Ett nytt cancerläkemedel viral behandling och avbildningsteknik för magcancer med hjälp av en genetiskt modifierad vacciniavirus som bär den mänskliga natriumjodid symporter

Ett nytt cancerläkemedel viral behandling och avbildningsteknik för magcancer med hjälp av en genetiskt modifierad vacciniavirus som bär den mänskliga natriumjodid symporter Bild Sammanfattning
Bakgrund
Gastric cancer har dålig överlevnad trots den senaste tidens framsteg i tidiga detektionsmetoder, endoskopisk resektion tekniker och kemoterapibehandlingar. Vaccinia viral terapi har haft lovande terapeutisk potential för olika typer av cancer och har en stor säkerhetsprofil. Vi undersökte den terapeutiska effekten av ett nytt genetiskt manipulerade vacciniavirus som bär den mänskliga natriumjodid symporter (h
NIS) genen, GLV-1 h153, om magcancer och dess potentiella användbarhet för avbildning med 99mTc perteknetat scintigrafi och 124I positronemissionstomografi (PET).
metoder
GLV-1 h153 testades mot fem humana magcancer-cellinjer med hjälp av cytotoxicitet och standardvirusplackanalyser. In vivo
, var subkutana flanktumörer genereras i nakna möss med humana gastric cancerceller, MKN-74. Tumörer därefter injicerades med antingen GLV-1 h153 eller PBS och följas för tumörtillväxt. 99mTc perteknetat scintigrafi och 124I microPET avbildning utfördes.
Resultat
GFP-uttryck, ett surrogat för viral infektivitet, bekräftade virusinfektion med 24 timmar. Vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 1, GLV-1 h153 uppnås > 90% cytotoxicitet i MNK-74, OCUM-2MD3, och AGS under 9 dagar, och > 70% cytotoxicitet i MNK- 45 och TMK-1. In vivo
, GLV-1 h153 var effektiv vid behandling av xenotransplantat (p < 0,001) efter 2 veckors behandling. GLV-1 h153-infekterade tumörer lätt avbildas av 99mTc perteknetat scintigrafi och 124I microPET avbildning 2 dagar efter behandlingen.
Slutsatser
GLV-1 h153 är en effektiv onkolytiska virus som uttrycker h
NIS protein som effektivt kan tillbaka gastric tumörer och tillåta djupvävnads avbildning. Dessa data uppmuntrar dess fortsatta undersökning i kliniska situationer.
Nyckelord
onkolytiska viral behandling GLV-1 h153 Gastric cancer Human natriumjodid symporter (h
NIS) Bakgrund
Magcancer är en av de vanligaste elakartade tumörer, särskilt i Asien [1]. Även metoder för tidig upptäckt, utveckling av endoskopisk eller kirurgisk resektion och effektivare kemoterapi har förbättrat den totala överlevnaden hos patienter med magcancer, är prognosen för patienter med avancerad magsäckscancer fortfarande dålig [2-4]. De flesta konventionella kemoterapi behandlingar har visat måttlig effektivitet. En möjlig förklaring till motståndet för magcancer till konventionell terapi kan vara dess icke-känslighet för apoptos [5]. Emellertid onkolytiska virus har stora terapeutiska effekter mot cancerceller som uttrycker höga nivåer av ribonukleotidreduktas, DNA-reparationsenzymer, och är således resistenta mot apoptos [6, 7]. Många av dessa egenskaper som gör gastric cancerceller resistenta mot kemoterapi, gör dem mottagliga för cancerläkemedel viral terapi. Således, genterapi med hjälp av onkolytiska virus erbjuder ett attraktivt alternativ för behandling av cancer i magsäcken [8].
Onkolytiska viral behandling har studerats under det senaste århundradet och visat sig vara framgångsrika i preklinisk och klinisk testning som en behandling ny cancer modalitet [9 ]. Vacciniavirus (VACV) stammar är särskilt attraktiva såsom potentiella antitumörmedel, eftersom de kan innehålla stora mängder av främmande DNA, utan att reducera deras replikering effektivitet. Dessutom har VACV visat en stor säkerhetsprofil hos människa [10-12]. Slutligen, utöver dess terapeutiska potential, VACV har också använts som en icke-invasiv avbildningsteknik som gör att läkare för att spåra terapeutisk genleverans i kroppen [10, 13].
I denna publikation har vi granskat den terapeutiska potentialen av en ny VACV uttrycker den humana natriumjodid symporter (h
NIS), GLV-1 h153, mot magcancer in vitro Mössor och in vivo
och testade dess potential som ett bildhanteringsverktyg.
