Kifejezése egy LINE-1 endonukleáz variáns gyomorrák: a szövetség a klinikopatológiai parameters

kifejezése egy LINE-1 endonukleáz variáns gyomorrák: a szövetség a klinikopatológiai paraméterek katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa Long tarkított nukleáris elemet- 1 (LINE-1 vagy L1), a leggyakoribb, és csak autonóm aktív család nem-LTR transzpozonok a humán genomban, ami nemcsak a csíra vonal, hanem a szomatikus szövetekben. Hozzájárul a genetikai instabilitás, öregedés, és a korral összefüggő betegségek, mint például a rák. Korábbi vizsgálatunkban azonosított humán gyomor adenokarcinóma egy serkentett átirat GCRG213, amely megosztott 88% -os homológiát mutat a humán L1 szekvenciát, és tartalmazott egy feltételezett konzervált apurinic /apyrimidinic endonucleas1 domén.
Módszerek
Immunhisztokémiai végezzük monoklonális egér anti humán GCRG213 protein (GCRG213p) antitestet a laboratóriumunkban, tissue microarray épített példányok 175 gyomor adenokarcinóma betegek. A korreláció GCRG213p kifejezés és a beteg klinikopatológiai paraméterek értékelték. GCRG213p expresszió gyomor rákos sejtvonalak alkalmazásával vizsgáltuk Western blot analízis. L1 promóter metilációs állapotát gyomorrák-sejtek alkalmazásával teszteltük metiláció-specifikus PCR-rel. BLASTP használtunk a NCBI robbanás szerver azonosítani GCRG213p szekvencia bármely nyomvonalakat a Protein Data Bank adatbázisokban.
Eredménye
legfeljebb általános gyomorrák, nyirokcsomó-metasztázisok és a gyomor bél metaplázia mirigyek mutatott pozitív GCRG213p immunreaktivitást. Nagy GCRG213p immunfestés pontszám az elsődleges gyomorrák pozitív korrelációt mutatott a tumor differenciálás (jól differenciált, p = 0,001), Lauren besorolás (bél típusú, p < 0,05) és a késői korban kialakuló gyomor adenokarcinóma (≥65 év; p <0,05). GCRG213p kifejezés nincs kapcsolata más klinikopatológiai paraméterek, beleértve a túlélést. Western blot analízise GCRG213p kifejezés a gyomorrák sejtek jelezte, hogy GCRG213p szint magasabb volt a gyomorrák-sejtvonalak, mint a normál humán gyomornyálkahártya immortalizált sejtvonal GES-1. Részleges metilezése L1 gyomor rákos sejtekben igazoltuk metiláció-specifikus PCR-rel. BLASTP program elemzése feltárta, hogy GCRG213p peptid megosztott 83,0% igazodás a C-terminális régiójában az L1 endonukleázzal (L1-EN). GCRG213p sorrend rendelkezik a fontos aminosavak alkotó konzervált jellemzői L1-EN. Katalógusa Következtetések katalógusa GCRG213p lehet egy változata L1-EN, funkcionális tagja az L1-EN család. Túlexpressziója GCRG213p gyakori mind az elsődleges gyomorrák és a nyirokcsomó áttétek. Ezek az eredmények bizonyítják, szomatikus L1 kifejezés a gyomorrák, és annak lehetséges következményeit formájában tumor. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa gyomorrák Long tarkított nukleáris elem-1 endonukleáz GCRG213 fehérje szöveti microarray Háttér katalógusa Long tarkított nukleáris elem -1 (LINE-1 vagy L1) a leggyakoribb, és csak autonóm aktív család nem-LTR transzpozonok a humán genomban, és tartalmaz mintegy 17% -a az emberi genom [1]. A túlnyomó többsége, mintegy 500.000 példány összesen L1 a humán genomban nem képesek az átültetés saját miatt különböző mechanizmusok, mint a csonkolás és inaktiváló mutációk. Azonban, a becslések szerint 80-100 teljes hosszúságú, retrotransposition illetékes L1S (RC-L1S) van jelen, egy tipikus diploid humán genom, és egy kis számú, úgynevezett "forró L1S" nagyhozzáadott retrotransposition hatékonyság [2].
Emberi RC-L1S mintegy 6,5 kb és kódolja két fehérje (ORF1p és ORF2p) szükséges retrotransposition [3]. ORF1p egy 40 kDa fehérje, RNS-kötő [4] és nukleinsav chaperone tevékenységek [5]. ORF2p egy 150 kDa-os fehérje endonukleázzal (L1-EN) [6] és a reverz transzkriptáz (L1-RT) [7] tevékenységét. L1 elem lehet integrálni több százezer genomiális helyeken, egy lazán meghatározott konszenzus hely (5'-TTTT /AA-3 '), amely rovátkolt L1-EN [8]. A fogadó korlátozza a terjedését ilyen elemek transzkripciós és poszttranszkripciós silencing mechanizmusok, amelyek csökkentik a tevékenység tolerálható szinten [9].
