Uttrykk for en LINE-en endonuklease variant i magekreft: tilknytningen clinicopathological parameters

uttrykk for en LINE-en endonuklease variant i magekreft: tilknytningen clinicopathological parametere
Abstract
Bakgrunn
Long ispedd atom element- 1 (LINE-1 eller L1), det mest tallrike, og bare autonomt aktiv familie av ikke-LTR retrotransposons i det humane genom, ikke bare uttrykt i kjønns linjer, men også i somatiske vev. Den bidrar til genetisk ustabilitet, aldring, og aldersrelaterte sykdommer, slik som kreft. Vår tidligere studie identifisert i humant adenokarsinom i ventrikkel en oppregulert avskrift GCRG213, som delte 88% homologi med menneskelig L1 sekvens, og inneholdt en antatt bevart apurinic /apyrimidinic endonucleas1 domene
. Metoder
Immunohistochemistry ble utført ved hjelp av et monoklonalt mus anti human antistoff GCRG213 protein (GCRG213p) produsert i vårt laboratorium, på vevet microarray konstruert med prøver fra 175 pasienter med adenokarsinom pasienter. Korrelasjonen mellom GCRG213p uttrykk og pasient clinicopathological parametre ble evaluert. GCRG213p uttrykk i magekreft cellelinjer ble studert ved hjelp av Western blotting-analyse. L1-promoteren metylering status av magekreftceller ble testet ved hjelp av metylering-spesifikke PCR. BLASTP ble brukt på NCBI Blast serveren for å identifisere GCRG213p sekvens til eventuelle justeringer i Protein Data Bank databaser.
Resultater
mest primære magekreft, lymfeknutemetastaser og mage tarm metaplasi kjertler viste positiv GCRG213p immunoreaktivitets. Høy GCRG213p farging score i den primære magekreft var positivt korrelert med tumor differensiering (vel differensiert, p = 0,001), Lauren klassifisering (intestinal type p < 0,05) og en sen alder utbruddet av adenokarsinom i ventrikkel (≥ 65 år; p <0,05). GCRG213p uttrykket ikke har noen tilknytning til andre clinicopathological parametere, inkludert overlevelse. Western blotting-analyse av GCRG213p uttrykk i magekreftceller indikerte at GCRG213p nivået var høyere i mage kreft cellelinjer enn i normalt humant gastrisk epitel udødeliggjort cellelinje GES-en. Delvis metylering av L1 i magekreftceller ble bekreftet ved metylering-spesifikk PCR. BLASTP programmet analyse viste at GCRG213p peptidet delt 83,0% innretting med den C-terminale region av L1-endonuklease (L1-EN). GCRG213p sekvens besitter viktige rester som komponerer de konserverte funksjonene i L1-EN.
Konklusjoner
GCRG213p kan være en variant av L1-EN, en funksjonell medlem av L1-EN familie. Overekspresjon av GCRG213p er vanlig i både primær magekreft og lymfeknutemetastase. Disse funnene gir bevis for somatisk L1 uttrykk i magekreft, og dens mulige konsekvenser i form av svulst.
Nøkkelord
magekarsinom Long ispedd kjerneelement-en endonuklease GCRG213 protein Tissue microarray Bakgrunn
Long ispedd kjerneelement -1 (LINE-1 eller L1) er den mest tallrike, og bare autonomt aktiv familie av ikke-LTR retrotransposons i det humane genom og omfatter omtrent 17% av det humane genom [1]. De aller fleste av de om lag 500 000 totalt kopier av L1 i det menneskelige genom er ikke i stand til å trans på egenhånd på grunn av ulike mekanismer som trunkeringer og inaktive mutasjoner. Imidlertid anslagsvis 80-100 full-lengde, retrotransposition kompetente L1S (RC-L1S) er til stede i et typisk diploid humane genom, og et lite antall, betegnet "hot L1S" har høye virkningsgrader retrotransposition [2].