Material och metoder
Cellinjer
Human gastrisk cancer AGS-celler (en gastrisk adenokarcinom epitelial cellinje) erhölls från American Type Culture CoUection (ATCC; Manassas, VA) och odlades i Hams F-12 K Medium. Humant OCUM-2MD3 celler var en gåva från Dr. Masakazu Yashiro (Osaka City University Medical School, Japan) och odlades i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM). MKN-74 och TMK-1-celler tillhandahölls av Dr. T. Suzuki (Fukushima Medical College, Japan) och odlades i Roswell Park Memorial Institute (RPMI). MKN-45 erhölls som en gåva från Dr. Yutaka Yonemura (Kanazawa University, Japan) och upprätthölls i RPMI. Afrikansk grön apnjure fibroblast (Cercopithecus aethiops
, CV-1) celler som används för virala plackanalyser köptes från ATCC (Manassas, VA) och odlades i Minimum Essential Medium (MEM). All media kompletterades med 10% FBS, 1% penicillin och 1% streptomycin.
Virus
GLV-1 h153 är en replikationskompetent, rekombinant vacciniavirus som härrör från dess moderstammen, GLV-1 H68, via homolog rekombination. Den innehåller fyra insatta kassetter som kodar för Renilla Aequorea
luciferase- grönt fluorescerande protein (RUC-GFP) fusionsprotein, en omvänt införd humant transferrin receptor (rTfr
), β-galaktosidas och humant natriumjodid symporter (h
NIS) i F14.5
, J2R
(som kodar för tymidinkinas), och A56R
(kodning hemagglutinin) loci av det virala genome.GLV-1 h153 tillhandahölls av Genelux Corporation (R &D anläggning i San Diego, CA, USA).
cytotoxicitetsanalys
4 × 10 4 celler per brunn av varje cellinje ströks ut i 12-brunnars plattor och inkuberades i en 5% CO 2 fuktad inkubator vid 37 ° C över natten. GLV-1 h153 sattes till varje brunn vid varierande infektionsmultiplicitet (MOI) av 0,01, 0,1, och 1,0. Viral cytotoxicitet testades med användning av en laktatdehydrogenas (LDH) -analys dagligen. Celler tvättades med PBS en gång, och sedan lyserades med 1,35% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO). Den intracellulära LDH-frisättning efter lys därefter mäts med CytoTox 96® (Promega, Madison, WI) på en spektrofotometer (EL321e, bio- Tek Instruments) vid 490 nm. Resultaten uttrycks som procentandelen överlevande celler, som beräknades som LDH-frisättning av infekterade prover jämfört med oinfekterad kontroll. Alla villkor testades i tre exemplar.
Virusreplikation assay
Supernatanter från varje infekterad väl samlades in dagligen och omedelbart fryses vid -80 ° C. Seriespädningar av samtliga överstående prover gjordes för att utföra standard virala plackanalyser på konfluenta CV-1-celler. Alla prover mättes i triplikat.
In vivo
mus flanktumörterapi
Alla djurförsök utfördes under godkända protokoll och i enlighet med etiska riktlinjer Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Memorial Sloan -Kettering Cancer Center (MSKCC). MKN-74-xenotransplantat etablerades i 6- till 8 veckor gamla kvinnliga nakna möss (NCI: Hsd: atymiska nakna-nu, Harlan) av subkutant injicera 5 × 10 6 MKN-74 celler i den högra flanken. Tumörtillväxten registrerades två gånger i veckan med hjälp av en digital kaliber och tumörvolymen beräknades med användning av ekvationen, en
× b
2 × 0,5, där en Hotell och B
är den största och minsta diameter, respektive. När tumörerna nådde en diameter av ungefär 6-8 mm i 10 dagar, fick djuren grupperade i kontroll- och behandlingsgrupper med skäliga tumörstorlekar. En enda dos av 2 x 10 6 plackbildande enheter (PFU) av GLV-1 h153 i 100 mikroliter PBS eller 100 mikroliter av PBS som kontroll injicerades intratumoralt till varje utsedd tumör. Djuren observerades dagligen för tecken på toxicitet, och avlivades när deras tumörer nådde en diameter på ungefär 15 mm.
Fluorescerande avbildning (Maestro) katalog In vivo
GFP bilder erhölls med hjälp CRI Maestro-systemet (Cambridge forskning och instrumentering, Woburn, MA) med användning av lämpliga filter (excitation = 445 till 490 nm, emission = 515 nm långpassfilter, förvärvs inställningar = 500-720 i 10 nm). Efter varje bild erhölls, var det spektralt oblandade att avlägsna bakgrundsfluorescens. Bilder kvantifierades med hjälp av regionen av intresse (ROI) analysprogram som medföljer Maestro-systemet.
In vivo
single-photon emission computed tomography SPECT imaging
Fem MKN-74 xenografter var intratumoralt injicerades med 2 x 10 7 pFU GLV-1 h153 och 5 med PBS som kontroller. Två dagar efter infektion, var 200

• Kliniskt patologiska egenskaper och behandlingsstrategier i magcancer tidig: en retrospektiv kohort study
• En selektiv arylkolvätereceptor modulator 3,3-Diindolylmethane hämmar magcancer celltillväxt