L1 kifejezve nem csak a csíra vonal, hanem a szomatikus szövetekben. Azt javasolják, hogy még alacsony szintű szomatikus DNS-károsodás miatt L1 aktivitás rendelkeznek azzal a potenciállal, hogy hozzájáruljon a genetikai instabilitás, öregedés, és a korral összefüggő betegségek, mint a rák [10, 11]. L1-ORF1 és ORF2 arra serkentett a különböző rosszindulatú daganatok, például emlőrák, hasnyálmirigyrák és rosszindulatú csírasejt daganatok, stb [12-14]. L1 hipometiláció volt megfigyelhető a különböző rosszindulatú daganatok, mint például fej és nyak, nyelőcső és a gyomor rák, és premalignus léziók [15, 16]. A mértéke L1 hipometiláció is társul egy előrehaladott szakaszában, és rosszabb prognózist [17, 18]. Katalógusa L1-indukált befolyás sejtekhez nem valószínű korlátozódik csak a teljesen aktív elemei. Még L1 elemek hibás ORF1 kódoló régiók tehetik egy RNS kötések kifejezni funkcionális ORF2 számos negatív következményekkel jár a sejt [19]. Sok szövetek előállítására fordítható lapolva ORF2 (SpORF2) átirata [20]. Egy lapolva L1 transzkriptum, amely magában foglalja integránst reverz transzkriptáz szekvenciáját ORF2, kiderült, hogy esszenciális az emberi hepatoma sejtek proliferációját [21].
Korábbi vizsgálatunkban [22] azonosítottak egy serkentett átirat, elemzi gyomorrák kapcsolódó gén 213 (GCRG213) , az emberi gyomor adenokarcinóma. BLAST elemzés GCRG213 megadott sorrendben 88% homológiát mutat a humán LI és kiderült, egy feltételezett konzervált domén, apurinic /apyrimidinic endonucleas1 (APE), a GCRG213-ORF. A legújabb keresés a frissített GenBank adatbázis szerint GCRG213-ORF tartalmaz L1-EN konzervált domén. Ezen dokumentumban a jelenlegi tanulmány, amely megerősítette a GCRG213 protein (GCRG213p) kifejezés a gyomorrák sejtvonalakon monoklonális egér anti-GCRG213p antitest a laboratóriumunkban (geriátriai Intézet, Kína PLA General Hospital, Peking, Kína). Továbbá, immunhisztokémiai (IHC) alkalmazott szövet mikroarray (TMA) alkalmaztunk, hogy értékelje GCRG213p expresszió gyomorrák és a normál gyomor nyálkahártyáját. További elemzéseket végeztünk, hogy lássa, van-e összefüggés GCRG213p kifejezés és klinikopatológiai paraméterek és a túlélés. Katalógusa Módszerek katalógusa Betegek katalógusa átesett betegek gastrectomián gyomorrák a PLA General Hospital, Beijing, China 1991-2003 tartották jelöltek ebben a vizsgálatban. A mintavételi kritériumok a következők voltak: nem (hímek és nőstények), az életkor (20 éves vagy idősebb); újonnan diagnosztizált (esemény) gyomorkarcinómát előzetes kezelés nélkül; diagnózis szövettanilag igazolt; paraffinba ágyazott tumor, párosítva a környező, nem daganatos szövetekben gyomornyálkahártya áll rendelkezésre, carcinoma áttétes nyirokcsomó, ha lehetséges; és a pozitív nyomon követés eredményeit idején a TMA konstrukció. Ennek eredményeként 175 esetben vettek ebben a vizsgálatban, amely a 144 férfi és 31 nő (27 ~ 84 év, átlag = 58,58 év). Közülük hatvanhét esetek carcinoma kísért nyirokcsomó áttétek, és hat esetben a formalin-fixált, paraffinba ágyazott normál gyomor szöveteket is nyert nem-daganatos betegek, akik műtétre, mert a jóindulatú gyomorfekély betegség.
