Expression d'une variante LINE-1 endonucléase dans le cancer gastrique: son association avec clinicopathologique parameters

Expression d'une variante d'endonucléase LINE-1 dans le cancer gastrique: son association avec des paramètres clinicopathologiques
Long Résumé de l'arrière-plan intercalés element- nucléaire 1 (LINE-1 ou L1), la famille des rétrotransposons non-LTR dans le génome humain le plus abondant et seulement de manière autonome actif, exprimé non seulement dans les lignées germinales, mais aussi dans les tissus somatiques. Elle contribue à l'instabilité génétique, du vieillissement et des maladies liées à l'âge telles que le cancer. Notre étude précédente identifiée dans un adénocarcinome gastrique humain GCRG213 de transcription régulée à la hausse, ce qui partage 88% d'homologie avec la séquence humaine et L1 contient un domaine putatif endonucleas1 conservé apurinique /apyrimidiniques.
Méthodes
immunohistochimie a été effectuée en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti- -Droits anticorps protéine GCRG213 (GCRG213p) produit dans notre laboratoire, sur tissu microarray construit avec des échantillons de 175 patients atteints d'un adénocarcinome gastrique. La corrélation entre l'expression de GCRG213p et les paramètres clinicopathologiques patients a été évaluée. l'expression GCRG213p dans des lignées cellulaires de cancer gastrique ont été étudiés en utilisant une analyse par Western Blot. L1 état de méthylation du promoteur de cellules de cancer gastrique a été testée en utilisant la PCR spécifique de la méthylation. BLASTP a été utilisé à Blast serveur NCBI pour identifier la séquence de GCRG213p à des alignements dans les bases de données Protein Data Bank.
Résultats
La plupart des cancers gastriques primaire, métastases ganglionnaires et gastriques glandes métaplasie intestinale ont montré immunoréactivité GCRG213p positive. Haute GCRG213p immunocoloration score dans le cancer gastrique primaire a été positivement corrélée avec la différenciation de la tumeur (bien différenciée, p = 0,001), la classification de Lauren (type intestinal, p < 0,05) et une apparition tardive de l'âge de l'adénocarcinome gastrique (≥65 ans; p <0,05). expression GCRG213p n'a aucune association avec d'autres paramètres clinicopathologiques, y compris la survie. Analyse par transfert de Western de l'expression de GCRG213p dans les cellules cancéreuses gastriques ont indiqué que le niveau GCRG213p était plus élevé dans les lignées cellulaires de cancer gastrique que dans l'épithélium gastrique lignée cellulaire humaine normale immortalisée GES-1. méthylation partielle de L1 dans les cellules de cancer de l'estomac a été confirmée par PCR spécifique de la méthylation. l'analyse du programme BLASTP a révélé que le peptide GCRG213p partagé alignement 83,0% avec la région C-terminale de L1 endonucléase (L1-FR). Conclusions de GCRG213p séquence possède les résidus importants qui composent les caractéristiques conservées de L1-EN.
GCRG213p pourrait être une variante de L1-FR, un membre fonctionnel de L1-FR famille. La surexpression de GCRG213p est commun dans le cancer et les métastases ganglionnaires gastrique primaire. Ces résultats fournissent des preuves de l'expression de L1 somatique dans le cancer gastrique, et ses conséquences potentielles dans la forme de la tumeur.
Mots-clés
Gastric cancer à long intercalés Long nucléaire élément 1 endonucléase protéine GCRG213 Tissue microarray Contexte intercalés élément nucléaire -1 (LINE-1 ou L1) est la famille de rétrotransposons non-LTR dans le génome humain le plus abondant et seulement de manière autonome active et comprend environ 17% du génome humain [1]. La grande majorité des quelque 500 000 exemplaires au total de L1 dans le génome humain ne sont pas en mesure de transposition de leur propre en raison de divers mécanismes tels que des troncatures et des mutations inactivant. Cependant, on estime que 80-100 pleine longueur, rétrotransposition CN1 compétentes (RC-L1S) sont présents dans un génome diploïde humain typique, et un petit nombre, appelé "hot CN1" présentent des rendements élevés de rétrotransposition [2].
