Vyjadrenie varianty LINE-1 endonukleázou u karcinómu žalúdka: jeho vzťah s klinicko-parametrami

Vyjadrenie endonukleasou varianty LINE-1 u karcinómu žalúdka: jeho vzťah s klinicko-parametre
abstraktné
pozadia
dlhé rozptýlené jadrovej elementy-1 (LINE-1 alebo L1), najhojnejšia a len autonómne aktívny rodinnú non-LTR retrotransposons v ľudskom genóme, vyjadrený nielen v zárodočných línií, ale aj v telesných tkanivách. Prispieva k genetickej nestability, starnutie, a ochorení súvisiacich s vekom, ako je rakovina. Naše predchádzajúce štúdie uvádzajú v ľudskom adenokarcinóme žalúdka up-regulovaná transkript GCRG213, ktorý zdieľa 88% homológie s ľudskou sekvenciou L1 a obsahoval predpokladaný konzervovanú apurinová /apyrimidinic endonucleas1 doménu.
Metódy
imunohistochémia bola vykonaná za použitia monoklonálna myšou anti ľudský GCRG213 proteín (GCRG213p) protilátka produkovaná v našom laboratóriu, na mikroskopické sústavy tkanív je konštruované tak vzoriek od 175 pacientov s adenokarcinómom žalúdka. Korelácia medzi GCRG213p prejavu a pacientskych klinicko-parametroch bola vyhodnotená. GCRG213p expresie v žalúdočných nádorových bunkových línií boli študované za použitia analýzy Western blotting. L1 stav metylácie promótorom z buniek karcinómu žalúdka bola testovaná za použitia metylácie špecifickej PCR. BLASTP bol použitý pri Blast servera NCBI identifikovať GCRG213p sekvencie akýchkoľvek zarovnanie v proteínu databázach Data Bank.
Výsledky
Most primárnej rakoviny žalúdka, metastáz do lymfatických uzlín a žalúdočných črevné metaplázia žliaz ukázal pozitívny GCRG213p imunoreaktivitu. Vysoká GCRG213p imunologické farbenie skóre v primárnej rakoviny žalúdka v pozitívnej korelácii s diferenciáciou tumoru (dobre diferencovaný, p = 0,001), Lauren klasifikácia (typ črevné, p menšie ako 0,05) a neskorom veku nástupu adenokarcinóme žalúdka (≥ 65 rokov Pár; p <0,05). GCRG213p výraz nemá žiadnu spojitosť s ďalšími klinicko-parametrov, vrátane prežitie. Western blot analýza GCRG213p expresie v nádorových bunkách žalúdka je uvedené, že úroveň GCRG213p bola vyššia v žalúdočných rakovinové bunkové línie, ako v normálny ľudský žalúdočnej epitel imortalizované bunkové línie GES-1. Parciálne metylácie L1 do buniek karcinómu žalúdka bola potvrdená metylácie špecifické PCR. BLASTP program pre analýzu bolo zistené, že GCRG213p peptid zdieľa 83,0% zarovnanie s C-terminálny oblasti L1 endonukleázy (L1-EN). GCRG213p sekvencie vykazuje významné zvyšky, ktoré tvoria konzervované vlastnosti L1-EN.
Závery
GCRG213p by mohla byť variant L1-EN, funkčné člen L1-EN rodiny. Nadmerná expresia GCRG213p je bežné v oboch primárnej rakoviny žalúdka a lymfatických uzlín. Tieto nálezy poskytujú dôkazy o somatické L1 expresia v karcinómu žalúdka, a jeho možné dopady v podobe nádoru.
Kľúčové
karcinómu žalúdka dlhé rozptýlené jadrovej elementy-1 endonukleázou GCRG213 proteín mikroskopické sústavy tkanív pozadí
dlhé rozptýlené jadrovej elementy -1 (LINE-1, alebo L1) je najhojnejšia a len autonómne aktívna rodina non-LTR retrotransposons v ľudskom genóme a obsahuje asi 17% ľudského genómu [1]. Drvivá väčšina z približne 500000 celkom kópií L1 v ľudskom genóme nie sú schopné prevedenia samy o sebe v dôsledku rôznych mechanizmov, ako je skrátením a inaktivačných mutácií. Avšak, odhadom 80 až 100 full-length, retrotransposition príslušné L1S (RC-L1S) sú prítomné v typickom diploidný ľudského genómu, a malé množstvo, nazývané "hot L1S" vykazujú vysokou účinnosťou retrotransposition [2].