Demográfiai , az életmód és a klinikopatológiai adatok a minta esetek az 1. táblázatban látható összes daganatok sorolták, és színre szerint felülvizsgált iránymutatások által támogatott Nemzetközi Rákellenes Unió. A követési történő értékelésére legújabb körülmények által 2005-ben történő egyeztetés esetén dokumentumokat vagy telefonhívást a betegek (vagy családtagok, vagy háziorvosok). A minimális 18 havonta fogadták, és a medián követési idő a betegek, akik még életben voltak a 2005 végén 46 hónap (tartomány volt a minimum 18 a maximum 129 hónap). Túlélési időt attól a naptól számítják a műtét a halál időpontját, illetve a dátum utolsó ismert alive.Table 1 Klinikopatológiai paraméterei gyomorrákos betegek vizsgált szövet microarray Matton N (%) Matton GCRG213p negatív Matton GCRG213p pozitív Matton P érték
Gender katalógusa Férfi katalógusa 144 (82,28%) hotelben 31 katalógusa 113 katalógusa 0,111
női katalógusa 31 (17,72%) hotelben 11 katalógusa 20 katalógusa Age katalógusa < 65 év katalógusa 104 (59,43%) hotelben 31 katalógusa 73 katalógusa 0,029
≥65 év katalógusa 71 (40,57%) hotelben 11 katalógusa 60 katalógusa Dohányzás katalógusa Igen
45 (27,27%) hotelben 7 katalógusa 38 katalógusa 0,278
Nem katalógusa 120 (72,73%) hotelben 30 katalógusa 90 katalógusa Alkohol
Igen
28 (16,97%) hotelben 2 | 26 katalógusa 0.060 katalógusa nem katalógusa 137 (83,03%) hotelben 35 katalógusa 102 katalógusa családi története tumor katalógusa Igen
14 (8,43%) hotelben 2 | 12 katalógusa 0,639
Nem katalógusa 152 (91,57%) hotelben 36 katalógusa 116 katalógusa tumor helyét katalógusa Szívbetegségek katalógusa 48 (27,43%) hotelben 8 katalógusa 40 katalógusa 0.360 katalógusa Body katalógusa 37 (21,14%) hotelben 10 katalógusa 27 katalógusa Antrum katalógusa 90 (51,43%) hotelben 24 katalógusa 66 katalógusa daganat mérete (cm) hotelben ≤1 katalógusa 11 (6,29%) hotelben 3 katalógusa 8 katalógusa 0.506 katalógusa 1-3 katalógusa 42 (24,00%) hotelben 13 katalógusa 29 katalógusa > 3
122 (69,71%) hotelben 26 katalógusa 96 katalógusa mélysége invázió katalógusa T1 katalógusa 46 (26,28%) hotelben 12 katalógusa 34 katalógusa 0,635 katalógusa T2
21 (12,00%) hotelben 7 katalógusa 14
T3 katalógusa 33 (18,86%) hotelben 6 katalógusa 27 katalógusa T4 katalógusa 75 (42,86%) hotelben 17 katalógusa 58
nyirokcsomó folyamatok katalógusa Igen
75 (42,86%) hotelben 16 katalógusa 59 katalógusa 0.592 katalógusa No katalógusa 100 (57,14%) hotelben 26 katalógusa 74
osztályzata tumor differenciálás katalógusa Well katalógusa 10 (5,71%) hotelben 0 katalógusa 10 katalógusa 0.001 katalógusa Mérsékelt katalógusa 40 (22,86%) hotelben 4 katalógusa 36 katalógusa Gyenge katalógusa 103 (58,86%) hotelben 27 katalógusa 76 katalógusa pecsétgyűrű sejtes katalógusa 22 (12,57%) hotelben 11 katalógusa 11 katalógusa Tumor stádium (TNM) hotelben 0 katalógusa 21 (12,00%) hotelben 3 katalógusa 18 katalógusa 0,217 katalógusa Ia
14 (8,00%) hotelben 6 katalógusa 8
Ib
41 (23,43%) hotelben 10 katalógusa 31 katalógusa II katalógusa 60 (34,29%) hotelben 17 katalógusa 43 katalógusa IIIa katalógusa 39 (22,28% ) hotelben 6 katalógusa 33 katalógusa Lauren besorolás katalógusa intesztinális típusú katalógusa 153 (87,43%) hotelben 31 katalógusa 122 katalógusa 0.015 katalógusa diffúz típusú katalógusa 22 (12,57 %) hotelben 11 katalógusa 11 katalógusa reszekciós katalógusa Presence katalógusa 6 (3,43%) hotelben 0 katalógusa 6 katalógusa 0,361 katalógusa hiánya katalógusa 169 (96,57% ) hotelben 42 katalógusa 127 katalógusa microvascularis invázió katalógusa Presence katalógusa 20 (11,43%) hotelben 5 katalógusa 15 katalógusa 0,911 katalógusa hiánya katalógusa 155 (88,57%) katalógusa 37
118 katalógusa állapota katalógusa életben katalógusa 121 (71,18%) hotelben 30 katalógusa 91 katalógusa 0.483 katalógusa halott katalógusa 49 (28,82%)
9 katalógusa 40 katalógusa 5 éves túlélés katalógusa < 5 év katalógusa 47 (43,93%) hotelben 12 katalógusa 48 katalógusa 0.871 katalógusa > = 5 év katalógusa 60 (50,07%) hotelben 10 katalógusa 37 katalógusa engedélyt adtak az etikai bizottság a PLA General Hospital, Peking, Kína használja a szövetet, és az adatokat a projekthez. Beleegyező nyilatkozatot is kapott a betegektől. Katalógusa Tissue microarray építése, GCRG213p immunhisztokémiai festéssel és értékelési katalógusa A szöveti microarray (TMA) épültek a korábban leírtak szerint [23]. A mintákat álló, hat szövet array blokkokat készítettünk, amelyek mindegyike 30 esetben a tumor, a normál és a nyirokcsomó szövetek, ha elérhető.