Humain RC-CN1 sont environ 6,5 kb et codent deux protéines (ORF1p et ORF2p) requis pour retrotransposition [3]. ORF1p est une protéine de 40 kDa avec un ARN de liaison [4] et les activités de chaperonne d'acide nucléique [5]. ORF2p est une protéine de 150 kDa avec endonucléase (L1-FR) [6] et la transcriptase inverse (L1-RT) [7] activités. L1 élément peut intégrer à plusieurs centaines de milliers emplacements génomiques, à un site consensus vaguement défini (5'-TTTT /AA-3 '), qui est entaillé par L1-FR [8]. L'hôte limite la propagation de ces éléments par des mécanismes de répression transcriptionnelle et post-transcriptionnelle qui réduisent l'activité à un niveau tolérable [9].
L1 exprimée non seulement dans les lignées germinales, mais aussi dans les tissus somatiques. Il est suggéré que même de faibles niveaux de dommages à l'ADN somatique due à l'activité L1 ont le potentiel de contribuer à l'instabilité génétique, le vieillissement et les maladies liées à l'âge, comme le cancer [10, 11]. L1-ORF1 et ORF2 sont régulés à la hausse dans une variété d'affections malignes telles que le cancer du sein, le cancer du pancréas et les tumeurs des cellules germinales malignes, etc. [12-14]. L1 hypométhylation a été observée dans une variété de tumeurs malignes telles que la tête et le cou, les cancers de l'œsophage et de l'estomac, et dans les lésions précancéreuses [15, 16]. Le degré de L1 hypométhylation a également été associée à un stade plus avancé et plus mauvais pronostic [17, 18].
Influence L1 induite par des cellules est peu probable limitée aux seuls éléments pleinement actifs. Même les éléments L1 avec les régions codantes défectueuses ORF1 pourraient faire un ARN qui épissures pour exprimer une ORF2 fonctionnelle avec un certain nombre de conséquences négatives pour la cellule [19]. De nombreux tissus produisent traduisible ORF2 épissage (SpORF2) transcription [20]. Une transcription L1 épissé qui comprend la séquence intégrantes de la transcriptase inverse de ORF2, a été jugée essentielle pour la prolifération des cellules d'hépatome humain [21].
Notre étude précédente [22] a identifié une transcription upregulated, nommé gène du cancer lié gastrique 213 (de GCRG213) dans adénocarcinome gastrique humain. L'analyse BLAST de la séquence GCRG213 indiqué 88% d'homologie avec LI humaine et a révélé un domaine putatif conservé, apurinique /apyrimidiniques endonucleas1 (APE), en GCRG213-ORF. Notre dernière recherche de la base de données GenBank mise à jour montre GCRG213-ORF contient une L1-FR conservé domaine. Cet article rapporte notre étude qui a confirmé l'expression de protéines de GCRG213 (GCRG213p) dans des lignées cellulaires de cancer gastrique en utilisant la souris anticorps monoclonal anti-GCRG213p produit dans notre laboratoire (Institut gériatrique, la Chine Hôpital général de l'APL, Beijing, Chine). En outre, immunohistochimie (IHC) appliquée sur le microréseau tissulaire (TMA) a été utilisé pour évaluer l'expression de GCRG213p dans le cancer gastrique et de la muqueuse gastrique normale. D'autres analyses ont été effectuées pour voir s'il existe une corrélation entre l'expression de GCRG213p et les paramètres clinicopathologiques et la survie.
Méthodes
Patients de patients ayant subi une gastrectomie pour le cancer gastrique PLA hôpital général, Beijing, Chine 1991-2003 ont été considérés comme des candidats pour cette étude. Les critères d'échantillonnage étaient les suivants: le sexe (hommes ou femmes), l'âge (20 ans ou plus); nouvellement diagnostiqué (l'incident) carcinome gastrique sans traitement préalable; diagnostic confirmé histologiquement; paraffine tumeur intégrée, associée entourant les tissus de la muqueuse gastrique non-tumoraux disponibles, avec des carcinomes métastatiques au ganglionnaire si possible; et les résultats de suivi positifs au moment de la construction TMA. Par conséquent, 175 cas ont été recrutés dans cette étude, comprenant 144 hommes et 31 femmes (27 ~ 84 années, moyenne = 58,58 ans). Parmi eux, soixante sept cas ont carcinomes accompagnés de métastases ganglionnaires, et six cas de formaline-fixe, les tissus gastriques normaux paraffine ont également été obtenus à partir de patients non-tumorales qui ont été opérés à cause des maladies gastriques bénignes.
