Экспрессия эндонуклеазы варианта LINE-1 при раке желудка: его связь с клинико-патологическими parameters

экспрессии эндонуклеазы варианта LINE-1 при раке желудка: его связь с клинико-патологическими параметрами
Аннотация
фон
Long перемежаются ядерной элемент- 1 (LINE-1 или L1), наиболее распространенным и только автономно активного семейства не-LTR ретротранспозонов в геноме человека, выражалось не только в зародышевых линиях, но и в соматических тканях. Это способствует генетической нестабильности, старения и возрастных заболеваний, таких как рак. Наше предыдущее исследование выявило в аденокарциномы желудка человека активируемых транскрипт GCRG213, который разделил 88% гомологии с последовательностью L1 человека и содержала предполагаемую консервативную apurinic /apyrimidinic домен endonucleas1.
Методы
иммуногистохимии проводили с помощью анти моноклональное мыши -человеческий GCRG213 белок (GCRG213p) антитела, полученные в нашей лаборатории, на микрочипе ткани, построенной с образцами из 175 желудочных больных аденокарциномы. Корреляции между экспрессией GCRG213p и пациентов клинико-патологическими параметрами оценивали. экспрессия GCRG213p в желудочном линиях раковых клеток изучали методом Вестерн-блоттинга. L1 статус промотора метилирования клеток рака желудка была протестирована с помощью метилирования-специфической ПЦР. BLASTP был использован на сервере NCBI Blast, чтобы определить последовательность GCRG213p к любым створах в белке баз данных банка данных.
Результаты
Большинство первичного рака желудка, метастазов в лимфатических узлах и желудочно-кишечной метаплазии желез показали положительную GCRG213p иммунореактивности. Высокий GCRG213p иммунным счет в первичном раке желудка положительно коррелировал с дифференцировки опухоли (хорошо дифференцированная, р = 0,001), классификация Лорена (кишечного типа, р &ЛТ; 0,05) и поздний возраст начала аденокарциномы желудка (? 65 Yrs; р &л; 0,05). Выражение GCRG213p не имеет связи с другими клинико-патологическими параметрами, в том числе на выживание. Вестерн-блоттинг анализ экспрессии GCRG213p в клетках рака желудка показало, что уровень GCRG213p был выше в желудочных линиях раковых клеток, чем у человека нормального желудка эпителия увековечена клеточной линии GES-1. Частичное метилирование L1 в клеток рака желудка была подтверждена специфической в ​​отношении метилирования ПЦР. BLASTP программа анализа показали, что пептид GCRG213p разделяет 83,0% выравнивание с С-концевой области L1 эндонуклеазы (L1-EN). GCRG213p последовательность обладает важным остатки, которые составляют консервативные черты L1-EN.
Выводы
GCRG213p может быть вариантом L1-EN, функциональный член L1-EN семьи. Сверхэкспрессия GCRG213p распространена как в первичной рака желудка и метастазов в лимфатических узлах. Эти данные свидетельствуют о соматической экспрессии L1 при раке желудка и его потенциальные последствия в виде опухоли.
Ключевые слова
Желудочный рак Длинные перемежаются ядерного элемента-1 эндонуклеазой GCRG213 тканевого белка Microarray фон
Длинные перемежаются ядерный элемент -1 (LINE-1 или L1) является наиболее распространенным и только в автономном режиме активного семейства не-LTR ретротранспозонов в геноме человека и включает в себя около 17% генома человека [1]. Подавляющее большинство из примерно 500 тысяч полных копий L1 в геноме человека не способны транспозиции по собственному желанию из-за различных механизмов, таких как укорочения и инактивирующих мутаций. Тем не менее, по оценкам, 80-100 полнометражных, ретротранспозиции компетентные L1s (RC-L1s) присутствуют в типичном диплоидного генома человека, а также небольшое число, называемое "горячим L1s" демонстрируют высокую эффективность работы ретротранспозиции [2].
Human RC-L1s около 6,5 кб и кодируют два белка (ORF1p и ORF2p), необходимые для ретротранспозиции [3]. ORF1p представляет собой белок 40-кДа с РНК связывания [4] и деятельность нуклеиновой кислоты шаперонов [5]. ORF2p представляет собой белок 150-кД с эндонуклеазы (L1-EN) [6] и обратной транскриптазы (L1-RT) [7] деятельность. L1 элемент может интегрироваться в несколько сотен тысяч геномных мест, в свободно определенного сайта на основе консенсуса (5'-TTTT /AA-3 '), который порезал на L1-EN [8]. Хозяин ограничивает распространение таких элементов с помощью транскрипционных и пост-транскрипционные механизмы глушителей, которые снижают активность до допустимых уровней [9].
