La expresión de una variante de la endonucleasa de LINE-1 en el cáncer gástrico: su asociación con la expresión parameters

clínico-patológica de una variante endonucleasa LINE-1 en el cáncer gástrico: su asociación con parámetros clínico
Resumen Antecedentes
¿Cuánto tiempo entremezcla element- nuclear 1 (LINE-1 o L1), la familia más abundante y sólo de forma autónoma activa de no retrotransposones LTR en el genoma humano, expresa no sólo en las líneas germinales, sino también en tejidos somáticos. Se contribuye a la inestabilidad genética, el envejecimiento y enfermedades relacionadas con la edad, como el cáncer. Nuestro estudio anterior identificado en adenocarcinoma gástrico humano una GCRG213 transcripción upregulated, que comparte 88% de homología con la secuencia de L1 humano y contenía un dominio endonucleas1 apurinic /apyrimidinic conservadas putativo.
Métodos
La inmunohistoquímica se llevó a cabo mediante el uso de un anti-ratón monoclonal anticuerpo humana- proteína GCRG213 (GCRG213p) producido en nuestro laboratorio, en los microarrays de tejidos construidos con muestras de 175 pacientes con adenocarcinoma gástrico. Se evaluó la correlación entre la expresión GCRG213p y parámetros clínico del paciente. GCRG213p expresión en líneas celulares de cáncer gástrico fueron estudiados mediante análisis de transferencia Western. L1 estado de metilación del promotor de células de cáncer gástrico se ensayó usando PCR específica de metilación. BLASTP se utilizó en la explosiva servidor de NCBI para identificar la secuencia GCRG213p a cualquier alineaciones en las bases de datos de proteínas Banco de Datos.
Resultados
mayoría de los cánceres gástricos primarios, metástasis en los ganglios linfáticos y glándulas gástricas metaplasia intestinal mostraron inmunorreactividad GCRG213p positivo. Alta GCRG213p inmunotinción puntuación en el cáncer gástrico primario se correlacionó positivamente con la diferenciación del tumor (bien diferenciadas, p = 0,001), la clasificación de Lauren (tipo intestinal, p < 0,05) y una edad de inicio tardío de adenocarcinoma gástrico (≥ 65 años; p < 0,05). GCRG213p expresión no tiene ninguna asociación con otros parámetros clínico, incluyendo la supervivencia. análisis de transferencia de Western de la expresión GCRG213p en células de cáncer gástrico indicó que el nivel GCRG213p fue mayor en líneas celulares de cáncer gástrico que en el epitelio gástrico línea celular inmortalizada humana normal GES-1. metilación parcial de L1 en células de cáncer gástrico se confirmó mediante PCR específica de metilación. análisis de programas BLASTP reveló que el péptido GCRG213p compartida alineación 83,0% con la región C-terminal de L1 endonucleasa (L1-ES). GCRG213p secuencia posee los residuos importantes que componen las características conservadas de L1-EN.
Conclusiones
GCRG213p podrían ser una variante de L1-EN, un miembro funcional de la familia L1-EN. La sobreexpresión de GCRG213p es común en tanto primaria del cáncer y la metástasis de los ganglios linfáticos gástrico. Estos resultados proporcionan evidencia de expresión L1 somática en el cáncer gástrico, y sus posibles consecuencias en forma de tumor.
Palabras clave
carcinoma gástrico largos períodos de actividad element-1 endonucleasa de la proteína GCRG213 Tissue microarrays de fondo nuclear Cuánto tiempo intercalados elemento nuclear -1 (LINE-1 o L1) es la familia más abundante y sólo de forma autónoma activa de no retrotransposones LTR en el genoma humano y comprende aproximadamente el 17% del genoma humano [1]. La gran mayoría de los aproximadamente 500.000 copias totales de L1 en el genoma humano no son capaces de transposición por su cuenta debido a diversos mecanismos como truncamientos y mutaciones que inactivan. Sin embargo, se estima que el 80-100 de larga duración, L1 retrotransposition competentes (RC-L1s) están presentes en un genoma diploide humana típica, y un pequeño número, denominado "caliente L1" exhiben una alta eficiencia retrotransposition [2].