Menneskelig RC-L1S er ca 6,5 ​​kb og koder to proteiner (ORF1p og ORF2p) som kreves for retrotransposition [3]. ORF1p er et 40-kDa-protein med RNA-bindende [4] og nukleinsyre anstand aktiviteter [5]. ORF2p er en 150-kDa protein med endonuklease (L1-EN) [6] og revers transkriptase (L1-RT) [7] aktiviteter. L1 element kan integreres inn i flere hundre tusen genomiske steder, ved et løst definert konsensus område (5'-TTTT /AA-3 '), som er nicked av L1-EN [8]. Verten begrenser spredningen av slike elementer ved transkripsjonelle og post-transkripsjonelle Silencing mekanismer som reduserer aktiviteten til tolererbare nivåer [9].
L1 uttrykkes ikke bare i kjønns linjer, men også i somatiske vev. Det er foreslått at til og med lave nivåer av somatisk DNA-skade som skyldes L1 aktivitet har potensial til å bidra til genetisk ustabilitet, aldring, og aldersrelaterte sykdommer, slik som kreft [10, 11]. L1-ORF1 og ORF2 ble oppregulert i en rekke forskjellige maligniteter, for eksempel brystkreft, kreft i bukspyttkjertelen og ondartede bakterie celle svulster, osv [12-14]. L1 hypometylering ble observert i en rekke ondartede sykdommer slik som hode og nakke, spiserør og mage kreft, og i premaligne lesjoner [15, 16]. Graden av L1 hypometylering ble også forbundet med et mer avansert stadium og dårligere prognose [17, 18].
L1-induserte innflytelse på cellene ikke er sannsynlig begrenset bare til fullt ut aktive elementer. Selv L1 elementer med defekte ORF1 kodende områder kan gjøre et RNA som skjøter for å uttrykke en funksjonell ORF2 med en rekke negative følger for cellen [19]. Mange vev produsere oversett skjøtes ORF2 (SpORF2) avskrift [20]. Et spleiset L1 transkript som inkluderer inte revers transkriptase sekvens av ORF2, ble funnet å være avgjørende for human hepatom-celleformering [21].
Vår tidligere studie [22] identifisert en oppregulert transkript, kalt magekreftrelatert gen 213 (GCRG213) , i human gastrisk adenokarsinom. BLAST analyse av GCRG213 sekvens indikerte 88% homologi med humant LI og avslørte en antatt bevart domene, apurinic /apyrimidinic endonucleas1 (APE), i GCRG213-ORF. Vår nyeste leting etter den oppdaterte GenBank databasen viser GCRG213-ORF inneholder en L1-EN bevart domene. Dette papiret rapporterer vår nåværende studie som har bekreftet GCRG213 protein (GCRG213p) uttrykk i magekreft cellelinjer ved bruk av monoklonalt mus anti-GCRG213p antistoff produsert i vårt laboratorium (Geriatrisk institutt, Kina PLA General Hospital, Beijing, Kina). I tillegg immunhistokjemi (IHC) påført på vev microarray (TMA) ble anvendt for å evaluere GCRG213p ekspresjon i magekreft og normal gastrisk mucosa. Videre analyser ble utført for å se om det er noen sammenheng mellom GCRG213p uttrykk og clinicopathological parametre og overlevelse.
Metoder
Pasienter
Pasienter som gjennomgikk gastrektomi for magekreft i PLA General Hospital, Beijing, Kina 1991-2003 ble ansett som kandidater for denne studien. Utvalgskriteriene var som følger: kjønn (menn eller kvinner), alder (20 år eller eldre); nylig diagnostisert (hendelse) magekarsinom uten forutgående behandling; diagnosen histologisk bekreftet; parafin innebygd svulst, sammen rundt ikke-tumormageslimhinnen vev tilgjengelig, med karsinom metastatisk til lymfeknute hvis mulig; og positive oppfølgingsresultater på tidspunktet for TMA bygging. Som et resultat ble 175 tilfeller rekruttert i denne studien, bestående av 144 menn og 31 kvinner (27 ~ 84 år, gjennomsnittlig = 58.58 år). Blant dem, seksti syv tilfeller har karsinomer akkompagnert med lymfeknutemetastaser, og seks tilfeller av formalinfiksert, ble parafininnstøpte normale mage vev også innhentet fra ikke-kreftpasienter som ble operert på grunn av godartede mage sykdommer.