L1 выражается не только в зародышевых линиях, но и в соматических тканях. Предполагается, что даже низкий уровень соматического повреждения ДНК из-за активности L1 имеют потенциал, чтобы способствовать генетической нестабильности, старения и возрастных заболеваний, таких как рак [10, 11]. L1-ORF1 и ORF2, были повышающей регуляции в различных злокачественных опухолей, таких как рак молочной железы, рак поджелудочной железы и злокачественных опухолей зародышевых клеток и т.д. [12-14]. L1 гипометилирование наблюдалась в различных злокачественных опухолей, таких как головы и шеи, пищевода и желудка рака, и в предраковых поражений [15, 16]. Степень L1 гипометилированию был также связан с более продвинутой стадии и неблагоприятным прогнозом [17, 18].
L1-индуцированное влияние на клетки не вероятно, ограничивается только полностью активными элементами. Даже L1 элементы с дефектных областей кодирования ORF1 может сделать РНК, которая сростков, чтобы выразить функциональную ORF2 с целым рядом негативных последствий для клетки [19]. Многие ткани производят переводимый сращены ORF2 (SpORF2) транскрипт [20]. Сплайсинга транскрипта L1, который включает в себя последовательность интегрирующий обратной транскриптазы ORF2, было установлено, что важное значение для пролиферации клеток гепатомы человека [21].
Наше предыдущее исследование [22] идентифицировали активируемых транскрипт, названный рак желудка, связанных с геном 213 (GCRG213) , в аденокарциномы желудка человека. BLAST анализ последовательности GCRG213 показали 88% гомологии с человеческим LI и выявили предполагаемую консервативную область, apurinic /apyrimidinic endonucleas1 (APE), в GCRG213-ORF. Наш последний поиск обновленной базы данных GenBank показывает GCRG213-ORF содержит L1-RU консервативный домен. Эта статья сообщает наше нынешнее исследование, которое подтвердило экспрессию GCRG213 белка (GCRG213p) в желудочном линиях раковых клеток с помощью моноклональных мыши анти-GCRG213p антитело, полученное в нашей лаборатории (гериатрический институт, Китай PLA General Hospital, Пекин, Китай). Кроме того, иммуногистохимический (ВВК), примененного на ткани микрочипов (TMA) был использован для оценки экспрессии GCRG213p при раке желудка и нормальной слизистой оболочки желудка. Дальнейшие анализы были проведены, чтобы увидеть, есть ли корреляция между экспрессией GCRG213p и клинико-патологическими параметрами и выживания.
Методы
Пациентов
пациентов, перенесших резекции желудка по поводу рака желудка в PLA больницы общего профиля, Пекин, Китай с 1991 по 2003 год были рассмотрены кандидатуры для данного исследования. Критерии отбора проб были следующими: пол (мужчины или женщины), возраст (20 лет и старше); вновь диагностированных (инцидент) карциномы желудка без предварительной обработки; Диагноз подтвержден гистологически; парафином опухоли, парные окружающие не-опухолевые ткани слизистой оболочки желудка доступны, с карцином метастатических к лимфатического узла, если это возможно; и положительные последующие результаты в момент строительства ТМА. В результате 175 случаев были приняты на работу в данном исследовании, из 144 мужчин и 31 женщин (27 ~ 84 лет, средний = 58.58 лет). Среди них, шестьдесят семь случаев имеют карцином сопровождаются метастазов в лимфатических узлах, а также шесть случаев фиксированных формалином, парафином нормальные ткани желудка были также получены от больных неопухолевыми, оперированных по причине доброкачественных заболеваний желудка.
Демографическая , образ жизни и клинико-патологические данные для случаев выборки приведены в таблице 1. Все опухоли были классифицированы и поставлена ​​в соответствии с пересмотренными руководящими принципами, отстаиваемых Международным союзом против рака. Последующий было сделано, чтобы оценить свои последние условия в 2005 году путем консультаций их дела документы или посредством телефонных звонков пациентов (или членов их семей, или семейных врачей). Был принят минимальный интервал в 18 месяцев, а средний срок наблюдения за пациентами, которые были еще живы к концу 2005 года составил 46 месяцев (диапазон был от минимального 18 до максимальных 129 месяцев). Время выживания вычисляли с момента операции до даты смерти или даты последнего известного alive.Table 1 клинико-патологическими параметрами у больных раком желудка в исследуемой ткани микрочипов