Humano RC-L1 son alrededor de 6,5 kb y codifican dos proteínas (ORF1p y ORF2p) necesarios para retrotransposition [3]. ORF1p es una proteína de 40-kDa con ARN de unión a [4] y las actividades de chaperona de ácidos nucleicos [5]. ORF2p es una proteína de 150 kDa con la endonucleasa (L1-EN) [6] y la transcriptasa inversa (RT-L1) [7] actividades. elemento L1 puede integrarse en varios cientos de miles lugares del genoma, en un sitio de consenso vagamente definido (5'-TTTT /AA-3 '), que está mellado por L1-EN [8]. El huésped limita la propagación de tales elementos por los mecanismos de silenciamiento transcripcional y post-transcripcional que reducen la actividad a niveles tolerables [9].
L1 expresa no sólo en las líneas germinales, sino también en tejidos somáticos. Se sugiere que incluso niveles bajos de daño en el ADN somático debido a la actividad L1 tienen el potencial de contribuir a la inestabilidad genética, el envejecimiento y enfermedades relacionadas con la edad, como el cáncer [10, 11]. L1-ORF1 y ORF2 se upregulated en una variedad de neoplasias malignas, como el cáncer de mama, cáncer de páncreas y tumores de células germinales malignos, etc. [12-14]. se observó L1 hipometilación en una variedad de tumores malignos tales como cabeza y cuello, cáncer de esófago y el estómago, y en lesiones premalignas [15, 16]. El grado de L1 hipometilación también se asoció con una etapa más avanzada y más pobre pronóstico [17, 18].
Influencia inducida por L1 a las células no es probable limita sólo a elementos totalmente activos. Incluso los L1 elementos con regiones codificantes ORF1 defectuosos podrían hacer un ARN que empalma para expresar un ORF2 funcional con una serie de consecuencias negativas para la célula [19]. Muchos tejidos producen ORF2 empalmado (SpORF2) transcripción traducible [20]. Una transcripción L1 empalmado que incluye la secuencia de la transcriptasa inversa integrante de ORF2, se encontró que era esencial para la proliferación celular de hepatoma humano [21].
Nuestro estudio anterior [22] identificó una transcripción upregulated, llamado cáncer gástrico relacionado con el gen 213 (GCRG213) , en el adenocarcinoma gástrico humano. BLAST análisis de la secuencia de GCRG213 indicó 88% de homología con LI humana y reveló un dominio conservado putativo, apurinic /apyrimidinic endonucleas1 (APE), en GCRG213-ORF. Nuestra última búsqueda de la base de datos GenBank actualizado muestra GCRG213-ORF contiene una L1-ES conserva dominio. Este documento informa de nuestro presente estudio que se ha confirmado la expresión de la proteína GCRG213 (GCRG213p) en líneas celulares de cáncer gástrico mediante el uso de anticuerpos anti-GCRG213p monoclonal de ratón producido en nuestro laboratorio (Instituto Geriátrico, China el Hospital General del EPL, Pekín, China). Además, la inmunohistoquímica (IHC) aplicada en microarrays de tejidos (TMA) se utilizó para evaluar la expresión GCRG213p en el cáncer gástrico y la mucosa gástrica normal. Se realizaron otros análisis para ver si existe alguna correlación entre la expresión GCRG213p y los parámetros clínico-patológicos y supervivencia.
Métodos Pacientes

Los pacientes que se sometieron a gastrectomía por cáncer gástrico en el Hospital General de PLA, Beijing, China, 1991-2003 fueron considerados candidatos para este estudio. Los criterios de muestreo fueron los siguientes: sexo (machos o hembras), la edad (20 años o más); recién diagnosticada (incidente) carcinoma gástrico sin tratamiento previo; histológicamente confirmado diagnóstico; parafina tumor incrustado, emparejado los tejidos circundantes de la mucosa gástrica no tumorales disponibles, con carcinomas metastásicos a los ganglios linfáticos si es posible; y los resultados positivos de seguimiento en el momento de la construcción TMA. Como resultado, 175 casos fueron reclutados en este estudio, que comprende 144 hombres y 31 mujeres (27 ~ 84 años, media = 58.58 años). Entre ellos, sesenta y siete casos tienen carcinomas acompañados con metástasis en los ganglios linfáticos, y seis casos de fijado con formalina, tejidos gástricos normales incluidos en parafina fueron también obtenidas de pacientes no tumorales que fueron operados a causa de las enfermedades gástricas benignas.