Démographique , style de vie et des données clinico pour les cas d'échantillons ont été présentés dans le tableau 1. Toutes les tumeurs ont été classés et mis en scène selon les lignes directrices révisées préconisées par l'Union internationale contre le cancer. Le suivi a été effectué pour évaluer leurs dernières conditions en 2005 en consultant leurs documents de cas ou par le biais des appels téléphoniques aux patients (ou leurs membres de la famille ou des médecins de famille). Un intervalle minimal de 18 mois a été adopté, et le temps médian de suivi pour les patients qui étaient encore en vie à la fin de 2005 était de 46 mois (la gamme est de minimum 18 au maximum 129 mois). Le temps de survie a été calculée à partir de la date de la chirurgie à la date du décès ou la dernière date connue alive.Table 1 paramètres clinicopathologiques des patients atteints de cancer gastrique étudiés tissu microarray
N (%)
GCRG213p
GCRG213p valeur de P positif négatif
de
144 (82,28%) de sexes Homme
31
113
0,111
31 (17,72%)
Femme
11
20
Âge
< 65 années
104 (59,43%)
31
73
0,029
≥65 71 (40,57%)
année
11
60
fumer Oui
45 (27,27%)
7
38
0,278
Non
120 (72,73%)
30
90
Boire
Oui
28 (16,97%) 2
26
0,060
Non
137 (83.03%)
35
102 histoire
familiaux de tumeur
Oui
14 (8,43%) 2
12
0,639
Non
152 (91,57%)
36
116
localisation de la tumeur
48 (27,43%) de Cardiac 8
40
0,360
37 (21,14%) du corps
10
27
90 (51,43%)
Antrum
24
66
taille de la tumeur (cm)
≤1
11 (6,29%) 3
8
0,506
1-3
42 (24,00%)
13
29
> 3
122 (69,71%)
26
96
Profondeur de l'invasion
46 (26,28%) de T1
12
34
0,635
T2
21 (12,00%) 33 (18,86% de)
7
14
T3
6
27
75 (42,86%) de T4
17
58
atteinte des ganglions lymphatiques Oui
75 (42,86%)
16
59
0,592
Non
100 (57,14%)
26
74 catégorie de circuit de différenciation de la tumeur
Eh bien
10 (5,71%)
0
10
0,001
Modéré
40 (22,86%)
4
36
pauvres
103 (58,86%)
27
76
cellule
anneau Signet 22 (12,57%)
11
11
Le stade tumoral (TNM)
0
21 (12,00%) 3
18
0,217
Ia
14 (8,00%)
6
8
Ib
41 (23,43%)
10
31
II
60 (34,29%)
17
39 (22.28%
43
IIIa )
6
33
classification de Lauren
Type Intestinal
153 (87.43%)
31
122
0,015
diffuse Type
22 (12,57 %)
11
11 marge
de résection
6 (3,43% de présence)
0
6
0,361
Absence
169 (96,57% )
42
127
invasion microvasculaire
20 (11,43% de présence)
5
15
0,911
Absence
155 (88,57% de)
37
118
Etat
vivant
121 (71,18%)
30
91
0,483
morts
49 (28,82%)
9
40
survie à 5 ans
< 5 47 (43,93%)
an
12
48
0,871
> = 5 ans
60 (50,07%)
10
37
autorisation a été donnée par le comité d'éthique de l'Hôpital général de PLA, Beijing, Chine à utiliser le tissu et les données pour ce projet. Le consentement éclairé a également été obtenu à partir des patients. construction
Tissue microarray, GCRG213p coloration immunohistochimique et l'évaluation
Les microréseaux tissulaires (TMA) ont été construits comme décrit précédemment [23]. À partir des échantillons disponibles, les six blocs de matrices de tissus ont été préparées, chacune contenant 30 cas d'une tumeur, les tissus des ganglions normaux et lymphatiques si elles sont disponibles de récupération d'antigène du. De diapositives TMA, et des sections de tissus inclus dans la paraffine fixés au formol ont été effectuées par la pression un traitement de cuisson pendant 10 min dans une solution de récupération d'antigène (10 mmol /L de tampon de citrate de sodium, pH 6,0). anticorps monoclonal de souris anti GCRG213p humain, qui a été produit dans notre laboratoire [24], a été ajouté à une dilution de 1: 200 et on fait incuber pendant 2 heures à la température ambiante. Les lames ont ensuite été incubées pendant 1 h dans un anticorps secondaire. Un kit EnVision (Dako, Carpinteria, CA, USA) a été utilisé pour visualiser la liaison d'anticorps, et les diapositives ont ensuite été contre-colorées avec l'hématoxyline. Un PBS seule échantillon coloration a été utilisé comme un contrôle de fond.