Antigén-visszanyerés TMA csúszdák, és formalin-fixált, paraffinba ágyazott szöveti metszeteket által végzett nyomás tűzhely kezelés 10 percig egy antigén visszakeresés oldatot (10 mmol /l nátrium-citrát-puffer, pH = 6,0). A monoklonális egér antihumán GCRG213p ellenanyag, amelyre már a laboratóriumunkban [24], adunk hígításban 1: 200, és inkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A lemezeket ezután 1 órán át inkubáltuk a másodlagos antitesttel. Envision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) használtunk a láthatóvá ellenanyag-kötődés, és metszeteket ezt követően hematoxilinnel ellenfestettük. Egy PBS-sel csak festéssel a mintát használjuk, mint a háttér kontroll.
Specifikus sárgásbarna immunfestés GCRG213p kizárólagosan található a citoplazmában. Azt szerzett önállóan és vak módszerrel két kutató (GJ és XL). Az inter-observer nézeteltérések (körülbelül 6% -át eset) felül egy második időt, majd a döntő ítéletet mindkét megfigyelők. Formai pontozási később elvégzett egy nyomozó (WG). A festés intenzitását minősíteni 0 (hiányzik), 1 (gyenge), 2 (közepes) és 3 (erős). A százalékos pozitívan festődő sejtek pontoztuk, mint 0 (0% pozitív), 1 (1-30%), 2 (31-60%), és a 3. (> 60%). Kombinált értékeli a festés intenzitása és kiterjedése használtuk a GCRG213p kifejezést. A minimális pontszám amikor összegezte (intenzitás + mellék) 0 és a maximális volt 6 [25]. Összpontszáma ≥2 tartották GCRG213p pozitív. Katalógusa Western blot analízis katalógusa Gyomorrák sejtvonalak beleértve SGC-7901, BGC-823 és a humán normál gyomornyálkahártya immortalizált sejtvonal GES-1 tenyésztünk, összegyűjtött és megbontjuk a RIPA pufferben, jégen, mielőtt alávetnénk Western-blot elemzéshez. A fehérje-koncentrációt által észlelt Bradford módszerrel BSA-val (Sigma-Aldrich), mint a standard. Egyenlő mennyiségű sejt-kivonat (40 pg) vetettük alá, 8% -os SDS-PAGE és polivinilidén-difluorid-membránra (Bio-Rad) az ellenanyag-blottal. A membránt ezután blokkolva, inkubáltuk egér anti-GCRG213p antitesttel (1: 500), 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd inkubáltuk tormaperoxidázzal konjugált másodlagos antitesttel 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A jel tettük egy kemilumineszcenciás kimutatási reagens. Az egér anti-β-aktin antitestet (1: 5000, Sigma) detektáltuk egyidejűleg mint terhelési kontrollként.
Kimutatása metilációs állapotát LINE-1 MSP
validálása LINE-1 metilációs állapotát végeztük metiláció-specifikus PCR (MSP). Teljes DNS-SGC-7901, BGC-823, MGC803 és GES-1-sejtek extraháljuk utasításai szerint a DNS-extrakciós reagenskészlet. A DNS-t biszulfit módosított korábban leírtak szerint [26] 16 órán át 50 ° C-on. Biszulfittal átalakított DNS PCR-rel amplifikáltuk Taq polimeráz felhasználásával (Invitrogen, USA). Primereket használjuk [27]: katalógusa Linea: metilálatlanok LINE-1 forward primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT; katalógusa LINEb: metilálatlanok LINE-1 reverz primer, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA; katalógusa LINEc: metilezendő LINE-1 forward primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
bélelt: metilezett LINE-1 reverz primert, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG.