Human RC-L1S sú asi 6,5 kilobajtov a zakódovať dva proteíny (ORF1p a ORF2p) potrebnú na retrotransposition [3]. ORF1p je 40-kDa proteín s RNA viazanie [4] a aktivity nukleovej kyseliny sprevádzania [5]. ORF2p je 150-kDa proteín s endonukleázou (L1-CS), [6] a reverznej transkriptázy (RT-L1), [7] činnosti. L1 prvok môže začleniť do niekoľko sto tisíc genómovej miestach, na voľne definované konsenzuálnej miesto (5'-TTTT /AA-3 '), ktorý je prerezané od L1-EN [8]. Hostiteľský obmedzuje šírenie týchto prvkov, ktoré transkripčný a post-transkripčný tlmenie hluku mechanizmov, ktoré znižujú aktivitu na prijateľnej úrovni [9].
L1 vyjadrené nielen v zárodočných línií, ale aj v telesných tkanivách. Predpokladá sa, že aj nízka úroveň somatického poškodenie DNA v dôsledku L1 aktivity majú potenciál prispieť ku genetickej nestabilite, starnutia a chorôb súvisiacich s vekom, ako je rakovina [10, 11]. L1-ORF1 a ORF2 bola up-regulovaná v rôznych malignít, ako je rakovina prsníka, rakovina pankreasu a zhubných nádorov zárodočných apod [12-14]. L1 hypomethylace bola pozorovaná v rôznych malignít, ako sú hlavy a krku, pažeráka a žalúdka, rakoviny a premalígnych lézií [15, 16]. Stupeň L1 hypometylácii bol tiež spájaný s vyššom stupni a horšie prognózou [17, 18].
L1 indukovanej vplyv na bunky, nie je pravdepodobné, že obmedzený len na plne aktívne prvky. Dokonca L1 elementy s chybnými kódujúcich regiónov ORF1 by mohol robiť RNA, ktorá spojov vyjadriť funkčné ORF2 s radom negatívnych dôsledkov pre bunky [19]. Mnoho tkanív produkujú preložiteľný zostrihané ORF2 (SpORF2) prepis [20]. Spojené L1 transkript, ktorý obsahuje integrant reverznej transkriptázy sekvencie ORF2, sa zistilo, že je podstatné pre proliferáciu ľudského hepatómy buniek [21].
Našou predchádzajúce štúdie [22] identifikoval up-regulovaná transkript s názvom rakovina žalúdka súvisiace s génom 213 (GCRG213) v ľudskom adenokarcinóme žalúdka. BLAST analýzy GCRG213 sekvencie je uvedené 88% homológie s ľudskou LI a odhalil putativní konzervovanú doménu, apurinová /apyrimidinic endonucleas1 (APE), v GCRG213-ORF. Naše najnovšie vyhľadávanie aktualizované databázy GenBank ukazuje GCRG213-ORF obsahuje L1-EN konzervované domény. Tento dokument uvádza, našu súčasnú štúdiu, z ktorej vyplynulo výraz GCRG213 proteín (GCRG213p) v žalúdku rakovinových bunkových línií pomocou monoklonálnej myšou anti-GCRG213p protilátky produkované v našom laboratóriu (geriatrickej ústav, Čína PLA General Hospital, Peking, Čína). Navyše, imunohistochémia (IHC) aplikované na mikroskopické sústavy tkanív (TMA) bol použitý pre vyhodnotenie GCRG213p expresiu v karcinómu žalúdka a normálne žalúdočnú sliznicu. Ďalšie analýzy boli vykonané zistiť, či existuje korelácia medzi GCRG213p prejavu a klinicko-parametrov a prežitie.
Metódy
pacientov
pacientov, ktorí podstúpili gastrektómii pre rakovinu žalúdka v CHKO všeobecnej nemocnice, Peking, Čína od roku 1991 do roku 2003 boli považované za kandidátov pre túto štúdiu. Medzi kritériá odberu vzoriek boli nasledovné: medzi pohlaviami (samce a samice), vek (20 rokov a starší); novodiagnostikovanej (udalosť), karcinóm žalúdka bez predchádzajúceho spracovania; diagnózu histologicky potvrdená; parafínu vložené nádor, spárované okolité non-nádorové žalúdočnej sliznice tkaniva k dispozícii, s karcinómy metastatických do lymfatických uzlín pokiaľ je to možné; a pozitívnych výsledkov následných opatrení v čase TMA výstavby. V dôsledku toho, 175 prípadov bolo prijaté v tejto štúdii, zahŕňajúcej 144 mužov a 31 žien (27 ~ 84 rokov, priemer = 58,58 rokov). Medzi nimi, šesťdesiat sedem prípady sú karcinómy doplnené lymfatických uzlín a šesť prípadov formalínom fixované, parafínových normálne žalúdočné tkaniva boli získané od pacientov bez nádoru, ktoré boli prevádzkované na pretože benígnych žalúdočných ochorení.