Immunocoloration jaune-brun spécifique pour GCRG213p a été exclusivement localisée dans le cytoplasme. Il a été marqué de manière indépendante et en aveugle par deux enquêteurs (GJ et XL). Les désaccords inter-observateurs (environ 6% du total) ont été examinés pour une deuxième fois, suivi par un jugement concluant par les deux observateurs. notation officielle a ensuite été réalisée par un chercheur (WG). L'intensité de la coloration a été classé comme 0 (absent), 1 (faible), 2 (modérée), et 3 (forte). Le pourcentage de cellules colorées positivement a été marqué comme 0 (0% positifs), 1 (1-30%), 2 (31-60%), et 3 (> 60%). L'évaluation combinée de l'intensité et de l'extension de coloration a été utilisée pour évaluer l'expression de GCRG213p. Le score minimum une fois additionnées (intensité + extension) était de 0, et le maximum était de 6 [25]. GCRG213p Résultat global de ≥2 a été jugée positive.
Analyse Western blot
lignées cellulaires de cancer gastrique, y compris SGC-7901, BGC-823 et de la ligne humaine normale de l'épithélium gastrique immortalisés cellulaire GES-1 ont été cultivées, recueillies et lysées avec le tampon RIPA sur de la glace avant d'être soumis à une analyse par Western blot. La concentration en protéine a été détectée par la méthode de Bradford avec BSA (Sigma-Aldrich) comme étalon. Des quantités égales d'extraits cellulaires (40 ug) ont été soumises à 8% de SDS-PAGE et transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (Bio-Rad) pour l'anticorps Blot. La membrane a ensuite été bloquée, incubée avec un anticorps de souris anti-GCRG213p (1: 500) pendant 2 heures à la température ambiante, suivie d'une incubation avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort pendant 1 h à température ambiante. Le signal a été visualisé avec un réactif de détection de chimioluminescence amplifiée. L'anticorps de la β-actine anti-souris (1: 5000, Sigma). La détection a été détectée simultanément par une commande de chargement de l'état de méthylation de la ligne 1 avec MSP
validation de l'état de méthylation LINE-1 a été réalisée à l'aide spécifique de la méthylation PCR (MSP). L'ADN total de la CGT-7901, BGC-823, MGC803 et GES-1 des cellules a été extrait selon les instructions du kit d'extraction d'ADN. L'ADN a été modifié bisulfite comme décrit précédemment [26] pendant 16 heures à 50 ° C. ADN converti au bisulfite a été amplifié par PCR en utilisant la polymerase Taq (Invitrogen, USA). Amorces utilisées étaient [27]:
linea: méthylé LINE-1 amorce avant, TGTGTGTGAGTTGAAGTAGGGT;
LINEb: méthylé amorce inverse LINE-1, ACCCAATTTTCCAAATACAACCATCA;
LINEc: méthylé LINE-1 amorce avant, CGCGAGTCGAAGTAGGGC;
DOUBLÉ: méthylé LINE-1 amorce inverse, ACCCGATTTTCCAAATACGACCG
conditions d'amplification par PCR ont été:. 4 ° C, 5 min; 94 ° C, 30, 58 ° C, 45s, 72 ° C, 61s, 40 cycles; 72 ° C, 10 min. Les produits de PCR résultants ont été visualisés sur un gel d'agarose à 2%. Normes ADN méthylé de Zymo Research ont été utilisées comme témoin positif, l'eau distillée deux fois comme témoin négatif
similitude de séquence et conservée recherche de domaine
PSI-Blast a été utilisé sur le serveur NCBI Blast [28] (date de recherche:. 20 e Janvier 2012) pour identifier la séquence de GCRG213p à des alignements dans la Protein Data Bank bases de données, y compris tous les non-redondantes GenBank CDS traductions, PDB, SwissProt, PIR et PRF. Elle a été réalisée avec une recherche BLASTP initiale standard.