N (%)

GCRG213p отрицательное

GCRG213p положительный

P значение


ГЕНДЕРНЫЙ Муж
144 (82,28%)
31
113
0,111 <бр> Женские
31 (17,72%)
11
20
Возраст
&л; 65 год
104 (59,43%)
31
73
0,029
≥65 год
71 (40,57%)
11
60
некурящих
Да
45 (27,27%)
7
38
0,278
Нет
120 (72,73%)
30
90
Питьевой
Да
28 (16,97%) страница 2 из 26
0,060
нет
137 (83,03%) не
35
102
Семейная история опухоли
Да
14 (8,43%) страница 2 из 12
0,639 <бр> Нет
152 (91,57%)
36
116
Опухоль расположение
кардиальной
48 (27,43%)
8
40
0,360
Body
37 (21,14%)
10
27
Антрум
90 (51,43%)
24
66
Опухоль размер (см)
≤1
11 (6,29%) страница 3 из 8
0,506
1-3
42 (24,00%)
13
29
> 3 <бр> 122 (69,71%)
26
96
Глубина вторжения
T1
46 (26,28%)
12
34
0,635
T2 <бр> 21 (12,00%)
7
14
T3
33 (18,86%)
6
27
T4
75 (42,86%)
17
58
причастность лимфатического узла
Да
75 (42,86%)
16
59
0,592
нет
100 (57,14%) не
26
74
Степень дифференцировки опухоли
Ну
10 (5,71%) 0