PCR-amplifikáció körülményei a következők voltak: 4 ° C, 5 perc; 94 ° C-, 30s, 58 ° C-on, 45s, 72 ° C-on, 61s, 40 ciklus; 72 ° C, 10 perc. A kapott PCR-termékeket tettük láthatóvá egy 2% -os agaróz gélen. Denaturált DNS szabványok Zymo Research használtunk pozitív kontroll, kétszer desztillált vízben negatív kontrollként. Katalógusa szekvencia hasonlóság és konzervált domain keresés katalógusa PSI-Blast alkalmaztuk, az NCBI robbanás szerver [28] (keresés dátuma: 20 th január 2012) azonosítására GCRG213p szekvencia bármely nyomvonalakat a Protein Data Bank adatbázisok, beleértve az összes nem-redundáns GenBank CDS fordítások, PDB, Prot, PIR és PRF. Ez történt, a szokásos kezdő BLASTP keresést.
Statisztikai analízis katalógusa Chi-négyzet teszt vagy Fisher-féle egzakt valószínűsége alkalmaztuk, hogy értékelje a kapcsolatát GCRG213p kifejezés klinikopatológiai paramétereivel. A teljes túlélés megvizsgálta GCRG213p kifejezést Kaplan-Meier görbék. Minden p értékeket kétoldalú és statisztikailag szignifikánsnak, ha p < 0.05. Statisztikai analízist végeztünk SPSS 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Eredmények
GCRG213p expressziós mintázatok normál gyomornyálkahártya és gyomor adenokarcinóma
Distinct GCRG213p volt festődés primer gyomor adenokarcinómák, nyirok áttét tumorok, és a nem-tumoros gyomornyálkahártya (1. ábra). A nem-daganatos gyomornyálkahártya származó esopheageal-gyomor csomópont és antrum terület, a citoplazma a differenciált felszíni epitélium és nyálkahártya mirigyeket mutatott negatív festéssel, de pozitív GCRG213p festődés volt megfigyelhető a bazális membrán a normál mirigyek. 133 175 primer gyomor adenokarcinómák, és 51 67 tumorok metasztatikus, hogy nyirokcsomó mutatott pozitív GCRG213p immunreaktivitást, ami volt található, a citoplazma a karcinóma sejtekhez. 1. ábra GCRG213p expresszió emberi malignus és nem malignus gyomor nyálkahártyáját. Mindkét (A) primer gyomor adenokarcinóma (100 ×) és (B) adenocarcinoma betört a nyirokcsomó (100 ×) mutatott pozitív GCRG213p stainging a citoplazmában; (A ") és (b ') igazolták a magasabb nagyítás (400 ×) a terület (A) és (B). (C) A nem-malignus gyomor epitélium, pozitív festődés volt megfigyelhető a bazális membrán, de nem a citoplazmában; GCRG213p immunreaktivitás volt kimutatható a citoplazmában a gyomor bél metaplázia mirigyek (nyíllal jelezve), (100 ×); (C) igazolták a nagy nagyítású (400 ×) a terület (C). Katalógusa szerint Lauren besorolás, gyomorrák van osztva két szövettani típusok: bél típusú vagy diffúz típusú. Van 153 bél típusú esetekben és 22 diffúz-Tye esetekben ebben a vizsgálatban. Között 153 bél típusú esetek 34 intestinalis metaplasia és 28 intraepithelialis neoplasia mintákat adjecent a rák azonosítottak. Az életkor (év, átlag ± SD), a bél típusú csoport az intestinalis metaplasia (59,67 ± 12,30) volt idősebb, mint a diffúz típusú csoport (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 34 intestinalis metaplasia, és 27 28 alacsony /magas minőségű intraepithelialis neoplasia megmutatta GCRG213p immunreaktivitást. A legtöbb pozitív esetek mutatott enyhe vagy mérsékelt festés (2. táblázat) .table 2 GCRG213 kifejezés a gyomor szöveti mintákat katalógusa Csoportok
száma
GCRG213 kifejezés Matton összpontszáma ‡ Matton PR§ (%)
0-1 Matton 2-3 Matton 4-5 katalógusa
6
nem tumoros gyomor hámban katalógusa 112 katalógusa 112 katalógusa 0 katalógusa 0 katalógusa 0 katalógusa 0.00 katalógusa intestinalis metaplasia katalógusa 34
3 katalógusa 18 katalógusa 11 katalógusa 2 | 91,18 * katalógusa alacsony /magas minőségű intraepithelialis neoplasia katalógusa 28 katalógusa 1 katalógusa 17 katalógusa 10 katalógusa 0 katalógusa 96,43 * katalógusa adenokarcinóma nélkül LNM † katalógusa 100 katalógusa 26 katalógusa 50 katalógusa 21 katalógusa 3 katalógusa 74.00 * katalógusa adenocarcinoma LNM
75
16 katalógusa 40 katalógusa 16
3 katalógusa 78,67 * katalógusa tumor áttétes nyirokcsomó katalógusa 67 katalógusa 16 katalógusa 42 katalógusa 8 katalógusa 1 katalógusa 76.12 * katalógusa † LNM katalógusa nyirokcsomó metasztázis; ‡ összpontszáma kiszámítani (intenzitás pontszám) és (pozitív sejtek százalékos arányát score) leírt módszerek; §PR katalógusa pozitív arány. Katalógusa * Összehasonlítva a nem daganatos gyomornyálkahártya, p < 0.001.