Demografické , životný štýl a klinicko-patologické údaje pre prípady vzoriek boli uvedené v tabuľke 1. Všetky nádory boli klasifikované a predstavené podľa revidovaných pokynov presadzovaných Medzinárodnej únie proti rakovine. Následná bol vykonaný za účelom posúdenia ich najnovšie podmienky v roku 2005 na základe konzultácií ich prípade dokladov alebo telefónnych hovorov k pacientom (alebo ich rodinných príslušníkov alebo rodinným lekárom). Minimálny interval 18 mesiacov bola prijatá, a priemerné sledovanie u pacientov, ktorí boli ešte nažive do konca roku 2005 bol 46 mesiacov (rozsah bol od minimálneho 18 do maximálnych 129 mesiacov). Doba prežitia bola vypočítaná odo dňa operácii k dátumu úmrtia alebo k dátumu posledného známeho alive.Table 1 klinicko-parametre pacientov s karcinómom žalúdka študoval v mikroskopickej sústavy tkanív
N (%)
GCRG213p negatívne
GCRG213p kladná hodnota P
rodovej rovnosti
Muž
144 (82.28%)
31
113
0,111
Žena
31 (17,72%)
11
20
Age Hotel < 65 rokov
104 (59,43%)
31
73
0,029
≥65 rok
71 (40,57%)
11
60
fajčenia
Áno
45 (27,27%)
7
38
0,278
Nie
120 (72,73%)
30
90
Pitie
Áno
28 (16,97%)
2
26
0,060
nie
137 (83,03%)
35
102
v rodinnej anamnéze nádoru
Áno
14 (8,43%)
2.
12
0,639
Nie
152 (91,57%)
36
116
umiestnenie nádoru
srdcového
48 (27,43%)
8
40
0,360
telo
37 (21,14%)
10
27
dutine
90 (51,43%)
24
66
veľkosť tumoru (cm)
≤1
11 (6,29%) Sims 3
8
0,506
1-3
42 (24,00%)
13
29 Hotel > 3
122 (69,71%)
26
96
hĺbkou invázie
T1
46 (26,28%)
12
34
0,635
T2
21 (12,00%)
7
14
T3
33 (18,86%)
6
27
T4
75 (42,86%)
17
58
lymfatických uzlín zapojenie
Áno
75 (42,86%)
16
59
0,592
Nie
100 (57,14%)
26
74
stupeň diferenciácie nádoru
No
10 (5,71%) NETHRY.cz 0
10
0,001
Mierne
40 (22,86%)
4
36
Poor
103 (58,86%)
27
76
pečatný prsteň bunky
22 (12,57%)
11
11
nádor etapa (TNM)
0
21 (12,00%) Sims 3
18
0,217
Ia
14 (8,00%)
6
8
Ib
41 (23,43%)
10
31
II
60 (34,29%)
17
43
IIIA
39 (22,28% )
6
33
Lauren klasifikácie
črevnej typu
153 (87,43%)
31
122
0,015
difúznu typ
22 (12,57 %)
11
11
resekcia marža
prítomnosť
6 (3,43%)
0
6
0,361
Absencia
169 (96.57% )
42
127
mikrovaskulárna invázie
prítomnosť
20 (11.43%)
5
15
0,911
Absencia
155 (88,57%)
37
118
Status
nažive
121 (71,18%)
30
91
0,483
mŕtvy
49 (28,82%)
9
40
5 ročné prežitie Hotel < 5 yr
47 (43,93%)
12
48
0,871 Hotel > = 5 yr
60 (50,07%)
10
37
Povolenie bolo dané etickou komisiou Všeobecnej nemocnice PLA, Peking, Čína použiť tkanivá a dáta pre tento projekt. Informovaný súhlas bol tiež získaný od pacientov.
Mikroskopické sústavy tkanív konštrukcie, GCRG213p imunohistochemického farbenia a posúdenie
tkanivových mikročipov (TMA) boli skonštruované, ako bolo opísané skôr [23]. Zo vzoriek sú k dispozícii, sa pripraví šesť tkaniva poľa blokov, z ktorých každý obsahuje 30 prípadov s nádorom, normálne a lymfatických uzlín tkanív ak je k dispozícii.