Demografisk , livsstil og clinicopathological data for eksempelsaker ble vist i tabell 1. Alle tumorer ble klassifisert og iscenesatt i henhold til de reviderte retningslinjene forfektet av International Union mot kreft. Oppfølgingen ble gjort for å vurdere deres nyeste forholdene i 2005 ved å konsultere sine saksdokumenter eller gjennom telefonsamtaler til pasienter (eller deres familiemedlemmer, eller familie utøvere). En minimumsintervall på 18 måneder ble vedtatt, og median oppfølgingstid for pasienter som fortsatt var i live ved utgangen av 2005 var 46 måneder (utvalget var fra minimum 18 til maksimum 129 måneder). Overlevelse ble beregnet fra datoen for operasjonen til dødsdato eller datoen siste kjente alive.Table 1 Clinicopathological parametere av magekreftpasienter undersøkt i vevet microarray
N (%)
GCRG213p negativ
GCRG213p positiv
P-verdi
Kjønn
Mann fra 144 (82,28%)
31
113
0,111
Kvinne
31 (17,72%)
11
20
Age
< 65 år
104 (59,43%)
31
73
0,029
≥65 år
71 (40.57%)
11
60
røyke
Ja
45 (27,27%)
7
38
0,278
Ingen
120 (72,73%)
30
90
Drikker
Ja
28 (16,97%)
2
26
0,060
Ingen
137 (83,03%)
35
102
Familiehistorie med svulst
Ja
14 (8.43%)
2
12
0,639
Nei
152 (91,57%)
36
116
Tumor plassering
Cardiac
48 (27,43%)
8
40
0,360
Body
37 (21,14%)
10
27
antrum
90 (51.43%)
24
66
Tumor størrelse (cm)
≤1
11 (6,29%)
3
8
0,506
1-3
42 (24,00%)
13
29
> 3
122 (69,71%)
26
96
Dybde invasjon
T1
46 (26,28%)
12
34
0,635
T2
21 (12,00%)
7
14
T3
33 (18,86%)
6
27
T4
75 (42.86%)
17
58
spredning til lymfeknuter
Ja
75 (42.86%)
16
59
0,592
Ingen
100 (57,14%)
26
74
Grade tumor differensiering
Vel
10 (5,71%)
0
10
0,001
Moderat
40 (22,86%)
4
36
Dårlig
103 (58,86%)
27
76
Signet ring celle
22 (12,57%)
11
11
Tumor scenen (TNM)
0
21 (12,00%)
3
18
0,217
Ia
14 (8,00%)
6
8
Ib
41 (23,43%)
10
31
II
60 (34,29%)
17
43
IIIa
39 (22.28% )
6
33
Lauren klassifisering
Tarm typen
153 (87,43%)
31
122
0,015
Diffuse typen
22 (12.57 %)
11
11
Reseksjon margin
Presence
6 (3,43%)
0
6
0,361
Absence
169 (96,57% )
42
127
Mikrovaskulær invasjon
Presence
20 (11,43%)
5
15
0,911
Absence
155 (88,57%)
37
118
Status
live
121 (71,18%)
30
91
0,483
døde
49 (28,82%)
9
40
fem års overlevelse
< 5 yr
47 (43.93%)
12
48
0,871
> = 5 år
60 (50,07%)
10
37
Tillatelse ble gitt av den etiske komiteen av PLA General Hospital, Beijing, Kina til å bruke vev og dataene for dette prosjektet. Informert samtykke ble også innhentet fra pasientene.
Tissue microarray konstruksjon, GCRG213p immunhistokjemisk farging og vurdering Bedrifter Den microarray (TMA) ble konstruert som beskrevet tidligere [23]. Fra prøvene tilgjengelige, ble seks vev array-blokker forberedt som hver inneholder 30 tilfeller med tumor, normale og lymfeknute vev hvis tilgjengelig.