Demográfica , estilo de vida y los datos clínico-patológicas de los casos de la muestra se muestran en la Tabla 1. Todos los tumores se clasificaron y organizaron de acuerdo a las directrices revisadas que preconiza la Unión Internacional contra el cáncer. El seguimiento se realizó para evaluar sus últimas condiciones en el año 2005 mediante la consulta de sus documentos del caso oa través de llamadas telefónicas a los pacientes (o sus familiares o médicos de familia). Se adoptó un intervalo mínimo de 18 meses, y la mediana del tiempo de seguimiento para los pacientes que todavía estaban vivos a finales de 2005 fue de 46 meses (rango fue desde el mínimo al máximo de 18 129 meses). El tiempo de supervivencia se calculó a partir de la fecha de la cirugía a la fecha de la muerte o la última fecha conocida alive.Table 1 parámetros clínico de los pacientes con cáncer gástrico estudiados en microarrays de tejidos
N (%) guía empresas GCRG213p negativo
GCRG213p positivo valor de p
Sexo Masculino

144 (82.28%)
31
113
0,111
Mujer
31 (17,72%) página 11
20
Edad Hotel < 65 años
104 (59,43%): perfil 31
73
0,029
≥65 años
71 (40,57%) página 11
60
fumar
Sí
45 (27,27%) página 7
38
0,278
No
120 (72.73%)
30
90
Beber
Sí
28 (16,97%)
2 26
0.060
sin
137 (83.03%)
35
102
la historia de la familia de tumores
Sí página 14 (8,43%)
2 12
0,639
No se
152 (91.57%)
36
116
Localización del tumor cardíaco

48 (27,43%) página 8
40
0.360
cuerpo
37 (21,14%)
10
27
antro
90 (51.43%): perfil 24
66
El tamaño del tumor (cm)
≤1 página 11 (6,29%) página 3 página 8
0,506
1-3
42 (24.00%) página 13
29 Hotel > 3
122 (69.71%)
26
96
profundidad de la invasión
T1
46 (26.28%) página 12
34
0,635
T2
21 (12,00%) página 7 página 14
T3
33 (18,86%) página 6
27
T4
75 (42,86%)
17
58
implicación de nódulos linfáticos
Sí
75 (42,86%)
16
59
0.592
Sin
100 (57,14%)
26
74 del tour de diferenciación tumoral de
Bueno
10 (5,71%)
0
10
0,001
Moderado
40 (22,86%)
4
36
Pobre
103 (58.86%)
27
76
Sello de células en anillo de
22 (12,57%) página 11 página 11
etapa del tumor (TNM)
0
21 (12,00%) Estrellas: 3
18
0,217
Ia página 14 (8,00%) página 6 página 8
Ib
41 (23.43%)
10
31
II
60 (34.29%): perfil 17
43
IIIa
39 (22,28% ): perfil del 6
33
clasificación de Lauren
tipo intestinal
153 (87,43%)
31
122
0,015
difusa tipo
22 (12.57 %) página 11 página 11
margen de resección
Presencia página 6 (3,43%) 0
página 6
0,361
Ausencia
169 (96.57% ): perfil 42
127
microvascular invasión
Presencia
20 (11,43%) página 5
15
0,911
Ausencia
155 (88.57%)
37
118
Estado
viva
121 (71.18%)
30
91
0.483 muertos

49 (28,82%)
9
40 página 5 años de supervivencia Hotel < 5 años
47 (43.93%) página 12
48
0,871 Hotel > = 5 años
60 (50.07%)
10
37
El permiso fue dado por el comité de ética del Hospital General del EPL, Beijing, China para utilizar el tejido y los datos para este proyecto. El consentimiento informado se obtuvo también a partir de los pacientes.
construcción de tejido microarrays, GCRG213p tinción inmunohistoquímica y la evaluación
Los microarrays de tejidos (TMA) se construyeron como se describe anteriormente [23]. A partir de las muestras disponibles, se prepararon seis bloques de la matriz de tejido, cada uno con 30 casos con tumores, tejidos normales y de ganglios linfáticos si están disponibles.