Antigen získavanie TMA snímok, a formalínom fixované, parafínové tkanivové rezy boli vykonané tlakom varič ošetrenie po dobu 10 minút do získania antigénu roztoku (10 mmol /l citrátu sodného, ​​pH 6,0). Monoklonálna myšou anti ľudská protilátka GCRG213p, ktorý bol produkovaný v našom laboratóriu [24], bola pridaná v riedení 1: 200 a inkubovaná po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Sklíčka potom boli inkubované po dobu 1 hodiny v sekundárnej protilátky. Súpravou Envision (Dako, Carpinteria, CA, USA) bol použitý pre vizualizáciu väzby protilátky, a rezy boli následne kontrastné hematoxylínom. PBS iba farbenie vzorka bol použitý ako kontrola pozadia.
Špecifické žltohnedej imunologické pre GCRG213p bola výhradne nachádza v cytoplazme. To bolo hodnotené samostatne a zaslepeným spôsobom dva vyšetrovatelia (GJ a XL). Tieto inter-observer nezhody (približne 6% z celkového počtu prípadov) boli preskúmané pre druhý čas, po ktorom nasleduje preukaznými rozsudku oboch pozorovateľov. Formálne bodovania bola následne vykonaná jedným skúšajúcim (WG). Intenzita farbenie bolo kvalifikované ako 0 (chýba), 1 (slabý), 2 (stredná) a 3 (silný). Percento pozitívne zafarbených buniek bol hodnotený ako 0 (0% pozitívne), 1 (1-30%), 2 (31-60%) a 3 (viac ako 60%). Kombinovaná posudzovanie farbenie intenzity a predĺženie sa na ohodnotenie GCRG213p výraz. Minimálny počet bodov, keď zhrnul (intenzita + rozšírenie) bola 0 a maximum bolo šesť [25]. Celkové skóre ≥2 bolo považované za GCRG213p pozitívne.
Western blotting analýza
rakovinou žalúdka bunkových línií vrátane SGC-7901, BGC-823 a ľudské normálne žalúdočnej epitel imortalizované bunkové línie GES-1 boli kultivované zbierať a lyžovali s RIPA pufrom na ľade skôr než boli podrobené Western blot analýzy. Koncentrácia proteínu bola detekovaná metódou Bradford s BSA (Sigma-Aldrich) ako štandardu. Rovnaké množstvo bunkového extraktu (40 ug) boli podrobené 8% SDS-PAGE a prenesené na polyvinylidendifluoridovou membránu (Bio-Rad) pre protilátky blotting. Membrána sa potom blokovali inkubovali s myšou anti-GCRG213p protilátky (1: 500) po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti, nasledovala inkubácia s chrenovou peroxidázou konjugovaná sekundárnej protilátky po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Signál bol vizualizovaný s posilnenou detekčného činidla, chemiluminiscenčná. Myšou anti-β-Aktinová protilátky (1: 5000, Sigma). Bola zistená súčasne ako kontrola nanášania
Detekcia metylačného statusu LINE-1 s MSP
validáciu stavu LINE-1 metylácie sa vykonáva za použitia metylácie špecifická PCR (MSP). Celková DNA z SGC-7901, BGC-823, MGC803 a GES-1 buniek bola extrahovaná podľa inštrukcií extrakciu DNA kitu. DNA bola hydrogensiričitanovú upravené, ako bolo opísané skôr [26], po dobu 16 hodín pri teplote 50 ° C. Bisulfitového prevedie DNA bola amplifikovaná PCR za použitia Taq polymerázy (Invitrogen, USA). Primery boli použité [27]:
Linea: nemethylovaný LINE-1 dopredný primer, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: nemethylovaný LINE-1 reverznej primer ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
Linec: methyluje LINE-1 dopredný primer, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
podšívkou: methylata LINE-1 reverznej primer ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
PCR amplifikácie podmienky boli :. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30 s, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61s, 40 cyklov; 72 ° C, 10 min. Výsledné PCR produkty boli vizualizované na 2% agarosovém gélu. Methylata DNA štandardy z Zymo výskumu boli použité ako pozitívna kontrola, dvakrát destilovanej vody ako negatívna kontrola
bol použitý sekvenčné podobnosti a konzervované vyhľadávanie domény
PSI-Blast u NCBI Blast servera [28] (dátum vyhľadávania :. 20 th januára 2012) na identifikáciu GCRG213p sekvencie akýchkoľvek zarovnanie v proteínu databázy Databanka vrátane všetkých neredundantních GenBank CDS preklady, PDB, Swissprot, PIR a PRF. To bolo vykonané pomocou štandardného počiatočným hľadanie BLASTP.