Közötti társulás GCRG213 expresszió és a klinikopatológiai paraméterek katalógusa Nagy GCRG213p immunfesté pontszám az elsődleges gyomorrák pozitív korrelációt mutatott a tumor differenciálás (p = 0,001) (2. ábra). Eközben GCRG213p expresszió korrelált Lauren besorolás (p < 0,05). A százalékos pozitív GCRG213p festődés öregített csoport (> = 65 év) magasabb volt, mint a nem-idős csoport (< 65 év) (60/71 = 84,51% vs. 73/104 = 70.19%, p < 0,05). Azonban GCRG213p expresszió nem találtuk, hogy kapcsolatos más klinikopatológiai szereplő paraméterek az 1. táblázatban felsorolt ​​(p 0,05). A 67 beteg mind a primer tumor és nyirokcsomó metasztatikus tumor minták, GCRG213p pozitív volt 51 nyirokcsomó-metasztázis példányok és 52 primer tumor minták (76,12% vs. 77,61%), illetve, amely jelzi, hogy az emelkedett GCRG213p expressziót nyirokcsomó metasztatikus tumor egybevágó GCRG213p expressziója primer gyomorrák. GCRG213p expresszió nyirokcsomó-metasztázisok is társult fokozat a tumor differenciálódásának (p = 0,015), de nem más klinikopatológiai paraméterekkel (p 0,05). 2. ábra korrelációja GCRG213p immunfestésével pontszám az elsődleges gyomorrák tumor differenciálás. Összességében Score (OS) immunfestés magasabb a jól differenciált rák, mint a szegény differenciált (p = 0,001). Katalógusa kapcsolata GCRG213 kifejezés túlélés katalógusa nyomon követése volt információ 175 gyomorrák betegek időszakokra kezdve 18 hónap és 14 év közötti. A teljes túlélési arányok a következők: 91,42% (1 év), 78,28 %% (2 év), 56,57% (3 év), 39,43% (4 év), és 23,43% (5 év). A medián túlélési ráta 41 hónappal.
Alapján GCRG213p expressziója primer tumorok, nem volt szignifikáns különbség a túlélés között beteg a GCRG213p negatív kategóriába összehasonlítva a GCRG213 pozitív kategória (X
2
= 2,072, p = 0,558). Hasonlóan nem figyeltek meg korrelációt GCRG213p kifejezést nyirokcsomómetastasis és a túlélés (X katalógusa 2 | = 3,272, p = 0,195). Katalógusa GCRG213p kifejezést rosszindulatú és normál gyomornyálkahártya-sejtvonalak
Western blot vizsgálatokat végeztünk a gyomor rákos sejtek, beleértve a SGC-7901, BGC-823 és a nem malignus gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1, annak érdekében, hogy további érvényesítse a differenciális expressziója GCRG213p. Protein sávok körülbelül 35 kDa azonosítottunk. Három vizsgált sejtvonalban expresszált GCRG213p a különböző szinteken. GCRG213p szintet találtak magasabb a rákos sejtvonalak, mint a GES-1 (3. ábra). Ez a megállapítás megfelel a IHC eredményt jelentett ebben a tanulmányban, azaz GCRG213p mutattak túltermelõdik gyomorrák. 3. ábra Western-blot analízis A teljes sejt-kivonat gyomor malignus és nem malignus sejtek anti-GCRG213p antitest. A sejteket kifejezni GCRG213p a fehérje sávok 35 kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. A szűrőt újrapróbáztuk anti-β-aktin-antitestet, hogy ellenőrizzék egyenlő terhelés (alsó panel).