La recuperación de antígenos de TMA diapositivas, y, secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina se realizaron por la presión tratamiento cocina durante 10 minutos en una solución de recuperación de antígeno (/L de tampón de citrato de sodio 10 mmol, pH 6,0). anticuerpo anti GCRG213p humano monoclonal de ratón, que fue producido en nuestro laboratorio [24], se añadió a una dilución de 1: 200 y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Los portaobjetos se incubaron a continuación durante 1 h en anticuerpo secundario. Un kit EnVision (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) se utiliza para visualizar la unión de anticuerpos, y las diapositivas fueron posteriormente counterstained con hematoxilina. Un PBS-única muestra la tinción se utilizó como un control de fondo.
Inmunotinción de color amarillo-marrón específico para GCRG213p se encuentra exclusivamente en el citoplasma. Se obtuvo de manera independiente y en una forma ciega por dos investigadores (GJ y XL). Las discrepancias entre observadores (aproximadamente el 6% del total de casos) fueron revisados ​​por segunda vez, seguido de un juicio concluyente por ambos observadores. formal de puntuación se llevó a cabo posteriormente por un investigador (WG). La intensidad de la tinción se clasificó como 0 (ausente), 1 (débil), 2 (moderada), y 3 (fuerte). El porcentaje de células teñidas positivamente se puntuó como 0 (0% positivo), 1 (1-30%), 2 (31-60%), y 3 (> 60%). Combinado la evaluación de la intensidad de la tinción y la extensión se utilizó para evaluar la expresión GCRG213p. La puntuación mínima cuando se suman (intensidad + extensión) fue de 0, y la máxima de 6 [25]. GCRG213p Puntuación final de ≥2 se consideró positivo.
Análisis de transferencia Western
líneas celulares de cáncer gástrico incluyendo SGC-7901, BGC-823 y la línea humana normal epitelio gástrico inmortalizada de células GES-1 se cultivaron, se recogieron y se lisaron con el tampón RIPA en hielo antes de ser sometido a análisis de transferencia de Western. La concentración de proteína se detectó por el método de Bradford con BSA (Sigma-Aldrich) como el estándar. Cantidades iguales de extracto de células (40 g) se sometieron a 8% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad) para la transferencia de anticuerpos. a continuación, se bloqueó la membrana, se incubaron con anticuerpo de ratón anti-GCRG213p (1: 500) durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de incubación con un anticuerpo secundario de rábano picante conjugado con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. La señal se visualizó con un reactivo de detección de quimioluminiscencia. El anticuerpo-β-actina contra ratón (1: 5000, Sigma). Se detectó simultáneamente como control de carga
de detección de estado de metilación de LINE-1 con MSP
Validación de estado LINE-1 metilación se lleva a cabo utilizando -PCR específica de metilación (MSP). El ADN total de SGC-7901, BGC-823, MGC803 y GES-1 en las células se extrajo de acuerdo con las instrucciones del kit de extracción de ADN. El ADN fue modificada por bisulfito como se describe anteriormente [26] durante 16 horas a 50 ° C. ADN convertido-bisulfito se amplificó por PCR usando Taq polimerasa (Invitrogen, EE.UU.). Los cebadores utilizados fueron [27]:
Línea: no metilado LINE-1 cebador directo, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: cebador inverso LINE-1 no metilado, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
Linec: metilado imprimación LINE-1 hacia adelante, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
forrado: 1-LÍNEA cebador inverso metilado, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG | condiciones actuales de amplificación de PCR fueron:. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30 ° C, 58, 45s, 72 ° C, 61s, 40 ciclos; 72 ° C, 10 min. Los productos resultantes de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 2%. Normas de ADN metilado de Investigación Zymo se utilizaron como control positivo, el agua doblemente destilada como control negativo
similitud de secuencias conservadas y de búsqueda de dominios
PSI-Blast se utilizó en el servidor NCBI BLAST [28] (fecha de búsqueda:. 20 de enero de 2012) para identificar la secuencia GCRG213p a cualquier alineación en el Protein Data Bank bases de datos incluyendo todos no redundantes GenBank CDS traducciones, PDB, SwissProt, PIR y PRF. Se realiza con un estándar de búsqueda inicial BLASTP.