Analyse statistique
Chi-carré test ou de probabilité exacte de Fisher a été utilisé pour évaluer la relation entre l'expression de GCRG213p et les variables clinicopathologiques. La survie globale a été examiné par l'expression GCRG213p avec des courbes de Kaplan-Meier. Toutes les valeurs de p étaient deux côtés et considéré comme statistiquement significatif si p < 0,05. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant SPSS 13.0 pour Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).
Résultats de les profils d'expression GCRG213p dans la muqueuse gastrique normale et adénocarcinome gastrique
Distinct coloration GCRG213p a été observée dans les adénocarcinomes gastriques primaires, la lymphe les tumeurs de métastases des ganglions et la muqueuse gastrique non tumorale (figure 1). Dans la muqueuse gastrique non-tumorale de la jonction esopheageal-gastrique et la région antrale, le cytoplasme de l'épithélium de surface différenciée et les glandes muqueuses a montré une coloration négative, mais la coloration GCRG213p positive a été observée dans la membrane basale des glandes normales. 133 de 175 adénocarcinomes gastriques primaires, et 51 de 67 tumeurs métastatiques au ganglionnaire a montré immunoréactivité GCRG213p positif, qui a été localisé dans le cytoplasme des cellules de carcinome. Figure 1 expression de GCRG213p dans la muqueuse gastrique maligne et non maligne humaine. Les deux (A) adénocarcinome gastrique primaire (100 ×) et (B) adénocarcinome envahi dans les ganglions lymphatiques (100 ×) ont montré GCRG213p positif stainging dans le cytoplasme; (A ') et (B') ont démontré le plus fort grossissement (400 x) de la zone (A) et (B). (C) dans l'épithélium gastrique non maligne, une coloration positive a été observée dans la membrane basale, mais pas dans le cytoplasme; GCRG213p immunoréactivité a été détectée dans le cytoplasme des glandes gastriques intestinales (métaplasie de flèche) (100X); . (C ') ont démontré le plus fort grossissement (400 ×) à partir de la zone (C)
Selon la classification Lauren, le cancer gastrique est divisé en deux types histologiques:-type intestinal ou de type diffus. Nous avons 153 cas de type intestinal et 22 cas diffus tye dans cette étude. Parmi les cas 153 de type intestinal, 34 métaplasie intestinale et 28 échantillons de néoplasies intraépithéliales adjecent au cancer ont été identifiés. L'âge (année, moyenne ± écart type) du groupe de type intestinal avec métaplasie intestinale (59,67 ± 12,30) était plus âgé que le groupe de type diffus (51,05 ± 11,29) (p = 0,004). 31 de 34 métaplasie intestinale, et 27 des 28 basse /haute intraépithéliales de grade néoplasie montré GCRG213p immunoréactivité. La plupart des cas positifs ont montré une légère coloration à modérée (tableau 2) .Table expression 2 GCRG213 dans des échantillons de tissus gastriques Groupes
Nombre

expression GCRG213
Note globale ‡
PR§ (%)
0-1
2-3
4-5

6
épithéliums gastrique non-tumoraux
112
112
0
0
0
0.00
métaplasie intestinale
34
3
18
11 2
91.18 *
Low- /28 1
17
10
haute qualité néoplasie intraépithéliale 0
96.43 *
adénocarcinome sans LNM †
100
26
50
21 3
74.00 *
adénocarcinome avec LNM
75
métastatique 16
40
16 3
78.67 *
de tumeur des ganglions lymphatiques
67
16
42
8 1
métastases ganglionnaires 76.12 *
† LNM
de lymphe; ‡ Note globale calculée (score d'intensité) plus (pourcentage de cellules de score positif) comme décrit dans les méthodes; taux positif de §PR