Antigen henting av TMA lysbilder, og formalinfikserte, parafininnstøpte vevssnitt ble utført ved hjelp av trykk komfyr behandling i 10 minutter i et antigen gjenfinning oppløsning (10 mmol /l natriumcitrat, pH 6,0). Monoklonale mus anti-humant GCRG213p-antistoff, som ble fremstilt i vårt laboratorium [24], ble tilsatt ved en fortynning på 1: 200 og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble deretter inkubert i 1 time i sekundært antistoff. En EnVision kit (Dako, Carpinteria, CA, USA) ble brukt til å visualisere antistoffbinding, og lysbilder ble senere kontra med hematoksylin. En PBS-bare flekker prøve ble brukt som bakgrunnskontroll.
Spesifikk gul-brun farging for GCRG213p ble utelukkende lokalisert i cytoplasma. Det ble scoret selvstendig og i en blindet måte av to etterforskere (GJ og XL). Den inter-observatør uenigheter (ca 6% av totalt antall saker) ble anmeldt for andre gang, etterfulgt av en avgjørende dom av begge observatører. Formell scoring ble deretter utført av en etterforsker (WG). Den fargeintensitet ble kategorisert som 0 (fraværende), 1 (svak), 2 (middels) og 3 (sterk). Prosentandelen av positivt fargede celler ble scoret som 0 (0% positive), 1 (1-30%), 2 (31-60%), og 3 (> 60%). Kombinert vurdering av fargeintensitet og forlengelsen ble brukt til å evaluere GCRG213p uttrykk. Den minimum score når summert (intensitet + forlengelse) var 0, og den maksimale var 6 [25]. Samlet score på ≥2 ble ansett GCRG213p positive.
Western blotting-analyse
magekreft cellelinjer inkludert SGC-7901, BGC-823 og humant normalt gastrisk epitel udødeliggjort cellelinje GES-1 ble dyrket, samlet og lysert med RIPA buffer på is før den ble underkastet Western blotting-analyse. Proteinkonsentrasjonen ble påvist ved hjelp av Bradford-metoden med BSA (Sigma-Aldrich) som standard. Like mengder av celleekstrakt (40 ug) ble underkastet 8% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membran (Bio-Rad) for antistoff blotting. Membranen ble deretter blokkert, inkubert med mus-anti-GCRG213p-antistoff (1: 500) i 2 timer ved romtemperatur, etterfulgt av inkubasjon med et pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Signalet ble visualisert med en forbedret kjemiluminescens deteksjonsreagens. Musen anti-β-actin antistoff (1: 5000, Sigma). Det ble oppdaget samtidig som en lasting kontroll
Påvisning av metylering status for LINE-en med MSP
Validering av LINE-en metylering status ble utført ved hjelp av metylering-spesifikke PCR (MSP). Total DNA fra SGC-7901, ble BGC-823, MGC803 og GES-1 celler hentet i henhold til instruksjonene fra DNA-ekstraksjon kit. DNA ble bisulfitt modifisert som tidligere beskrevet [26] i 16 timer ved 50 ° C. Bisulfitt-omdannet DNA ble PCR-amplifisert ved å bruke Taq-polymerase (Invitrogen, USA). Primere brukt var [27]:
linea: unmethylated LINE-en fremover primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT,
LINEb: unmethylated LINE-1 revers primer, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA,
LINEc: metylert LINE-en fremover primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
foret: metylert LINE-1 revers primer, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
PCR forsterkning forholdene var. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30-årene, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61s, 40 sykluser; 72 ° C, 10 min. De resulterende PCR-produkter ble visualisert på en 2% agarosegel. Denaturert DNA-standard fra Zymo Forskning ble brukt som positiv kontroll, dobbelt destillert vann som negativ kontroll
sekvenslikhet og konservert domene søk
PSI-Blast ble brukt ved NCBI Blast server [28] (søk dato. 20 th januar 2012) for å identifisere GCRG213p sekvens til eventuelle justeringer i Protein data Bank databaser inkludert alle ikke-redundante GenBank CDS oversettelser, PDB, SwissProt, PIR og PRF. Det ble utført med en standard innledende BLASTP søk.