Štatistická analýza
Chi-kvadrát test alebo Fisherov presný pravdepodobnosť sa na ohodnotenie vzťahu medzi GCRG213p prejavu a klinicko-premenných. Celková doba prežitia bola skúmaná GCRG213p výrazu s Kaplan-Meierove krivky. Všetky hodnoty p boli obojstranné a považovaná za štatisticky významnú, ak p < 0.05. Štatistická analýza bola vykonaná pomocou SPSS 13.0 pre Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Výsledky
GCRG213p expresné vzory v normálnej žalúdočnej sliznici a adenokarcinóme žalúdka
odlišný GCRG213p farbenie bol pozorovaný v primárnych adenokarcinómov žalúdka, lymfatické uzlín nádory a non-nádorové žalúdočnej sliznice (obrázok 1). V non-nádorové žalúdočnej sliznice z esopheageal-žalúdočné spojenie a antra oblasti, cytoplazmy diferencované povrchového epitelu a slizničných žliaz ukázali negatívne farbenie, ale pozitívny GCRG213p farbenie bol pozorovaný v bazálnej membráne normálnych žliaz. 133 175 primárnych adenokarcinómov žalúdka, a 51 z 67 nádorov metastazujúcich do lymfatických uzlín, vykazujú pozitívny GCRG213p imunoreaktivitu, ktorý sa nachádza v cytoplazme buniek karcinómu. Obrázok 1 GCRG213p expresie v ľudskej malígny a nemalígna žalúdočnej sliznice. Ako (a) primárne adenokarcinóme žalúdka (100 x) a (B), adenokarcinóm inváziu do lymfatických uzlín (100 x) ukázala pozitívne GCRG213p stainging v cytoplazme; (A) a (B '), preukázali vyšší zväčšenie (400 ×) z oblasti v (A) a (B). (C) V nemalígna žalúdočnej epitelu, pozitívne farbenie bol pozorovaný v bazálnej membráne, ale nie v cytoplazme; GCRG213p imunoreaktivita bola detekovaná v cytoplazme žalúdočných žliaz črevnej metaplázia (šípka) (100 x); . (C) preukázala vyššiu zväčšenia (400 ×) z oblasti v (C)
Podľa klasifikácie Lauren, rakovina žalúdka je rozdelená do dvoch histologických typov: črevnú typu alebo difúzneho typu. Máme 153 prípadov črevnej typu a 22 difúzny Tye prípadov v tejto štúdii. Medzi prípady črevnej typu 153, 34 črevnej metaplázia a 28 intraepiteliálna neoplázia vzorky adjecent sa rakovina boli identifikované. Vek (rok, priemer ± SD) črevnej typu skupiny s črevnej metaplázia (59,67 ± 12,30) bol starší ako difúzny typu skupiny (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 z 34 črevnej metaplázia, a 27 z 28. nízku /vysoko grade intraepiteliálna neoplázia ukázal GCRG213p imunoreaktivitu. Väčšina pozitívnych prípadov ukázalo mierne až stredné zafarbenie (tabuľka 2) .Table 2 GCRG213 výraz v tkanivových vzoriek žalúdočnej
skupín
Počet
GCRG213 výraz
Celkové skóre ‡
PR§ (%)
0-1
2-3
4-5

6
non-nádorové žalúdočné epitel
112
112
0
0
0
0,00
črevnej metaplázia
34
3
18
11
2
91,18 *
s nízkym /high-grade intraepiteliálna neoplázia
28
1
17
10
0
96,43 *
adenokarcinóm bez LNM †
100
26
50
21 Sims 3
74.00 *
adenokarcinóm s LNM
75
16
40
16 Sims 3
78,67 *
nádor metastatické do lymfatických uzlín
67
16
42
8
1
uzlín 76,12 *
† LNM
lymfatické; ‡ Celkové skóre vypočíta ako (skóre intenzita) plus (percento buniek pozitívne skóre), ako je popísané v metódach; §PR
Pozitívne Miera
* V porovnaní s non-nádorové žalúdočnej sliznice, p <.; 0.001.