Metiiációspeeifikus PCR analízise LINE-1
metilezés-specifikus PCR (MSP) analízist végeztek gyomor rákos sejtek és nem-malignus gyomor nyálkahártya sejtvonal GES-1, annak érdekében, hogy teszteljék a L1 promóter metilációs állapotát ezen sejtvonalak. Eltekintve gyomor rákos sejtvonalak SGC-7901 és BGC-823, azt is vizsgáltuk gyomorrák sejtvonal MGC-823, a célból, hogy több információt arról, L1 metiláció gyomor rákos sejtvonalak. A PCR reakciókat denaturált-specifikus primerek (MSPM) és metilálatlanok-specifikus primerek (MSPU) volt 116 bp és 111 bp-os, ill. A GES-1 sejtek, PCR-terméket amplifikáltuk MSPM, de nem a MSPU, ami arra utal, hogy L1 promóterek GES-1 sejtekben ment teljes metilezés; Az SGC-7901 sejteket, BGC-823 sejtek és MGC-803 sejtek, a megfelelő sávokban is erősíthető mind MSPM és MSPU, jelzi a részleges metiláció (4. ábra). 4. ábra Methylation-specifikus PCR (MSP) elemzése LINE-1. Agarose gél elektroforézis MSP termékeket. M: amplifikált termék denaturált-specifikus primer; U: amplifikált termék a metilálatlanok-specifikus primer. PC: pozitív kontroll, az emberi denaturált DNS szabvány; W: Bideszt ellenőrzés. Megjegyezzük, hogy a GES-1 mintákat kizárólag mutatják metilezett PCR-termékek, míg az MGC-803, SGC-7901 és BGC-823 minták azt mutatják mind metilált és metilálatlan PCR-termékek.
Bioinformatikai azonosítása GCRG213p tagjaként L1-EN család
BLASTP program elemzése, mint már említettük, kiderült, hogy a GCRG213p peptid megosztott 83,0% igazodás a C-terminális régiójában az L1-EN. Konzervált domén keresése GCRG213p szekvencia konzervált tartomány adatbázis NCBI eltalálja a nagy exonukleáz /endonukleázzal /foszfatáz (EEP) szupercsalád, beleértve endonukleáz domain a nem-LTR retrotranszpozon LINE-1, exonukleáz III (ExoIII) -szerű apurinic /apyrimidinic ( AP) endonukleázokat stb
További elemzés segítségével BLASTP azt jelzi, hogy vannak GCRG213p szekvencia egyes maradékok, amelyek fontosak a konzervált jellemzői L1-EN, mint például a feltételezett foszfát kötőhely [ion kötőhely] (Y115 /N145 /H230), feltételezett fém kötőhelyet [ion kötőhely] (D229) és feltételezett katalitikus hely [aktív hely] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (5. ábra). 5. ábra összehangolása GCRG213p és L1-EN. Red font képvisel nagy egyetértés, kék vagy fekete betűk jelentése alacsony konszenzus. GCRG213p tartalmazott maradékok (nyíllal jelezve), amelyek fontosak a endonukleáz aktivitása L1-EN. Katalógusa Megbeszélés katalógusa Nyilvánvaló, hogy L1 retrotransposition események történtek a szomatikus és a csíra sejtekben. Annak ellenére, hogy a teljes hosszúságú L1 mRNS-ek minden bizonnyal a domináns forrása L1 retrotransposition, endogén L1 ORF2 hasítási variánsok potenciális biológiai vonatkozású találhatók kifejezve különböző szomatikus szövetekben. Belancio stb [20] kimutatható SpORF2 átirat különböző felnőtt emberi szövetek és kifejezése SpORF2 mRNS mutat szövet-specifikus variáció. Így L1 funkció nem valószínű, hogy az csak a teljesen aktív elemeket. A SpORF2 is hozhatnak funkcionális ORF2 protein. A legtöbb nem-LTR transzpozonok vannak APE-típusú, nem-LTR transzpozonok [29]. A kristályszerkezet elemzi az emberi L1-EN azt jelzik, hogy ez egy prototípus AP-szerű retrotranszpozon kódolt endonukleázok, amely Nick DNS változó specificitás és felelősek milliói retrotranszpozon inszerciók eukarióta genomok [30]. Mindkét APE1 és L1-EN tartozik a nagy EEP nagycsalád osztja ugyanazt a fehérjét állvány és az azonos katalitikus aminosavak.
Tekintettel arra, hogy GCRG213p részvények nagy szekvencia illesztések L1-EN, és rendelkezik konzervált aminosavakat, amelyek alapvető fontosságúak az L1 -H foszfátkötő, fém-kötő és katalitikus aktivitását, azt javasoljuk, hogy GCRG213 egy összeillesztett L1-ORF2. GCRG213p lehet egy funkcionális tagját L1-EN család, egy változata L1-EN.