Statistisk analyse
Chi-kvadrat test eller Fishers eksakte sannsynlighet ble brukt til å evaluere forholdet mellom GCRG213p uttrykk og clinicopathological variabler. Total overlevelse ble undersøkt av GCRG213p uttrykk med Kaplan-Meier-kurver. Alle p-verdiene var tosidig og vurderes statistisk signifikant hvis p < 0,05. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
GCRG213p uttrykk mønstre i normal mageslimhinnen og adenokarsinom i ventrikkel
Tydelig GCRG213p farging ble observert i primær mage adenokarsinomer, lymfe metastaser svulster, og ikke-tumormageslimhinnen (figur 1). I den ikke-tumoral gastrisk mucosa fra esopheageal-gastrisk knutepunkt og antrum område, cytoplasma av differensiert flate epitel og slimhinne kjertler viste negativ farging, men positiv GCRG213p farging ble observert i basalmembranen av de normale kjertler. 133 av 175 primær mage adenokarsinomer, og 51 av 67 svulster metastatiske til lymfeknute viste positiv GCRG213p immunoreaktivitets, som var plassert i cytoplasma av carcinoma celler. Figur 1 GCRG213p-ekspresjon i humane maligne og ikke-maligne gastrisk mucosa. Begge (A) primær gastrisk adenokarsinom (100 x) og (B) adenokarsinom invadert inn lymfeknute (100 x) viste positiv GCRG213p stainging i cytoplasma; (A ') og (B') demonstrerte høyere forstørrelse (400 x), fra et område (A) og (B). (C) I den ikke-ondartet gastrisk epitel, ble positiv farging observert i basalmembranen, men ikke i cytoplasma; GCRG213p immunoreaktivitet ble funnet i cytoplasmaet av mage intestinal metaplasi kjertler (pilforsynte) (100 x); . (C ') demonstrerte høyere forstørrelse (400 x), fra et område (C)
Ifølge Lauren klassifisering, og magekreft delt i to histologiske typer: intestinal-type eller diffuse-type. Vi har 153 intestinal-type saker og 22 diffuse-tye tilfeller i denne studien. Blant de 153 intestinal-type saker, 34 intestinal metaplasi og 28 intraepitelial neoplasi prøver mot til kreft ble identifisert. Alderen (år, gjennomsnitt ± SD) i tarm-type gruppe med intestinal metaplasi (59,67 ± 12,30) var eldre enn den diffuse-type gruppe (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 av 34 intestinal metaplasi, og 27 av 28 lav- /høy klasse intraepitelial neoplasi viste GCRG213p immunoreaktivitets. De fleste av de positive sakene viste mild til moderat farging (tabell 2) .table 2 GCRG213 uttrykk i mage vevsprøver
Grupper
Antall
GCRG213 uttrykk
Samlet poengsum ‡
PR§ (%)
0-1
2-3
4-5

6
ikke-tumor gastrisk epitel
112
112
0
0
0
0.00
Intestinal metaplasi
34
3
18
11
2
91,18 *
Low /high-end intraepitelial neoplasi
28
1 17
10
0
96,43 *
adenokarsinom uten LNM †
100
26
50
21
3
74.00 *
adenokarsinom med LNM
75
16
40
16
3
78.67 *
tumor metastatisk til lymfeknute
67
16
42
8
1 76,12 *
† LNM
lymfeknutemetastaser; ‡ Samlet poengsum beregnes som (intensitet score) pluss (prosent celler positiv score) som beskrevet i metoder; §PR
Positiv hastighet product: * Sammenlignet med ikke-tumormageslimhinnen, p <.; 0,001.