* Par rapport aux non-tumorale muqueuse gastrique, p <. Association de 0,001. Entre l'expression de GCRG213 et High GCRG213p immunocoloration score de paramètres clinicopathologiques dans le cancer gastrique primaire a été positivement corrélée avec la différenciation de la tumeur (p = 0,001) (Figure 2). Pendant ce temps, l'expression GCRG213p a été corrélée avec la classification de Lauren (p < 0,05). Le pourcentage de coloration GCRG213p positive dans le groupe d'âge (> = 65 ans) était plus élevé que dans le groupe non-âge (< 65 ans) (60/71 = 84.51% vs 73/104 = 70.19%, p < 0,05). Cependant, l'expression de GCRG213p n'a pas été trouvée être associée à d'autres paramètres clinico que ceux énumérés dans le tableau 1 (p > 0,05). Dans les 67 patients avec des échantillons de tumeurs à la fois la tumeur primaire et des ganglions lymphatiques métastatiques, GCRG213p était positif dans 51 lymphatiques spécimens noeud de métastases et 52 échantillons de tumeurs primaires (76,12% contre 77,61%), respectivement, ce qui indique que l'expression de GCRG213p élevée dans ganglionnaire métastatique tumeur est concordant avec l'expression de GCRG213p dans le carcinome gastrique primaire. l'expression dans GCRG213p métastases ganglionnaires a également été associée avec des teneurs de différenciation de la tumeur (p = 0,015), mais pas avec d'autres paramètres clinico-pathologiques (p > 0,05). Figure 2 Corrélation de GCRG213p score immunocoloration dans le cancer gastrique primaire avec la différenciation de la tumeur. Note globale (OS) de immunocoloration est plus élevé dans le cancer bien différencié que dans les pauvres différenciés (p = 0,001).
Relation d'expression de GCRG213 avec la survie
Suivi des informations étaient disponibles sur 175 cancer de l'estomac patients pour des périodes allant de 18 mois à 14 ans. Les taux globaux de survie sont les suivants: 91,42% (1 an), 78.28 %% (2 ans), 56,57% (3 ans), 39,43% (4 ans) et 23,43% (5 ans). Le taux médian de survie est de 41 mois.
Basé sur l'expression de GCRG213p dans les tumeurs primaires, il n'y avait pas de différence significative de survie entre les patients dans la catégorie GCRG213p négative par rapport à la catégorie GCRG213 positive (X
2
= 2.072, p = 0,558). De même, aucune corrélation n'a été observée entre l'expression de GCRG213p dans les métastases et la survie des ganglions lymphatiques (X
2
= 3,272, p = 0,195).
GCRG213p expression dans des lignées cellulaires malignes et normales de la muqueuse gastrique
essais de Western blot ont été réalisées sur des cellules de cancer gastrique, y compris SGC-7901, BGC-823 et non maligne gastrique lignée cellulaire de la muqueuse GES-1, afin de valider davantage l'expression différentielle des GCRG213p. Les bandes de protéines d'environ 35 kDa ont été identifiés. Trois lignées cellulaires testées ont exprimé GCRG213p à différents niveaux. le niveau de GCRG213p a été trouvée plus élevée dans les lignées cellulaires de cancer que dans GES-1 (figure 3). Ce résultat correspond au résultat IHC rapporté dans cette étude, à savoir, GCRG213p a été trouvé surexprimé dans le cancer gastrique. Figure 3 Analyse par Western blot d'extraits de cellules entières provenant de cellules malignes et non malignes gastriques à l'aide de l'anticorps anti-GCRG213p. Les cellules expriment GCRG213p avec des bandes de protéines de 35 kDa. 1: GES-1,2: SGC-7901; 3: BGC-823. Le filtre a été sondé avec un anticorps anti-β-actine pour contrôler l'égalité de chargement (panneau inférieur).