Pridruženie medzi GCRG213 prejavu a klinicko-parametrov byť
High GCRG213p imunologické skóre v primárnej rakoviny žalúdka v pozitívnej korelácii s diferenciáciou nádoru (p = 0,001) (obrázok 2). Medzitým GCRG213p expresia korelovala s Lauren klasifikácie (p menšie ako 0,05). Percento pozitívneho farbenia GCRG213p vo veku skupiny (výťažok = 65 yr) bola vyššia ako v skupine non-veku (menej ako 65 r) (60/71 = 84,51% v porovnaní s 73/104 = 70,19%, p < 0,05). Avšak, nebol nájdený GCRG213p výraz, ktorý má byť spojený s ďalšími klinicko-parametre, ako sú uvedené v tabuľke 1 (p > 0,05). V 67 pacientov s nádorovým vzoriek ako primárneho nádoru a lymfatické uzliny metastatických, GCRG213p bolo pozitívne v 51 lymfatických uzlín vzoriek a 52 vzoriek primárneho nádoru (76,12% v porovnaní s 77,61%), v danom poradí, čo ukazuje, že zvýšená GCRG213p expresie v lymfatických uzlín metastázujúcej nádor sa zhoduje s GCRG213p výrazom v primárnom karcinómu žalúdka. GCRG213p expresie v lymfatických uzlín bola tiež spojená so stupňami diferenciácie nádoru (p = 0,015), ale nie s ďalšími klinicko-parametrami (p > 0,05). Obrázok 2 Korelácia GCRG213p imunologické skóre v primárnej rakovinou žalúdka s diferenciáciou nádoru. Celkové skóre (OS) z imunobarvením je vyššia v dobre diferencovaným karcinómom než v chudobnom diferencovaný (p = 0,001).
Vzťah GCRG213 prejavu s prežitím
Follow-up informácií je k dispozícii na 175 karcinómom žalúdka pacienti pre obdobie od 18 mesiacov do 14 rokov. Celková miera prežitia sú nasledovné: 91.42% (1 rok), 78.28 %% (2 roky), 56,57% (3 roky), 39,43% (4 roky) a 23,43% (5 rokov). Miera medián prežitia 41 mesiacov.
Na GCRG213p expresiu v primárnych nádorov základe, nebol zistený žiadny významný rozdiel v prežitie medzi pacientmi v GCRG213p negatívnej kategórii v porovnaní s pozitívnym kategórie GCRG213 (X
2
= 2,072, p = 0,558). Rovnako tak nebola pozorovaná korelácia medzi GCRG213p expresiu v lymfatických uzlín a prežitie (X
2
= 3,272, p = 0,195).
GCRG213p expresiu v malígnych a normálnych žalúdočnej sliznice bunkových línií
Western blot testy boli vykonávané na buniek karcinómu žalúdka, vrátane SGC-7901, BGC-823 a nemalígna bunkové línie žalúdočnej sliznice GES-1, aby sa ďalej overiť diferenciálnej expresiu GCRG213p. boli identifikované proteínové pásy asi 35 kDa. Tri bunkové línie testované vyjadrené GCRG213p na rôznych úrovniach. Úroveň GCRG213p bolo vyššie v rakovinové bunkové línie, ako v GES-1 (obrázok 3). Toto zistenie zodpovedá výsledku IHC hlásené v tejto štúdii, to znamená, GCRG213p bol nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka. Obrázok 3 Western Blot analýza celého bunkového extraktu z žalúdočných malígnych a nemalígna buniek pomocou anti-GCRG213p protilátky. Bunky vyjadriť GCRG213p s proteínovými pásmi 35 kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. Filter sa znova skúšaný s anti-beta-aktínu protilátky ku kontrole rovné zaťaženie (dolný panel).
Metylácia špecifické PCR analýzu LINE-1
metylácie špecifickej PCR (MSP) analýzy boli vykonané na rakovinových bunkách žalúdka a non-malígne žalúdočnej sliznice bunkové línie GES-1, za účelom testovania stavu L1 metylácie promótorom v týchto bunkových líniách. Na rozdiel od žalúdočnej nádorových bunkových línií SGC-7901 a BGC-823, tiež študovali karcinómu žalúdka bunkové línie MGC-823, za účelom získania viac informácií o L1 metylácie v žalúdočnej nádorových bunkových línií. PCR produkty amplifikovanej denaturovaným špecifických primerov (MSPM) a nemethylovaných špecifických primerov (MSPU) boli 116-bp a 111 bp, v danom poradí. V GES-1 buniek, produkt PCR bol amplifikovaný s MSPM, ale nie s MSPU, čo naznačuje, že promótory L1 v bunkách GES-1 prešiel úplnej metylácie; V SGC-7901 buniek, BGC-823 buniek a MGC-803 buniek, zodpovedajúce pásma môžu byť amplifikovanej ako s MSPM a MSPU, ukazuje na čiastočné metylácie (obrázok 4). Obrázok 4 Metylácia špecifické PCR (MSP) analýza LINE-1. Elektroforézou na agarosovém gélu z MSP produktov. M: produkt amplifikovaný s methylata-špecifický primer; U: produkt amplifikovaný s nemethylovaný-špecifický primer. PC: pozitívna kontrola, ľudské štandardné methylata DNA; W: dvakrát destilovaná voda kontrola. Všimnite si, že vzorky GES-1 iba ukázať, denaturovaný PCR produktov, zatiaľ čo MGC-803, SGC-7901 a BGC-823 vzorky vykazujú obe methylata a nemethylované PCR produktov.
