vzorcem želodčnega raka celičnih linij, s čimer zagotavljajo več dokazov o naravi GCRG213 peptida. Vendar pa nismo mogli ugotoviti povezavo med GCRG213p izražanja in preživetje v tej študiji. Intraepitelijska neoplazije je verjel, da je ključni korak za maligno transformacijo adenokarcinomom želodca, čezmernim GCRG213p v teh žlez pomenila potencialno vlogo GCRG213p v želodcu onkogenezo. Rezultat Visoka imunskim barvanjem GCRG213p v dobro diferenciranega raka želodca, je pokazala, da bi lahko bil vključen v želodcu diferenciacije raka.
Medtem ko je kronični atrofični gastritis verjel, da je subjekt, povezanih s staranjem prebivalstva, je črevesna metaplazija šteje kot dokaz atrofični gastritis, saj specializirane žleze je nadomestila črevesnih grobnicah, tako da je črevesna metaplazijo štejejo, povezane s starostjo. Starost igra pomemben dejavnik, ki ureja razvoj želodčne intestinalno metaplazijo in predmetov z želodčnih intestinalno metaplazijo bili precej starejši od tistih brez metaplazijo [37]. Intestinalno metaplazijo žleze prikaže obsežno GCRG213p imunskim barvanjem v tej študiji. Medtem, smo ugotovili, da je bila pozitivna stopnja GCRG213p v želodčnih tkivih raka v starih skupini višja kot v skupini, ki niso stare. To bi lahko pomenilo, da GCRG213p je povezana z želodčno staranjem sluznice in subjektov, povezanih s staranjem. Ni študija o povezavi med L1 izražanja in starosti na sedanjost, ampak povprečna L1 metilacija ne spreminja s časom [38, 39]. Menijo, da lahko nicking genomske DNA, ki ga je L1-EN povzroči toksičnost celic, kar ima za posledico celičnega cikla prijetje, apoptoza ali staranje. Izražanje eksogeni polne dolžine L1 in SpORF2 v normalni človeški fibroblasti, rakave celice in odrasle izvorne celice so povzročile zaznavne poškodbe DNK in povzročilo staranje, kot fenotip [20]. Tako, sumimo, da lahko nabrali dejavnost GCRG213p, različico L1-EN, predstavljajo potencialni vir za povezanih s staranjem prebivalstva celične transformacije, ki v končni fazi prispeva k celično staranje, ali nasprotno, na out-of-nadzorovano (maligne) Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• uživanje alkohola in tveganje za raka želodca: študija kohorte moških v Kaunas, Litva, z do 30 letih spremljanja up
• Indukcija kromosomsko nestabilnost in raka na želodcu, ki ga spreminja izraz vzorec mitotićnih kontrolnih točkah genov pri miših izpostavljenih AREKA-nut