El análisis estadístico
prueba de Chi-cuadrado o se empleó la probabilidad exacta de Fisher para evaluar la relación entre la expresión GCRG213p y variables clínico. La supervivencia global fue examinado por la expresión GCRG213p con curvas de Kaplan-Meier. Todos los valores de p fueron de dos caras y considerado estadísticamente significativo si p < 0.05. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 13.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultados
patrones de expresión GCRG213p en la mucosa gástrica normal y adenocarcinoma gástrico
tinción GCRG213p distinto se observó en los adenocarcinomas gástricos primarios, la linfa tumores metástasis en los ganglios, y la mucosa gástrica no tumoral (Figura 1). En la mucosa gástrica no tumoral de la salida esopheageal-gástrico y el área del antro, el citoplasma de epitelio de la superficie diferenciada y glándulas mucosas mostró tinción negativa, pero no se observó tinción positiva GCRG213p en la membrana basal de las glándulas normales. 133 de 175 adenocarcinomas gástricos primarios, y 51 de 67 tumores metastásicos a los ganglios linfáticos mostró inmunorreactividad GCRG213p positiva, que estaba situado en el citoplasma de las células de carcinoma. Expresión figura 1 GCRG213p en la mucosa gástrica maligno y no maligno humano. Ambos (A) adenocarcinoma gástrico primario (100 ×) y adenocarcinoma (B) en el invadido los ganglios linfáticos (100 ×) mostraron GCRG213p positivo stainging en el citoplasma; (A ') y (B') demostraron el aumento mayor (400 veces) de la zona en (A) y (B). (C) en el epitelio gástrico no maligno, se observó tinción positiva en la membrana basal, pero no en el citoplasma; GCRG213p inmunorreactividad se detectó en el citoplasma de las glándulas gástricas intestinal metaplasia (flecha) (100 veces); . (C ') demostraron el aumento mayor (400 veces) de la zona en (C)
Según la clasificación de Lauren, cáncer gástrico se divide en dos tipos histológicos: de tipo intestinal o de tipo difuso. Tenemos 153 casos de tipo intestinal y difuso 22 casos-tye en este estudio. Entre los casos de tipo intestinal, 153, 34 metaplasia intestinal y 28 muestras de neoplasia intraepitelial adjecent se identificó el cáncer. La edad (años, media ± DE) del grupo de tipo intestinal con metaplasia intestinal (59.67 ± 12.30) era mayor que el grupo de tipo difuso (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 de 34 metaplasia intestinal, y 27 de 28 de la neoplasia de baja /alta intraepitelial de grado mostraron inmunorreactividad GCRG213p. La mayor parte de los casos positivos mostraron leve a moderada tinción (Tabla 2) .Tabla expresión 2 GCRG213 en muestras de tejido gástrico Barcelona Grupos
Número
expresión GCRG213
La puntuación global ‡
PR§ (%)
0-1
2-3
4-5

6
no tumoral epitelio gástrico
112 112

0 0

0
0.00
La metaplasia intestinal
34
3
18 página 11
2 91.18 *
Bajo /neoplasia intraepitelial de alto grado
28
1 | 17
10
0
96.43 *
adenocarcinoma sin MNV †
100
26
50
21 página 3
74.00 *
adenocarcinoma con MNV
75
metastásico 16
40
16 página 3
78.67 *
tumor a los ganglios linfáticos
67
16
42 página 8
1 | 76.12 * †
MNV
metástasis de ganglios linfáticos; ‡ La puntuación global calculado como (puntuación de intensidad) más (porcentaje de células puntuación positiva) como se describe en los métodos; §PR
tasa positiva
* En comparación con los no tumoral mucosa gástrica, p. ≪ 0.001.