Bioinformatických identifikácia GCRG213p ako člen L1-EN rodiny program pre analýzu
BLASTP, ako je uvedené vyššie, bolo zistené, že GCRG213p peptid zdieľa zarovnanie 83,0% s C-terminálny oblasti L1-EN. Konzervovanú Domain Search of GCRG213p sekvencie v databáze konzervovanú doménu z NCBI narazí na veľký exonukleázovou /endonukleasa /fosfatázu (EEP) nadčeľade, vrátane endonukleázou doménu non-LTR retrotranspozonu LINE-1, exonukleázovou III (ExoIII) podobného typu ako apurinová /apyrimidinic ( AP) endonukleázy, atď.
Ďalšia analýza pomocou BLASTP vyplýva, že existujú v GCRG213p poradí niektoré zvyšky, ktoré sú dôležité pre zachovaných funkcií L1-EN, ako je domnelý fosfátové väzobné miesto [ion väzobné miesto] (Y115 /N145 /H230), putativní kovové väzobné miesto [ion väzobné miesto] (D229) a predpokladaný katalytické miesto [aktívne miesto] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (obrázok 5). Obrázok 5 Zladenie GCRG213p a L1-EN. Red písmo reprezentuje vysokú zhodu, modré alebo čierne písmo predstavuje nízky konsenzu. GCRG213p obsahovali zvyšky (šípka), ktoré sú dôležité pre endonukleázou aktivita L1-EV.
Diskusiu
Je jasné, že L1 retrotransposition udalosti došlo v somatických a zárodočných buniek. Napriek tomu, že celá dĺžka L1 mRNA sú určite dominantným zdrojom L1 retrotransposition, endogénne L1 ORF2 zostrihu variantoch s potenciálom biologický význam sa nachádzajú vyjadrené v rôznych telesných tkanivách. Belancio atď. [20] zistilo SpORF2 prepis v rôznych dospelých ľudských tkanív a expresie mRNA SpORF2 vykazuje zmenu špecifické tkaniva. Tak, funkcia L1 je nepravdepodobné, že je obmedzený iba na plne aktívne prvky. SpORF2 môže tiež produkovať funkčné ORF2 proteín. Najviac non-LTR retrotranspozony sú APE-type non-LTR retrotranspozony [29]. Kryštálová štruktúra analýzy ľudského L1-SK vyplýva, že sa jedná o prototyp pre AP-like retrotransposon kódované endonukleázy, ktoré nick DNA s variabilným špecifickosťou a sú zodpovedné za milióny retrotransposon inzerciou v eukaryotických genómoch [30]. Obaja APE1 a L1-CZ patrí k veľkému EEP superfamily, ktorý zdieľa rovnaký proteín lešenia a rovnaké katalytické zvyšky.
Vzhľadom na to, že akcie GCRG213p vysokú sekvenčné príklon k L1-EN, a má zachované zvyšky, ktoré sú rozhodujúce pre L1 -SK fosfát väzba, kovová väzba a katalytická aktivita, navrhujeme, aby GCRG213 je zostrihané L1-ORF2. GCRG213p by mohol byť funkčný člen L1-EN rodiny, variant L1-EN.