A túlexpressziója L1 tumorok már széles körben ismertetik [12-14]. A sejtes endogén L1-RT emelkedik ki a konstitutív funkcionális komponens tumorképző sejtekkel jellemző a magas proliferáció és az alacsony differenciálódás állapot [31, 32]. Vannak azonban néhány részletes felmérések L1-EN humán tumor. Ergun stb használt anti-L1-EN antitest kimutatására a L1-ORF2 felnőtt humán szövetekben, azt találták, erős ORF2p expresszióját az endoteliális sejtekben lévő erek normális emberi prosztata, húgyhólyag és a here szövet, de nem ORF2p expresszió volt megfigyelhető a rákos sejtek vizsgálták [33]. Oricchio stb [34] számolt be, hogy stabil L1 RNS interferencia csökkentheti szaporodását és elősegíti differenciálódást A-375 melanoma sejtekben. Azt is megfigyelték, csökkentését L1-ORF2 protein. De a kutatók nem azonosították, hogy a proliferáció hatások az L1-EN és /vagy L1-RT. A mai napig nincs olyan jelentés megállapította a szerepe L1-EN sejt proliferációját és differenciálódását. Ebben a vizsgálatban azt megerősítette, hogy a GCRG213p expresszió emelkedett volt gyomorrák fehérje szinten, mind a sejt-modell és a szöveti metszeteken tanulmányozott, ami összhangban van a korábbi vizsgálatok eredményei mRNS-szinten [22]. L1 mennek hipometiláció a különböző tumoros szövetben, beleértve a gyomorrák [35]. Shigaki stb [36] használt hidrogén-szulfit-Pyrosequencing technológia számszerűsíteni L1 metilációs állapotát kimetszett gyomorrák példányok. Azt találták, hogy a betegek átesett L1 hipometiláció tapasztalt lényegesen rövidebb a teljes túlélés, mint a hipermetiláltsági. Azt találtuk, ebben a vizsgálatban, hogy L1 volt teljesen metilezett normál gyomornyálkahártya sejtvonal GES-1, de részlegesen metilált gyomorrákban sejtvonalakban. Ezek az eredmények korrelálnak a GCRG213p expressziós mintázatot gyomor rákos sejtvonalak, így, hogy több bizonyítékot a természet a GCRG213 peptid. Azonban, nem tudtunk azonosítani korrelációt GCRG213p expresszió és a túlélés ebben a vizsgálatban. Epitheliális neoplasia úgy vélik, hogy egy kulcsfontosságú lépés a malignus transzformáció a gyomor adenokarcinóma, overexpressziója GCRG213p ezekben mirigyek vélelmezett potenciális szerepét GCRG213p gyomor onkogenezis. A magas immunfestésével pontszáma GCRG213p jól differenciált gyomorrákban jelezte, hogy szerepe lehet a gyomorrák differenciálás. Katalógusa míg a krónikus sorvadásos gyomorhurut úgy vélik, hogy egy életkorhoz kapcsolódó entitás, intestinalis metaplasia ítélték bizonyíték atrófiás gastritis, mivel speciális mirigyek váltotta intestinalis kripták, így intestinalis metaplasia tekintették korral járó. Életkor játszik fontos tényező szabályozó fejlődését gyomor- bél metaplázia, és alanyok gyomor- bél metaplázia szignifikánsan idősebbek voltak, mint azok, anélkül, metaplázia [37]. Intesztinális metaplázia mirigyek jelenik kiterjedt GCRG213p immunfestés ebben a vizsgálatban. Közben megfigyeltük, hogy a pozitív arány GCRG213p gyomorkarcinómában szövetek a idős csoportban magasabb volt, mint a nem-idős csoport. Ezek lehetnek arra utalnak, hogy GCRG213p társított gyomornyálkahártya életkorfüggő kapcsolódó szervezetek. Nincs tanulmány a szövetség között L1 kifejezés és az életkor meg, de az átlagos L1 metilációs nem változnak az időben [38, 39]. Úgy tartják, hogy nicking genomiális DNS által az L1-EN indukálhat sejt toxicitás, ami a sejtciklus leállásához, apoptózis vagy öregedés. Expressziója exogén teljes hosszúságú L1 és SpORF2 a normál humán fibroblasztok, rákos sejteket, és a felnőtt őssejtek vezettek detektálható DNS-károsodás és ennek eredményeként a öregedés-szerű fenotípus [20]. Így azt gyanítja, hogy a felhalmozott aktivitása GCRG213p egy variánsa L1-EN, jelenthet potenciális forrása az életkorral összefüggő celluláris transzformáció, amely végül hozzájárul a sejt öregedés, vagy ellentétes, hogy egy out-of-vezérelt (malignus) Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Az alkoholfogyasztás és a kockázat a gyomorrák: a kohorsz vizsgálat férfiak Kaunas, Litvánia, akár 30 éves nyomon követés
• Indukciós kromoszóma instabilitás és a gyomorrák megváltoztatásával expressziós mintázata mitotikus ellenőrzőpont gének egerek kitett arékát-nut