Association mellom GCRG213 uttrykk og clinicopathological parametere
Høy GCRG213p farging score i den primære magekreft var positivt korrelert med tumor differensiering (p = 0,001) (figur 2). I mellomtiden ble GCRG213p uttrykk korrelert med Lauren klassifikasjon (p < 0,05). Prosentandelen av positive GCRG213p flekker i alderen gruppe (> = 65 år) var høyere enn i den ikke-alderen gruppe (< 65 år) (60/71 = 84,51% vs. 73/104 = 70,19%, p < 0,05). Imidlertid GCRG213p ekspresjon ble ikke funnet å være assosiert med andre clinicopathological parametre som de som er oppført i tabell 1 (p 0,05). I de 67 pasienter med både den primære tumor og lymfeknutemetastatiske tumorprøver, var GCRG213p positiv i 51 lymfeknutemetastase legemer og 52 primærtumorprøver (76,12% mot 77,61%), henholdsvis, noe som indikerer at forhøyede GCRG213p ekspresjon i lymfeknutemetastatisk svulsten er konkordant med GCRG213p uttrykk i grunnskolen magekreft. GCRG213p ekspresjon i lymfeknutemetastaser var også assosiert med graderinger av tumor differensiering (p = 0,015), men ikke med andre clinicopathological parametre (p 0,05). Figur 2 Sammenheng av GCRG213p farging score i primærmagekreft med tumor differensiering. Samlet score (OS) for farging er høyere i godt differensiert kreft enn i dårlig differensiert (p = 0,001).
Relation av GCRG213 uttrykk med overlevelse
Oppfølging informasjon var tilgjengelig på 175 magekreft pasienter for perioder fra 18 måneder til 14 år. Totalt overlevelse er som følger: 91,42% (1 år), 78.28 %% (2 år), 56,57% (3 år), 39,43% (4 år), og 23,43% (5 år). Median overlevelse er 41 måneder.
Basert på GCRG213p uttrykk i primære svulster, var det ingen signifikant forskjell i overlevelse mellom pasienter i GCRG213p negative kategorien sammenlignet med GCRG213 positive kategori (X
2
= 2,072, p = 0,558). Tilsvarende ble observert noen sammenheng mellom GCRG213p uttrykk i lymfeknutemetastase og overlevelse (X
2
= 3,272, p = 0,195).
GCRG213p uttrykk i maligne og normale mage slimhinnecellelinjer
Western blotting analyser ble utført på magekreftceller inkludert SGC-7901, BGC-823 og ikke-maligne gastrisk mucosal cellelinje GES-1, for ytterligere å validere den differensielle ekspresjonen av GCRG213p. Proteinbånd på omtrent 35 kDa ble identifisert. Tre cellelinjene som ble testet uttrykte GCRG213p på ulike nivåer. GCRG213p Nivået ble funnet høyere i kreftcellelinjer enn i GES-1 (figur 3). Dette funn stemmer overens med den IHC resultatet rapportert i denne studien, dvs. GCRG213p ble funnet overuttrykt i magekreft. Figur 3 Western blotting-analyse av hele celleekstrakt fra mage-maligne og ikke-maligne celler ved anvendelse av anti-GCRG213p antistoff. Celler som uttrykker GCRG213p med proteinbånd på 35 kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901, 3: BGC-823. Filteret ble reprobed med anti-β-actin antistoff for å kontrollere for lik belastning (nederst panel).
Metylering spesifikk PCR-analyse av LINE-en
Metylering spesifikke PCR (MSP) analyser ble utført på mage kreftceller og ikke-maligne gastrisk mucosal cellelinje GES-1, for å teste L1-promoteren metylering status i disse cellelinjene. Bortsett fra mage kreft cellelinjer SGC-7901 og BGC-823, vi også studert magekreft cellelinje MGC-823, for å kunne gi mer informasjon om L1 metylering i mage kreft cellelinjer. PCR-produktene amplifisert med denaturert-spesifikke primere (MSPM) og unmethylated-spesifikke primere (MSPU) var 116-bp og 111 bp, respektivt. I GES-1-celler, ble PCR-amplifisert produkt med MSPM, men ikke med MSPU, noe som tyder på at L1 promotorene i GES-1-celler gjennomgikk fullstendig metylering; I SGC-7901 celler, BGC-823 celler og MGC-803 celler, kan de tilsvarende band forsterkes med både MSPM og MSPU, en indikasjon på delvis metylering (figur 4). Figur 4 Metylering spesifikke PCR (MSP) analyse av LINE-en. Agarosegelelektroforese av MSP produkter. M: Produktet forsterket med metylert spesifikk primer; U: Produktet forsterket med unmethylated spesifikk primer. PC: positiv kontroll, standard human metylert DNA; W: dobbelt destillert vann kontroll. Legg merke til at GES-1 prøver bare vise denaturert PCR-produkter, mens MGC-803, SGC-7901 og BGC-823 prøvene viser både denaturert og unmethylated PCR produktene.