10
0.001
Умеренный
40 (22,86%)
4
36
Плохо
103 (58,86%)
27
76
перстневидные клетки
22 (12,57%)
11
11
Опухоль стадии (TNM)
0
21 (12,00%) страница 3 из 18
0,217
Ia
14 (8,00%)
6
8
Ib
41 (23,43%)
10
31
II
60 (34,29%)
17
43
IIIA
39 (22.28% )
6
33
классификации Лорен
Кишечные типа
153 (87,43%)
31
122
0,015
Диффузный тип
22 (12,57 %)
11
11 Запас
резекция
Присутствия
6 (3,43%)
0
6
0,361
Отсутствие
169 (96.57% )
42
127
микрососудистой инвазии
Присутствия
20 (11,43%) страница 5 из 15
0,911
Отсутствие
155 (88,57%)
37
118
Статус
живых
121 (71,18%)
30
91
0,483
мертвым
49 (28,82%) <бр> 9
40
5-летняя выживаемость
&л; 5 лет
47 (43,93%)
12
48
0,871
> = 5 год
60 (50,07%)
10
37
Разрешение было дано этическим комитетом Генеральной больницы НОАК, Пекин, Китай использовать ткани и данные для этого проекта. Информированное согласие было получено также от пациентов.
Tissue микрочипов строительство, GCRG213p иммуногистохимического окрашивания и оценки
ткани микрочипов (TMAS) были построены, как описано ранее [23]. Из образцов, доступных, шесть блоков тканей массива были подготовлены, каждый из которых содержит 30 случаев с опухолевым, нормальных и лимфатических тканей узла, если имеется.
Поиска Антиген TMA слайдов, и фиксированные формалином, срезы тканей парафином проводили под давлением лечение плита в течение 10 мин в растворе поиска взаимосвязанного антигена (10 ммоль /л цитрата натрия буфера, рН 6,0). Мышиные моноклональные анти человеческого GCRG213p антитела, которое было произведено в нашей лаборатории [24], добавл ли при разведении 1: 200 и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем предметные стекла инкубировали в течение 1 ч в вторичного антитела. Комплект EnVision (Dako, Carpinteria, CA, США) использовали для визуализации связывания антитела, и предметные стекла затем контрастному окрашиванию гематоксилином. ФБФР-только окрашивая образец использовали в качестве фонового контроля.
Удельное желто-коричневый иммуногистохимическое GCRG213p был исключительно расположен в цитоплазме. Он был забит независимо друг от друга и слепым методом двумя исследователями (ГДж и XL). Разногласия между наблюдателями (около 6% от общего числа случаев) были рассмотрены во второй раз, после чего убедительного суждения обоими наблюдателями. Формальное скоринг впоследствии осуществляется одним исследователем (РГ). Интенсивность окрашивания был отнесен к категории 0 (отсутствует), 1 (слабый), 2 (умеренный) и 3 (сильный). Процент положительно окрашенных клеток оценивали как 0 (0% положительных), 1 (1-30%), 2 (31-60%), и 3 (> 60%). Комбинированная оценка окрашивающего интенсивности и расширения использовали для оценки экспрессии GCRG213p. Минимальное количество баллов при суммировании (интенсивность + удлинение) 0, а максимум был 6 [25]. Общий балл ≥2 был признан GCRG213p положительным.
Вестерн-блоттинг анализ
Желудочные линий раковых клеток, включая SGC-7901, BGC-823 и нормального желудка эпителия увековечена линии клеток человека ГЭС-1 культивировали, собирали и лизировали с РИПО буфер на льду перед тем, как подвергали Вестерн-блоттинга. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда с БСА (Sigma-Aldrich) в качестве стандарта. Равные количества клеточного экстракта (40 мкг) подвергали 8% SDS-PAGE и переносили на поливинилидендифторидную мембрану (Bio-Rad) для блоттинга антител. Затем мембрану блокировали, инкубировали с мышиным анти-GCRG213p антителом (1: 500) в течение 2 ч при комнатной температуре, с последующей инкубацией с конъюгированными с пероксидазой хрена вторичного антитела в течение 1 ч при комнатной температуре. Сигнал визуализировали с усовершенствованным реагента для детекции хемилюминесценции. Мышиное анти-β-актин антитела (1: 5000, Sigma). Был обнаружен одновременно в качестве нагрузочного контроля
Обнаружение статуса метилирования LINE-1 с МПВ
Проверка статуса ЛИНИЯ-1 метилирования проводили с использованием метилирование-специфической ПЦР (MSP). Общая ДНК SGC-7901, КУП-823, MGC803 и ГЭС-1 клетки экстрагировали в соответствии с инструкциями набора для экстракции ДНК. ДНК бисульфит модифицирован, как описано ранее [26] в течение 16 ч при 50 ° С. Бисульфит-конвертированы ДНК подвергали ПЦР-амплифицировали с использованием Taq-полимеразы (Invitrogen, США). Праймеры были использованы [27]:
Linea: неметилированным LINE-1 прямой праймер, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: неметилированным LINE-1 обратный праймер, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
LINEc: метилируется LINE-1 прямой праймер, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
Подкладка: метилированный LINE-1 обратного праймера, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
ПЦР условия амплификации были:. 4 ° C, 5 мин; 94 ° С, 30 сек, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61s, 40 циклов; 72 ° С, 10 мин. Полученные ПЦР-продукты визуализировали на 2% -ном агарозном геле. Метилированные Стандарты ДНК из Zymo исследований были использованы в качестве положительного контроля, дважды дистиллированной воды в качестве отрицательного контроля
сходство последовательностей и консервативными поиска доменов
PSI-Blast был использован на сервере NCBI Blast [28] (дата поиска:. 20 го января 2012 года), чтобы определить последовательность GCRG213p к любым створах в белке базы данных банка данных, включая все нерезервированных GenBank CDS переводов, PDB, SwissProt, PIR и ЧПИ. Она была выполнена с помощью стандартного первоначального поиска BLASTP.
Статистический анализ
критерий хи-квадрат или точную вероятность Фишера используется для оценки взаимосвязи между экспрессией GCRG213p и клинико-патологическими переменных. Общая выживаемость была исследована выражением GCRG213p с кривыми Kaplan-Meier. Все значения р были двусторонними и считались статистически значимыми, если р &л; 0.05. Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS 13.0 для Windows (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс).