Zvýšená expresia L1 u nádorov bola široko prezentované [12-14]. Celulárnej endogénnej L1-RT sa ukáže ako konštitutívny funkčné komponenty v nádorových bunkách, ktoré sa vyznačujú vysokou proliferáciou a stavu nízkej diferenciácie [31, 32]. Avšak, existuje len málo detailné prieskumy L1-EN v ľudskom nádoru. Ergun atď. Použité anti-L1-SK protilátky pre detekciu L1-ORF2 v dospelých ľudských tkanivách, zistili, že silné ORF2p expresiu v endotelových bunkách krvných ciev v normálnej ľudskej prostaty, močového mechúra a testikulárne tkaniva, ale nie expresia bola pozorovaná u ORF2p rakovinové bunky študované [33]. Oricchio atď. [34] hlásil, že stabilný L1 RNA interferencie by mohla znížiť proliferáciu a podporovať diferenciáciu A-375 buniek melanómu. Tiež pozorované zníženie L1-ORF2 proteínu. Ale vedci nezistili, či účinky zbraní hromadného ničenia boli od L1-EN a /alebo L1-RT. K dnešnému dňu je tu našiel o úlohe L1-EN na proliferáciu a diferenciáciu buniek žiadna správa. V tejto štúdii sme opätovne potvrdil, že GCRG213p expresia bola zvýšená u karcinómu žalúdka na proteínovej úrovni, a to ako v modeli bunkovej a tkanivovej rezy študovali, čo je v súlade s našimi predchádzajúcimi výsledkami štúdie na úrovni mRNA [22]. L1 prechádzajú hypometylácii v rôznych nádorových tkanivách, vrátane rakoviny žalúdka [35]. Shigaki atď. [36] použili bisulfitového pyrosekvenování technológiu na kvantifikáciu stavu L1 metylácie vo vzorkách po resekcii s karcinómom žalúdka. Zistili, že pacienti podstúpili L1 hypometylácii došlo podstatne kratšia prežitia ako pacienti s hypermetylace. Zistili sme, že v tejto štúdii L1 bol úplne metylovaný v normálnej žalúdočnej sliznice bunkové línie GES-1, ale bol čiastočne methyluje v žalúdočných nádorových bunkových línií. Tieto výsledky korelujú s GCRG213p expresného profilu v žalúdočnej rakovinové bunkové línie, a tak poskytujú ďalšie dôkazy o povahe GCRG213 peptidu. Avšak, sme nemohli určiť koreláciu medzi GCRG213p prejavu a prežitie v tejto štúdii. Intraepiteliálna neoplázia je považované za kľúčový krok malígne transformáciu adenokarcinóme žalúdka, nadmerná expresia GCRG213p v týchto žliaz implikoval potenciálnu úlohu GCRG213p v žalúdku onkogenézy. Vysoká imunologické skóre GCRG213p v dobre diferencovaného karcinómu žalúdka je uvedené, že by mohol byť zapojený v žalúdočnej diferenciácie rakoviny.
Kým chronická na liečenie atrofickej gastritída sa predpokladá, že subjekt, súvisiace s vekom, črevné metaplázia bol považovaný za dôkaz atrofickou gastritídu, pretože špecializované žľazy bol nahradený črevných krýpt, takže črevná metaplázia bola považovaná za súvisiace s vekom. Vek hrá dôležitú faktor upravujúce vývoj žalúdočné črevnej metaplázia, a pacienti so žalúdočnými črevnej metaplázia boli výrazne starší, ako tých, ktorí nemajú metaplázia [37]. Črevné metaplázia žľazy zobrazená rozsiahlu GCRG213p imunologické v tejto štúdii. Medzitým, sme pozorovali, že pozitívne miera GCRG213p v žalúdočných rakovinových tkanivách vo veku skupiny bola vyššia ako v skupine non-veku. To by mohlo znamenať, že GCRG213p je spájaný s žalúdočnej sliznice starnutím a osobami s vekom. Neexistuje žiadna štúdia o pridružení medzi L1 prejavu a veku v súčasnej dobe, ale priemerná L1 metylácie nemenila v priebehu času [38, 39]. Predpokladá sa, že vrúbkovanou genómovej DNA L1-EN môžu indukovať bunkovú toxicitu, čo vedie k zastaveniu bunkového cyklu, apoptózy alebo starnutie. Expresia exogénne plnej dĺžky L1 a SpORF2 v normálnej ľudskej fibroblasty, rakovinové bunky a dospelé kmeňové bunky viedlo k detekovateľné poškodenie DNA a viedlo k Senescence fenotyp podobný [20]. Preto sme podozrenie, že nahromadené činnosť GCRG213p, variant L1-EN, môžu predstavovať potenciálny zdroj pre transformáciu buniek súvisiace s vekom, čo v konečnom dôsledku prispieva k bunkového starnutia, alebo opačne, aby out-of-kontrolovanej (malígny) Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Konzumácia alkoholu a riziko rakoviny žalúdka: kohorta štúdie mužov v Kaunas, Litva, s až 30 rokoch sledovania up
• Indukcia nestability chromozómov a rakoviny žalúdka zmenou expresného profilu mitotických kontrolných bodov génov u myší vystavených areku-nut