Bioinformatiske identifisering av GCRG213p som medlem av L1-EN familie
BLASTP programmet analyse, som nevnt ovenfor, viste at GCRG213p peptidet delt 83,0% innretting med den C-terminale region av L1-eN. Konservert Domain Search of GCRG213p sekvensen i konservert Domain Database of NCBI treffer den store eksonuklease /endonuklease /fosfatase (EEP) super, inkludert endonuklease domenet for ikke-LTR retrotransposon LINE-en, eksonuklease III (ExoIII) -lignende apurinic /apyrimidinic ( AP) endonucleases, etc.
Videre analyser ved hjelp BLASTP tyder på at det er i GCRG213p sekvens noen rester som er viktige for de konserverte funksjonene i L1-EN, som antatte fosfat bindingssetet [ion bindingssetet] (Y115 /N145 /H230), antatt metall bindingssetet [ion bindingssetet] (D229) og antatte katalytiske setet [aktive området] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (figur 5). Figur 5 Justering av GCRG213p og L1-EN. Red skrift representerer høy konsensus, blå eller svart skrift representerer lav konsensus. GCRG213p inneholdt rester (pilen) som er viktige for endonukleaseaktivitet av L1-EN.
Diskusjon
Det er klart at L1 retrotransposition hendelser har skjedd i somatiske og kjønnsceller. Til tross for at full lengde L1 mRNA er absolutt den dominerende kilden til L1 retrotransposition, varianter endogen L1 ORF2 spleise med potensiell biologisk relevans er funnet uttrykt i ulike somatiske vev. Belancio etc. [20] detektert SpORF2 transkript i en rekke voksne humane vev, og ekspresjonen av SpORF2 mRNA oppviser vevsspesifikk variasjon. Det er således lite sannsynlig å være begrenset bare til fullt ut aktive elementer L1 funksjon. Den SpORF2 kan også produsere funksjonelt ORF2 protein. De fleste ikke-LTR retrotransposons er APE-type ikke-LTR retrotransposons [29]. Krystallstrukturen analyser av menneskelig L1-EN tyder på at det er en prototype for AP-lignende retrotransposon kodet endonucleases, som nick DNA med variabel spesifisitet og er ansvarlig for millioner av retrotransposon innsett i eukaryote genomer [30]. Både APE1 og L1-EN tilhører den store EEP super som deler samme protein stillaset og de samme katalytiske rester.
Tatt i betraktning det faktum at GCRG213p aksjer høy sekvenssammenstillinger med L1-EN, og besitter konserverte rester som er avgjørende for L1 -NO fosfatbindende, metall bindende og katalytisk aktivitet, foreslår vi at GCRG213 er en sammenspleiset L1-ORF2. GCRG213p kan være et funksjonelt medlem av L1-EN-familien, en variant av L1-NO.