Результаты экспрессии GCRG213p модели в нормальной слизистой оболочке желудка и аденокарциномы желудка
Distinct GCRG213p окрашивание наблюдалось в первичных желудка аденокарциномы, лимфа узел метастазирование опухоли, а также не-опухолевого слизистой оболочки желудка (рисунок 1). В не опухолевой слизистую оболочку желудка от esopheageal-желудочного перехода и области антрума, цитоплазма дифференцированной поверхности эпителий и слизистые железы показали отрицательное окрашивание, но положительное GCRG213p окрашивание наблюдалось в базальной мембране нормальных желез. 133 из 175 первичных желудка аденокарциномы, и 51 из 67 опухолей метастатических к лимфатического узла показали положительную GCRG213p иммунореактивности, который находился в цитоплазме клеток карциномы. Рисунок 1 Выражение GCRG213p в злокачественной и доброкачественной слизистой оболочки желудка человека. Оба (А) первичная аденокарцинома желудка (100 ×) и (В) аденокарцинома захвачена в лимфатический узел (100 ×) показали положительную GCRG213p stainging в цитоплазму; (А ') и (В'), продемонстрировал более высокое увеличение (400-кратное увеличение) из зоны, в (А) и (В). (С) В доброкачественной желудочной эпителии, положительное окрашивание наблюдалось в базальной мембране, но не в цитоплазме; GCRG213p иммунореактивности был обнаружен в цитоплазме желудочных кишечной метаплазией желез (показаны стрелками) (100-кратное увеличение); . (С ') продемонстрировал более высокое увеличение (400-кратное увеличение) из области в (С)
Согласно классификации Lauren, рак желудка делится на два гистологических типа: кишечном типа или диффузного типа. Мы имеем 153 случаев кишечного типа и 22 диффузного тые случаи в данном исследовании. Среди случаев кишечного типа 153, 34 кишечная метаплазия и 28 интраэпителиальной неоплазии образцы adjecent к раку были идентифицированы. Возраст (год, среднее ± стандартное отклонение) кишечника типа группы с кишечной метаплазией (59,67 ± 12,30) был старше диффузного типа группы (51,05 ± 11,29) (р = 0,004). 31 из 34 кишечной метаплазией, и 27 из 28 с низким /высокого ранга интраэпителиальной неоплазии показал GCRG213p иммунореактивности. Большинство положительных случаев показали легкой до умеренной окраски (Таблица 2) .table выражение 2 GCRG213 в образцах желудочного тканевых
групп

Номер

выражение GCRG213

Общая оценка ‡

PR§ (%):