Asociación entre la expresión GCRG213 y parámetros clínico
alto puntaje GCRG213p inmunotinción en el cáncer gástrico primario se correlacionó positivamente con la diferenciación del tumor (p = 0,001) (Figura 2). Mientras tanto, la expresión GCRG213p se correlacionó con la clasificación de Lauren (p < 0,05). El porcentaje de tinción positiva GCRG213p en el grupo de edad (> = 65 años) fue mayor que en el grupo no curado (< 65 años) (60/71 = 84,51% frente a 73/104 = 70.19%, p < 0,05). Sin embargo, no se encontró expresión GCRG213p estar asociado con otros parámetros clínico como los enumerados en la Tabla 1 (p > 0,05). En los 67 pacientes con muestras de tumores tanto en el tumor primario y los ganglios metastásicos nodo, GCRG213p fue positivo en muestras de 51 ganglios linfáticos metástasis y 52 muestras de tumores primarios (76,12% frente a 77,61%), respectivamente, lo que indica que la expresión GCRG213p elevada en linfático metastásico nodo tumor es concordante con la expresión GCRG213p en el carcinoma gástrico primario. expresión GCRG213p en las metástasis de ganglios linfáticos también se asoció con los grados de la diferenciación del tumor (p = 0,015), pero no con otros parámetros clínico (p > 0,05). Figura 2 Correlación de GCRG213p puntuación de inmunotinción en el cáncer gástrico primario con la diferenciación del tumor. La puntuación global (OS) de inmunotinción es mayor en el cáncer bien diferenciado de aquel en el poco diferenciado (p = 0,001).
Relación de expresión GCRG213 con la supervivencia
Seguimiento de la información estaba disponible en 175 cáncer gástrico pacientes por períodos que van desde 18 meses a 14 años. En general las tasas de supervivencia son los siguientes: 91.42% (1 año), 78.28 %% (2 años), 56,57% (3 años), 39,43% (4 años) y 23,43% (5 años). La tasa de supervivencia media es de 41 meses.
Sobre la base de la expresión GCRG213p en tumores primarios, no hubo diferencia significativa en la supervivencia entre los pacientes en la categoría negativa GCRG213p en comparación con la categoría positiva GCRG213 (X
2
= 2,072, p = 0,558). Del mismo modo, no se observó correlación entre la expresión GCRG213p en la metástasis de los ganglios linfáticos y la supervivencia (X
2
= 3,272, p = 0,195). GCRG213p expresión Hoteles en líneas de células de la mucosa gástrica malignas y normales
ensayos de transferencia Western se realizaron en células de cáncer gástrico incluyendo SGC-7901, BGC-823 y no maligno línea celular de la mucosa gástrica GES-1, con el fin de validar la expresión diferencial de GCRG213p. Se identificaron las bandas de proteína de aproximadamente 35 kDa. Tres líneas celulares ensayadas expresaron GCRG213p a diferentes niveles. nivel GCRG213p se encontró mayor en las líneas celulares de cáncer que en GES-1 (Figura 3). Este hallazgo coincide con el resultado IHC se informa en este estudio, es decir, GCRG213p fue encontrado sobreexpresado en el cáncer gástrico. La figura 3 el análisis de transferencia de Western de extracto de células enteras a partir de células malignas y no malignas gástricas utilizando anticuerpo anti-GCRG213p. Células expresan GCRG213p con bandas de proteína de 35-kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. El filtro se volvió a sondear con anticuerpo anti-β-actina para controlar la igualdad de carga (panel inferior).