Analyse par PCR spécifique de la méthylation de LINE-1 PCR
méthylation spécifique (MSP) Les analyses ont été effectuées sur des cellules de cancer gastrique et la lignée cellulaire de la muqueuse gastrique non maligne GES-1, afin de tester l'état de méthylation du promoteur de L1 dans ces lignées cellulaires. En dehors de l'estomac des lignées cellulaires du cancer CGT-7901 et la lignée cellulaire de cancer gastrique BGC-823, nous avons également étudié MGC-823, pour but de fournir plus d'informations sur L1 méthylation dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Les produits de PCR amplifiés avec des amorces spécifiques méthylés (MPSM) et des amorces spécifiques (non méthylés MSPU) était de 116 pb et 111 pb, respectivement. Dans les cellules Ges-1, le produit de PCR a été amplifié avec MPSM, mais pas avec MSPU, ce qui suggère que les promoteurs L1 GES-1 des cellules ont subi une méthylation complète; Dans les cellules SGC-7901, BGC-823 cellules et MGC-803 cellules, les bandes correspondantes peuvent être amplifiées avec les deux MSPM et MSPU, indicative de la méthylation partielle (Figure 4). Figure 4 spécifique de la méthylation PCR (MSP) analyse de LINE-1. Agarose électrophorèse sur gel des produits de MSP. M: produit amplifié avec l'amorce méthylé spécifique; U: produit amplifié avec l'amorce non méthylé spécifique. PC: contrôle positif, norme de l'ADN méthylé humaine; W: un double contrôle de l'eau distillée. Notez que les échantillons GES-1 montrent uniquement des produits de PCR méthylés, tandis que le MGC-803, des échantillons SGC-7901 et BGC-823 montrent les deux produits de PCR méthylés et non méthylés.
Identification bioinformatique de GCRG213p en tant que membre de L1-FR famille
BLASTP analyse du programme, comme mentionné ci-dessus, a révélé que le peptide GCRG213p partagé alignement 83,0% avec la région C-terminale de L1-FR. Conserves Domaine Recherche de séquence GCRG213p dans la base de données Conserves Domaine de NCBI frappe la grande exonucléase /endonucléase /phosphatase (EEP) superfamille, y compris domaine endonucléase de la non-LTR rétrotransposon LINE-1, exonucléase III (ExoIII) -comme apurinique /apyrimidiniques ( AP) endonucléases, etc.
Une analyse plus poussée en utilisant BLASTP indique qu'il existe dans la séquence d'GCRG213p certains résidus qui sont importants pour les caractéristiques conservées de L1 FR, tels que le site de liaison au phosphate putatif [site de liaison d'ions] (Y115 /N145 /H230), site de métal putative de liaison [site de liaison d'ions] (de D229) et le site catalytique putatif [site actif] (Y115 /D145 /N147 /D229 /H230) (Figure 5). Figure 5 Alignement des GCRG213p et L1-FR. police rouge représente fort consensus, la police bleue ou noire représente faible consensus. GCRG213p contenaient des résidus (fléchée) qui sont importants pour l'activité endonucléase de Rapport de L1-FR.
Il est clair que les événements L1 de rétrotransposition se sont produits dans les cellules somatiques et germinales. Malgré le fait que la longueur totale L1 ARNm sont certainement la principale source de L1 retrotransposition endogène épissage L1 ORF2 variantes présentant de l'intérêt biologique potentielle se trouvent exprimées dans différents tissus somatiques. Belancio etc. [20] détecté transcription SpORF2 dans divers tissus humains adultes et l'expression de l'ARNm SpORF2 présente une variation spécifique du tissu. Ainsi, la fonction L1 est peu susceptible d'être limitée uniquement aux éléments complètement actifs. Le SpORF2 peut également produire la protéine ORF2 fonctionnelle. La plupart des rétrotransposons non-LTR sont rétrotransposons APE-type non-LTR [29]. La structure cristalline des analyses de l'humain L1-FR indiquent qu'il est un prototype pour rétrotransposon AP-like codé endonucléases, lequel ADN nick avec une spécificité variable et sont responsables de millions d'insertions de rétrotransposon dans les génomes eucaryotes [30]. Les deux APE1 et L1-FR appartiennent à la grande superfamille des EEP qui partage le même échafaudage de protéines et les mêmes résidus catalytiques.
Considérant le fait que les alignements des actions GCRG213p haute séquence avec L1-FR, et possède des résidus conservés qui sont cruciaux pour la L1 -FR liaison, la liaison métallique et l'activité catalytique de phosphate, nous proposons que GCRG213 est une L1-ORF2 épissage. GCRG213p pourrait être un membre fonctionnel de L1-FR famille, une variante de L1-FR.