0-1

2-3

4-5
<бр> 6


неопухолевые эпителий желудка
112
112
0 0

0
0.00
Кишечная метаплазия
34
3
18
11 страница 2 * 91,18
Низко /высокосортных ЦИН
28
1
17
10
0
96.43 *
аденокарциномы без LNM †
100
26
50
21 страница 3 74.00 *
аденокарциномы с LNM
75
16
40
16 страница 3 78,67 *
опухоль метастазировать в лимфатических узлах
67
16
42
8
1
метастазирование узел 76,12 *
† LNM
лимфа; ‡ Общий балл рассчитывается как (оценка интенсивности) плюс (в процентах клеток положительная оценка), как описано в методах; §PR
Положительная ставка
* По сравнению с не-опухолевого слизистую оболочку желудка, р &л.; 0.001.
Ассоциация между экспрессией GCRG213 и клинико-патологическими параметрами
High GCRG213p Иммуноокрашивание счет в первичном раке желудка была положительно коррелирует с дифференцировки опухоли (р = 0,001) (рисунок 2). В то же время, экспрессия GCRG213p коррелировала с классификацией Лорен (р &л; 0,05). Процент положительных GCRG213p окрашивания в возрасте группе (> = 65 лет) был выше, чем в группе, не в возрасте (&л; 65 лет) (60/71 = 84,51% по сравнению с 73/104 = 70,19%, р ≪ 0,05). Тем не менее, выражение GCRG213p не было установлено, что связано с другими клинико-патологическими параметрами, как те, которые перечислены в таблице 1 (p > 0,05). В 67 пациентов с как первичной опухоли и узел метастатических лимфатических образцов опухоли, GCRG213p был положительным в 51 лимфатических образцов узлов метастазы и 52 первичных образцов опухоли (76,12% против 77,61%), соответственно, что указывает на то, что повышенная экспрессия GCRG213p в узле метастазами лимфатического опухоль созвучна с выражением GCRG213p в первичной карциномы желудка. Выражение GCRG213p в метастазами лимфатических был также связан с сортами дифференцировки опухоли (р = 0,015), но не с другими клинико-патологическими параметрами (р &ГТ; 0,05). Рисунок 2 Соотношение GCRG213p балла иммуноокрашивания при первичном раке желудка с дифференцировки опухоли. Общая оценка (ОС) иммуноокрашивания выше в хорошо дифференцированным раком, чем в бедных дифференцированных (р = 0,001).
Связь выражения GCRG213 с выживанием
Последующая информация была доступна на 175 рака желудка пациентов на срок от 18 месяцев до 14 лет. Общие показатели выживаемости следующим образом: 91.42% (1 год), 78,28 %% (2 года), 56,57% (3 года), 39,43% (4 года) и 23.43% (5 лет). Средняя выживаемость составляет 41 месяцев.
На основе экспрессии GCRG213p в первичных опухолях, не было никаких существенных различий в выживаемости между пациентами в GCRG213p отрицательной категории по сравнению с GCRG213 положительной категории (X
2 <бр> = 2,072, р = 0,558). Точно так же не наблюдалось никакой корреляции между экспрессией GCRG213p в метастазов в лимфатических узлах и выживания (X
2
= 3,272, р = 0,195).
Выражение GCRG213p в злокачественных и нормальных клеток слизистой оболочки желудка линий <бр> вестерн-блоттинга анализы проводили на клетках рака желудка, включая СГК-7901, BGC-823 и доброкачественных желудочную среду клеточной линии ГЭС-1, с целью дальнейшего подтверждения дифференциальную экспрессию GCRG213p. Были определены Белковые полосы около 35 кДа. Три протестированной клеточной линии выражены GCRG213p на разных уровнях. Уровень GCRG213p был найден выше в линиях раковых клеток, чем в ГЭС-1 (рисунок 3). Этот результат совпадает с результатом IHC в этом исследовании, т.е. GCRG213p был найден сверхэкспрессируется при раке желудка. Рисунок 3 Вестерн-блоттинг анализ всего клеточного экстракта из желудка доброкачественных и злокачественных клеток с использованием анти-GCRG213p антитела. Клетки выразить GCRG213p с белковыми полосами 35-кДа. 1: ГЭС-1,2: SGC-7901; 3: КУП-823. Фильтр зондировали с анти-бета-актин антитела для контроля за равный нагрузки (нижняя панель).
Метилирования конкретных ПЦР анализ LINE-1