Overekspresjon av L1 i tumorer har blitt anerpresentert [12-14]. Den cellulære endogene L1-RT fremstår som en konstitutiv funksjonell komponent i tumorigene celler som er kjennetegnet ved en høy spredning og en lav differensiering status [31, 32]. Men det er få detaljerte undersøkelser av L1-EN i menneskelig svulst. Ergun etc. brukte anti-L1-NO-antistoff for å påvise L1-ORF2 hos voksne humane vev, fant de sterke ORF2p ekspresjon i endotelceller i blodårer i normal human prostata, urinblære og testikkelvev, men ingen ORF2p ekspresjon ble observert i kreftcellene studert [33]. Oricchio etc. [34] rapporterte at stabil L1 RNA interferens kan redusere spredning og fremme differensiering i A-375 melanomceller. De har også observert en reduksjon på L1-ORF2 protein. Men forskerne har ikke identifisert om spredningseffekter var fra L1-EN og /eller L1-RT. Til dags dato er det ingen rapport funnet om rollen til L1-EN på celleproliferasjon og differensiering. I denne studien bekreftet vi at GCRG213p uttrykket ble forhøyet i magekreft på proteinnivå, både i cellen modellen og vevssnitt studert, som er konsistent med vår tidligere studie resultater på mRNA nivå [22]. L1 gjennomgå hypometylering i en rekke tumor vev, inkludert magekreft [35]. Shigaki etc. [36] brukes sulfitt-pyrosekvensering teknologi for å kvantifisere L1 metylering status i resected magekreft prøver. De fant at pasienter gjennomgikk L1 hypometylering opplevd betydelig kortere total overlevelse enn de med hypermethylation. Vi fant i denne studien at L1 var helt metylert i normal mageslimhinnen cellelinje GES-en, men ble delvis metylert i mage kreft cellelinjer. Disse resultatene korrelerer med GCRG213p uttrykksmønster i magekreftcellelinjer, og dermed tilveiebringe mer bevis vedrørende naturen av GCRG213 peptidet. Men vi kunne ikke identifisere en sammenheng mellom GCRG213p uttrykk og overlevelse i denne studien. Intraepitelial neoplasi antas å være et viktig skritt for malign transformasjon av adenokarsinom i ventrikkel, overekspresjon av GCRG213p i disse kjertlene innebar en potensiell rolle GCRG213p i mage onkogenese. Den høye farging score på GCRG213p i godt differensiert magekreft indikerte at det kunne være involvert i magekreft differensiering.
Mens kronisk atrofisk gastritt antas å være en aldersrelatert virksomhet, ble intestinal metaplasi ansett bevis på atrofisk gastritt, siden spesialiserte kjertler hadde blitt erstattet av tarm krypter, så intestinal metaplasi ble ansett som aldersrelaterte. Alder spiller en viktig faktor som styrer utviklingen av mage tarm metaplasi, og pasienter med mage-tarm metaplasi var betydelig eldre enn de uten metaplasi [37]. Tarm metaplasi kjertler vises omfattende GCRG213p farging i denne studien. Samtidig observerte vi at den positive frekvensen av GCRG213p i magekreft vev i den eldre gruppen var høyere enn i den ikke-alderen gruppe. Dette kan innebære at GCRG213p er forbundet med mageslimhinnen aldring og aldersrelaterte virksomheter. Det er ingen studier på sammenhengen mellom L1 uttrykk og alder i dag, men gjennomsnittlig L1 metylering ikke varierer over tid [38, 39]. Det antas at sammenpressing av genomisk DNA ved L1-EN kan indusere celle-toksisitet, noe som resulterer i cellesyklusstans, apoptose eller begynnende alderdom. Ekspresjon av eksogene full-lengde L1 og SpORF2 i de normale humane fibroblaster, kreftceller og voksne stamceller har ført til detekterbar DNA-skade og resulterte i den begynnende alderdom-lignende fenotype [20]. Derfor tror vi at akkumulert aktivitet av GCRG213p, en variant av L1-NO, kan representere en potensiell kilde for aldersrelatert cellulær transformasjon, som til slutt bidrar til cellealdring, eller motsatt, til en ut-av-styrt (ondartet) Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Alkoholforbruk og risiko for magekreft: en kohort studie av menn i Kaunas, Litauen, med opp til 30 år oppfølging
• Induksjon av kromosom ustabilitet og magekreft ved å endre uttrykket mønster av mitotiske sjekkpunkt gener hos mus eksponert for areca-nut