-Metilación específica análisis de PCR de LINE-1
metilación específica de PCR (MSP) se realizaron análisis en células de cáncer gástrico y línea de células de la mucosa gástrica no maligno GES-1, con el fin de probar el estado de metilación del promotor L1 en estas líneas celulares. Además de las líneas celulares de cáncer gástrico SGC-7901 y la línea celular de cáncer gástrico BGC-823, también estudiamos MGC-823, con fines de proporcionar más información acerca de L1 metilación en líneas celulares de cáncer gástrico. Los productos de PCR amplificados con cebadores metilados específicos (MSPM) y cebadores metilados específicos (MSPU) fueron de 116 pb y 111 pb, respectivamente. En las células GES-1, producto de la PCR se amplificó con MSPM, pero no con MSPU, lo que sugiere que los promotores de L1 en células de GES-1 fueron sometidos a metilación completa; En las células SGC-7901, células BGC-823 y las células MGC-803, las bandas correspondientes se pueden amplificar con tanto MSPM y MSPU, indicativo de metilación parcial (Figura 4). Figura 4 análisis PCR específica de metilación (MSP) de LINE-1. electroforesis en gel de agarosa de los productos de MSP. M: producto amplificado con el cebador metilada específica; U: producto amplificado con el cebador no metilado-específico. PC: control positivo, estándar de ADN metilado humana; W: doble control de agua destilada. Tenga en cuenta que las muestras GES-1 muestran únicamente los productos de PCR metilados, mientras que el MGC-803, las muestras SGC-7901 y BGC-823 muestran ambos productos de PCR metilados y no metilados.
Identificación bioinformático de GCRG213p como miembro de la familia L1-ES análisis de programas
BLASTP, como se mencionó anteriormente, reveló que el péptido GCRG213p compartida alineación 83,0% con la región C-terminal de L1-eN. Conservadas de dominio de búsqueda de secuencia GCRG213p en la base de datos de dominio Conservadas de NCBI golpea el gran exonucleasa /endonucleasa /fosfatasa (EEP) superfamilia, incluyendo endonucleasa de dominio de la no-LTR retrotransposon LINE-1, exonucleasa III (ExoIII) -como apurinic /apyrimidinic ( AP) endonucleasas, etc.
análisis más detallado utilizando BLASTP indica que no están en secuencia GCRG213p algunos residuos que son importantes para las funciones conservadas de L1-eS, tales como el fosfato putativo sitio de unión [sitio de unión de iones] (Y115 /N145 /H230), de metal putativo sitio de unión [sitio de unión de iones] (D229) y el sitio catalítico putativo [sitio activo] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (Figura 5). Figura 5 Alineación de GCRG213p y L1-EN. Fuente roja representa alto consenso, fuente azul o negro representa bajo consenso. GCRG213p contenía residuos (flecha) que son importantes para la actividad endonucleasa de L1-EN.
Discusión
Es claro que los acontecimientos L1 retrotransposition se han producido en las células somáticas y germinales. A pesar del hecho de que la longitud total L1 ARNm son sin duda la fuente dominante de L1 retrotransposition, endógena de empalme L1 ORF2 variantes con potencial relevancia biológica se encuentran expresa en diferentes tejidos somáticos. Belancio etc. [20] detectaron SpORF2 transcripción en varios tejidos humanos adultos y la expresión de mRNA SpORF2 exhibe variación específica de tejido. Por lo tanto, la función de L1 es poco probable que se limita sólo a elementos totalmente activos. El SpORF2 también puede producir la proteína ORF2 funcional. La mayoría no retrotransposones LTR son de tipo APE no retrotransposones LTR [29]. analiza la estructura cristalina de la humana L1-ES indican que se trata de un prototipo para endonucleasas AP-como retrotransposones codificada, que nick ADN con especificidad variable y son responsables de millones de inserciones retrotransposón en genomas eucariotas [30]. Tanto APE1 y L1-ES pertenecen a la gran superfamilia EEP que comparte el mismo andamio de proteínas y los mismos residuos catalíticos.
Teniendo en cuenta el hecho de que las alineaciones acciones GCRG213p alta con la secuencia de L1-ES, y posee residuos conservados que son cruciales para L1 unión, unión de metal y la actividad catalítica de fosfato -ES, proponemos que GCRG213 es un empalmados-L1 ORF2. GCRG213p podría ser un miembro funcional de la familia L1-EN, una variante de L1-EN.