метилирования конкретных ПЦР (ССП) проводились анализы клеток рака желудка и незловредный слизистой желудка клеточная линия ГЭС-1, для того, чтобы проверить статус метилирования L1 промотора в этих клеточных линий. Помимо желудка линий раковых клеток SGC-7901 и КУП-823, мы также изучали желудка линии MGC-823 раковых клеток, для целей предоставления дополнительной информации о L1 метилирования в желудочном линиях раковых клеток. Продукты ПЦР-амплификации с метиловым-специфических праймеров (MSPM) и неметилированных-специфических праймеров (МГПУ) были 116 п.н. и 111 п.н., соответственно. В ГЭС-1 клеток, ПЦР-продукт амплифицировали с MSPM, но не с МГПУ, предполагая, что L1-промоторов в клетках ГЭС-1 прошли полное метилирование; В SGC-7901, клетки BGC-823 и клеток MGC-803, соответствующие полосы могут быть усилены с обоими MSPM и МГПУ, что свидетельствует о частичном метилирования (Рисунок 4). Рисунок 4 Метилирование-специфической ПЦР (MSP) анализ LINE-1. Электрофорез в агарозном геле продуктов MSP. M: продукт усиливается с метилированный специфического праймера; U: продукт усиливается с неметилированным-специфического праймера. PC: положительный контроль, стандартный метилированной ДНК человек; W: бидистиллированной воды контроля. Следует отметить, что образцы GES-1 только показывают метилированных продуктов ПЦР, в то время как MGC-803, SGC-7901 и КУП-823 пробы показывают, как метилированных и неметилированные продуктов ПЦР.
Биоинформационные идентификацию GCRG213p в качестве члена L1-EN семьи анализ программы
BLASTP, как уже упоминалось выше, показали, что пептид GCRG213p разделяет выравнивание 83,0% с с-концевой области L1-EN. Консервативные поиска доменов последовательности GCRG213p в базе данных консервативном домене из NCBI попадает в большой экзонуклеазной /эндонуклеазы /фосфатазы (EEP) надсемейство, включая эндонуклеазы области не-LTR ретротранспозона LINE-1, экзонуклеазы III (ExoIII) -как apurinic /apyrimidinic ( AP) эндонуклеаз и т.д.
Дальнейший анализ с использованием BLASTP указывает на то, что есть в последовательности GCRG213p некоторые остатки, которые имеют важное значение для сохраняющихся особенностей L1-EN, такие как сайт связывания фосфата мнимый [сайт связывания иона] (Y115 /N145 /H230), сайт связывания мнимый металла [сайт связывания ионов] (D229) и предполагаемый каталитический сайт [АЦ] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (Рисунок 5). Рисунок 5 Выравнивание GCRG213p и L1-RU. Красный шрифт представляет высокий консенсус, синий или черный шрифт представляет низкий консенсус. GCRG213p содержали остатки (которые) стрелками имеют важное значение для эндонуклеазы активности L1-эн.
Обсуждение
Очевидно, что L1 ретротранспозиции события произошли в соматических и половых клетках. Несмотря на то, что полная длина L1 мРНК, безусловно, является главным источником L1 ретротранспозиции, эндогенные L1 ORF2 сплайсинга варианты с потенциальной биологической релевантности найдены выражены в различных соматических тканях. Belancio и т.п. [20] обнаружены SpORF2 транскрипта в различных человеческих тканях взрослых и экспрессию мРНК SpORF2 обнаруживает изменение тканеспецифичную. Таким образом, функция L1, вряд ли будет ограничиваться только полностью активными элементами. SpORF2 может также произвести функциональный белок ORF2. Большинство ретротранспозоны не-LTR являются APE типа не-LTR ретротранспозонов [29]. Кристаллическая структура анализа человеческого L1-EN показывают, что он является прототипом для AP-подобных ретротранспозонов кодируются эндонуклеаз, который ник ДНК с переменной специфичности и несут ответственность за миллионы ретротранспозонов вставок в геномах эукариот [30]. Оба APE1 и L1-RU принадлежат к большому ЭВЧ надсемейства, который разделяет один и тот же белок эшафот и те же каталитические остатки.
Учитывая тот факт, что акции GCRG213p высокой последовательности выравнивания с L1-EN и обладает законсервированные остатки, которые имеют решающее значение для L1 -en фосфат связывания, связывание металла и каталитической активности, мы предполагаем, что GCRG213 является сращены L1-ORF2. GCRG213p может быть функциональным членом L1-EN семьи, вариант L1-EN.