La surexpression de L1 dans les tumeurs a été largement présenté [12-14]. Le cellulaire endogène L1-RT apparaît comme une composante fonctionnelle constitutive dans les cellules tumorigènes caractérisées par une forte prolifération et un faible statut de différenciation [31, 32]. Cependant, il y a quelques enquêtes détaillées sur L1-FR de tumeur humaine. Ergun etc. utilisé un anticorps anti-L1-FR pour détecter la L1-ORF2 dans les tissus humains adultes, ils ont trouvé l'expression ORF2p forte dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins dans la prostate humaine normale, de la vessie et du tissu testiculaire, mais aucune expression de ORF2p n'a été observée chez les cellules cancéreuses étudiées [33]. Oricchio etc. [34] ont rapporté que stable L1 interférence ARN pourrait réduire la prolifération et favoriser la différenciation dans les cellules A-375 mélanome. Ils ont également observé une réduction de la protéine L1-ORF2. Mais les chercheurs ont pas identifié si les effets de la prolifération étaient de L1-FR et /ou L1-RT. À ce jour, il est constaté sur le rôle de L1-FR sur la prolifération et la différenciation cellulaire sans rapport. Dans cette étude, nous avons réaffirmé que l'expression de GCRG213p a été élevé dans le cancer gastrique au niveau des protéines, à la fois dans le modèle cellulaire et les coupes de tissus étudiés, ce qui est cohérent avec nos résultats de l'étude précédente au niveau de l'ARNm [22]. L1 subit une hypométhylation dans une variété de tissus tumoraux, y compris le cancer gastrique [35]. Shigaki etc. [36] utilisé la technologie de bisulfite-pyroséquençage pour quantifier l'état L1 de méthylation dans des échantillons de cancer gastrique réséqués. Ils ont constaté que les patients ont subi L1 hypométhylation a connu la survie globale significativement plus courte que ceux avec hypermethylation. On a trouvé dans cette étude que L1 a été complètement méthylé dans la lignée cellulaire de la muqueuse gastrique normale GES-1, mais a été partiellement méthylés dans les lignées cellulaires de cancer gastrique. Ces résultats sont en corrélation avec le motif d'expression GCRG213p dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, par conséquent, de fournir plus de preuves quant à la nature du peptide GCRG213. Cependant, nous ne pouvions pas identifier une corrélation entre l'expression de GCRG213p et la survie dans cette étude. néoplasie intraépithéliale est considéré comme une étape clé de la transformation maligne de l'adénocarcinome gastrique, la surexpression de GCRG213p dans ces glandes impliquait un rôle potentiel de GCRG213p dans l'oncogenèse gastrique. Le score élevé de immunocoloration de GCRG213p dans le cancer gastrique bien différencié a indiqué qu'il pourrait être impliqué dans la différenciation du cancer gastrique.
Bien que la gastrite atrophique chronique est considéré comme une entité liée à l'âge, la métaplasie intestinale a été considérée comme une preuve de la gastrite atrophique, depuis glandes spécialisées avaient été remplacés par des cryptes intestinales, de sorte métaplasie intestinale a été considérée comme liée à l'âge. L'âge joue un facteur important régissant le développement de la métaplasie intestinale gastrique, et les sujets ayant une métaplasie intestinale gastrique était significativement plus âgés que ceux sans métaplasie [37]. glandes métaplasie intestinale affichés vaste immunocoloration GCRG213p dans cette étude. Pendant ce temps, nous avons observé que le taux positif de GCRG213p dans les tissus du cancer de l'estomac dans le groupe d'âge était plus élevé que celui du groupe non vieilli. Ceux-ci pourraient impliquer que GCRG213p est associée à l'estomac vieillissement de la muqueuse et entités liées à l'âge. Il n'y a aucune étude sur l'association entre l'expression L1 et de l'âge à l'heure actuelle, mais la méthylation de L1 moyenne ne varie pas au fil du temps [38, 39]. On croit que entailler d'ADN génomique par L1-FR peut induire une toxicité cellulaire, ce qui se traduit par arrêt du cycle cellulaire, l'apoptose ou la sénescence. Expression exogène pleine longueur L1 et SpORF2 dans des fibroblastes humains normaux, les cellules cancéreuses et les cellules souches adultes ont conduit à des dommages de l'ADN détectable et abouti à la sénescence comme phénotype [20]. Ainsi, nous pensons que l'activité cumulée de GCRG213p, une variante de L1-EN, peut représenter une source potentielle pour la transformation liée à l'âge cellulaire, ce qui contribue finalement à la sénescence cellulaire, ou à l'opposé, à un out-of-contrôlée (maligne) Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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