La sobreexpresión de L1 en los tumores ha sido ampliamente presentado [12-14]. El celular endógeno L1-RT surge como un componente funcional constitutiva en las células oncogénicas que se caracterizan por una alta proliferación y un estado de baja diferenciación [31, 32]. Sin embargo, hay pocos estudios detallados de L1-ES en tumores humanos. Ergun etc. utilizó anticuerpo anti-L1-EN para detectar la L1-ORF2 en tejidos humanos adultos, encontraron expresión ORF2p fuerte en las células endoteliales de los vasos sanguíneos en la próstata humana normal, la vejiga urinaria y el tejido testicular, pero no se observó expresión en ORF2p las células de cáncer estudiados [33]. Oricchio etc. [34] informó de que la interferencia de ARN estable L1 podría reducir la proliferación y promover la diferenciación de células A-375 de melanoma. También observaron una reducción de la proteína L1-ORF2. Sin embargo, los investigadores no han identificado si los efectos de proliferación eran de L1-EN y /o L1-RT. Hasta la fecha, no hay ningún informe encontrado sobre el papel de L1-ES sobre la proliferación celular y la diferenciación. En este estudio, se volvió a confirmar que la expresión GCRG213p fue elevada en el cáncer gástrico en el nivel de proteínas, tanto en el modelo de células y las secciones de tejido estudiadas, lo cual es consistente con nuestros anteriores resultados del estudio a nivel de ARNm [22]. L1 se someten a la hipometilación en una variedad de tejidos tumorales, incluyendo el cáncer gástrico [35]. Shigaki etc. [36] utiliza la tecnología de pirosecuenciación con bisulfito para cuantificar el estado L1 metilación en muestras de cáncer gástrico resecados. Ellos encontraron que los pacientes fueron sometidos a L1 hipometilación experimentó la supervivencia global significativamente menor que aquellos con hipermetilación. Nos encontramos en este estudio que L1 estaba completamente metilado en la línea celular gástrica mucosa normal GES-1, pero fue metilado parcialmente en líneas celulares de cáncer gástrico. Estos resultados se correlacionan con el patrón de expresión GCRG213p en líneas celulares de cáncer gástrico, por lo tanto, proporcionar más pruebas con respecto a la naturaleza del péptido GCRG213. Sin embargo, no hemos podido identificar una correlación entre la expresión GCRG213p y la supervivencia en este estudio. neoplasia intraepitelial se cree que es un paso clave de la transformación maligna de adenocarcinoma gástrico, la sobreexpresión de GCRG213p en estas glándulas implicaba un papel potencial de GCRG213p en la oncogénesis gástrica. La puntuación alta inmunotinción de GCRG213p en el cáncer gástrico bien diferenciado indicó que podría estar implicado en la diferenciación de cáncer gástrico.
Mientras gastritis atrófica crónica se cree que es una entidad relacionada con la edad, la metaplasia intestinal se considera evidencia de la gastritis atrófica, ya glándulas especializadas habían sido reemplazados por criptas intestinales, por lo que la metaplasia intestinal se consideró relacionada con la edad. La edad juega un factor importante que determina el desarrollo de metaplasia intestinal gástrica, y los sujetos con metaplasia intestinal gástrica fueron significativamente mayores que los que no tienen metaplasia [37]. glándulas metaplasia intestinal muestran amplia inmunotinción GCRG213p en este estudio. Mientras tanto, se observó que la tasa positiva de GCRG213p en tejidos de cáncer gástrico en el grupo de edad fue mayor que en el grupo no envejecida. Estos podrían implicar que GCRG213p se asocia con el envejecimiento de la mucosa gástrica y entidades relacionadas con la edad. No hay ningún estudio sobre la asociación entre la expresión de L1 y la edad en la actualidad, pero la metilación promedio L1 no varió con el tiempo [38, 39]. Se cree que mellar de ADN genómico por el L1-EN puede inducir toxicidad celular, lo que resulta en la detención del ciclo celular, apoptosis o senescencia. La expresión de larga duración exógeno L1 y SpORF2 en fibroblastos humanos normales, las células cancerosas y las células madre adultas han dado lugar a daños en el ADN detectable y dio lugar a la senectud-como fenotipo [20]. Por lo tanto, se sospecha que la actividad acumulada de GCRG213p, una variante de L1-EN, puede representar una fuente potencial para la transformación relacionada con la edad celular, lo que en última instancia contribuye a la senescencia celular, o en sentido opuesto, a una fuera de control (maligno) Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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