Избыточная экспрессия L1 в опухолях широко представлены [12-14]. Клеточная эндогенная L1-RT выступает в качестве конститутивного функционального компонента в онкогенных клеток, характеризующихся высокой пролиферации и дифференцировки состояния низкой [31, 32]. Тем не менее, есть несколько детальных обследований L1-EN в человеческой опухоли. Ergun и т.д., используемые анти-L1-EN антитела для выявления L1-ORF2 во взрослых тканях человека, они обнаружили сильную экспрессию ORF2p в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов в нормальной человеческой предстательной железы, мочевого пузыря и ткани яичка, но ни одно выражение ORF2p не наблюдалось раковые клетки изучали [33]. Oricchio и т.д. [34] сообщили, что стабильная L1 РНК-интерференция может снизить пролиферацию и способствовать дифференциации в А-375 клеток меланомы. Они также наблюдали снижение белка L1-ORF2. Но исследователи не выявили, были ли последствия пролиферации от L1-EN и /или L1-RT. На сегодняшний день не существует ни одного доклада нашли о роли L1-EN на пролиферацию и дифференцировку клеток. В этом исследовании мы вновь подтвердили, что экспрессия GCRG213p был повышен при раке желудка на уровне белка, как в модели клеток и срезы ткани изучали, что согласуется с нашими предыдущими результатами исследования на уровне мРНК [22]. L1 подвергаются гипометилирование в различных опухолевых тканей, в том числе рака желудка [35]. Shigaki и т.д. [36] использовали бисульфит-пиросеквенирования технологии для количественного определения статуса метилирования L1 в резецированными желудка образцов рака. Они обнаружили, что пациенты прошли L1 гипометилирование испытывали значительно меньшую общую выживаемость, чем те, с гиперметилированием. Мы нашли в этом исследовании, что L1 был полностью метилированный в нормальной слизистой оболочки желудка клеточной линии ГЭС-1, но был частично метилированный в желудочном линиях раковых клеток. Эти результаты хорошо коррелируют с паттерном экспрессии GCRG213p в желудочном линиях раковых клеток, таким образом, предоставить больше доказательств в отношении характера GCRG213 пептида. Тем не менее, мы не смогли определить корреляцию между экспрессией GCRG213p и выживаемости в этом исследовании. ЦИН, как полагают, является ключевой стадией злокачественной трансформации аденокарциномы желудка, повышенная экспрессия GCRG213p в этих желез подразумевает потенциальную роль GCRG213p в желудочном онкогенеза. Высокий иммунное оценка GCRG213p в хорошо дифференцированной рака желудка показало, что он может быть вовлечен в желудочном дифференцировки рака.
В то время как хронический атрофический гастрит, как полагают, является ассоциированное с возрастом лица, кишечная метаплазия считался доказательством атрофический гастрит, так как специализированные железы были заменены кишечных крипт, поэтому кишечная метаплазия считалась связанной с возрастом. Возраст играет важный фактор, регулирующий развитие желудочной кишечной метаплазии, а также пациентов с желудочно-кишечной метаплазии были значительно старше, чем те, без метаплазии [37]. Кишечная метаплазия железы отображается обширная GCRG213p иммуноокрашивания в данном исследовании. В то же время, мы наблюдали, что положительная скорость GCRG213p в желудочных тканях рака в возрасте группе была выше, чем в не в возрасте группе. Это может означать, что GCRG213p связано с желудочным старения слизистых оболочек и связанных с возрастом лиц. Там нет никакого исследования об ассоциации между выражением L1 и возраст в настоящее время, но в среднем метилирование L1 не менялась с течением времени [38, 39]. Считается, что уменьшение поперечного сечения из геномной ДНК с помощью L1-EN может индуцировать клеточную токсичность, что приводит к остановку клеточного цикла, апоптоза или старении. Экспрессия экзогенного полной длины L1 и SpORF2 в нормальных фибробластов человека, раковые клетки и взрослые стволовые клетки привели к обнаруживаемого повреждения ДНК и в результате увядания подобный фенотип [20]. Таким образом, мы полагаем, что накопленная активность GCRG213p, вариант L1-EN, может представлять собой потенциальный источник для возрастной трансформации клеток, что в конечном итоге способствует клеточного старения, или противоположно, к вне контролируемого (злокачественная) Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Потребление алкоголя и риск развития рака желудка: когортное исследование мужчин в Каунасе, Литва, с до 30 лет …
• Индукция нестабильности хромосом и рака желудка путем изменения характера экспрессии генов митотических ко…