Nedreglering av Thrombospondin2 förutspår dålig prognos hos patienter med magcancer

Nedreglering av Thrombospondin2 förutspår dålig prognos hos patienter med magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Thrombospondins (THBSs) är en familj av multidomän och utsöndras matricellular Ca 2 + -bindande glykoproteiner som har minst fem medlemmar kodas av oberoende gener. Som THBSs familjemedlem har Thrombospondin2 (THBS2) rapporterats reglera angiogenes. Icke desto mindre är de funktioner och kliniska betydelsen av THBS2 fortfarande oklart i magcancer.
Metoder sälja The mRNA och proteinuttrycksnivåer av THBS2 bedömdes i 14 parat av magcancer prover och motsvarande normala slemhinnorna använder kvantitativ realtids-PCR och western blot-analys. Immunohistokemi av THBS2 och CD34 på populationsbaserade vävnads mikroarrayer bestående av 129 gastric cancerfall användes för att utvärdera prognostisk betydelse för THBS2 och mikrokärlsdensitet (MVD) för varje prov. Överlevnadsanalyser utfördes av Kaplan-Meier-metoden och Cox proportionella faror modell. Kolonibildningsanalys, endotelceller rör bildningsanalys, cellmigrationsassay och apoptos analys MKN-45 och SGC-7901 cellinjer genomfördes för att utvärdera effekterna av THBS2 på magcancer in vitro
.
Resultat
85,71% (12 av 14) magcancer vävnader uttrycks avsevärt lägre THBS2 i både mRNA och proteinnivåer än motsvarande normala kontroller. Genomgående visade vävnad microarray (TMA) resultat THBS2 nivåer också hämmas i magcancer vävnader jämfört med normala kontroller. Dessutom observerade vi att patienter med högre nivåer av THBS2 signifikant korrelerade med gynnsammare prognos medan minskade THBS2 uttryck var associerade med sämre histologiska kvaliteter av magcancer. Dessutom, våra in vitro-experiment visade vidare att överuttryck av THBS2 kunde hindra både spridningen takt och röret bildandet av mänskliga umbilikalvensendotelceller (HUVEC) i MKN-45 och SGC-7901 cellinjer.
Slutsats
Vårt studie föreslår THBS2 är abnormt uttryckt i magcancer och spelar en avgörande roll i cancerutveckling, som kan vara en potentiell prognos prediktor för magcancer.
Nyckelord
THBS2 magcancer Angiogenes Prognostic biomarkör Inledning
gastric cancer är en mycket aggressiv och dödlig malignitet. Totalt 952,000 nya magen cancerfall och 723,000 dödsfall beräknas ha skett under 2012, vilket motsvarar 6,8% av det totala antalet fall och 8,8% av det totala antalet dödsfall. Dessutom Både nya fall och dödsfall av magcancer i Kina, rankad 1: a världen och står för mer än 40% av det i världen [1]. Därför stor oro höjs för undersökningar av magcancer.
Thrombospondins (THBSs) är en familj av multidomän och matricellular Ca 2 + -bindande glykoproteiner som utsöndras av stromala fibroblaster, endotelceller och immunceller [2]. De har åtminstone fem medlemmar som kodas av oberoende gener. Genom bindning med många målproteiner, de deltar i diverse biologiska processer såsom angiogenes, cellrörlighet, apoptos, cytoskelett organisation, och fungera som plattformar för interaktion i den extracellulära matrisen (ECM) [3, 4]. Noterbart THBS1 och THBS2 är speciella i denna familj för deras typ I upprepningarna och båda är huvudsakligen visade som inhibitorer av angiogenes [5, 6], en viktig del av cancerforskningen [7-9]. Mikrokärlsdensitet (MVD) är en allmänt använd parameter för att uppskatta graden av angiogenes i tumörer med CD34 är den mikrokärls maker i magcancer [10]. Baserat på tidigare fynd [2], vi lägger fram en hypotes i vår studie att det också kan påverka angiogenes i magcancer.
Förutom angiogenes har THBS2 rapporterats interagera med flera cellreceptorer, tillväxtfaktorer och ECM-proteiner såväl som att reglera apoptos, celltillväxt och vidhäftning [11]. I undersökningar cancer, har ökande uppmärksamhet fokuserats på THBS2. Tokunaga et al. [12] fann att THBS2 uttryckt i patienter med koloncancer uppvisade en signifikant lägre risk för levermetastaser och tumörkärl jämfört med patienter vars tumörer var THBS2 brist. Vidare De Fraipont et al. [13] visade att THBS2 signifikant korrelerade med kliniska status och resultat, och för de flesta tumörer, fanns det en omvänd korrelation mellan THBS2 expressionsnivån och graden av deras malignitet. Dessutom THBS2 spelade också en viktig roll i bröstcancer [14], myelom [15], malignt melanom [16], prostatacancer [17] och lung adenokarcinom [18, 19]. I magcancer, kan andra medlemmar i THBSs, THBS1 [20] och THBS4 [21] vara en prognostisk biomarkör eller en kraftfull markering för diffus typ gastric adenokarcinom. Men den detaljerade funktionen hos THBS2 i magcancer och dess konsekvenser för klinisk diagnos fortfarande dyster. Därför försökte vi att avslöja den kliniska betydelsen av THBS2 och dess effekt på magsäckscancer.
Att verifiera vår ovannämnda hypotes undersökte vi de THBS2 expressionsnivåer i humana gastriska cancervävnader och motsvarande normal vävnad och sedan undersökt eventuella samband mellan uttryck av THBS2 och kliniskt patologiska egenskaper, kliniska prognoser och MVD räkning hos patienter med magcancer. Dessutom har kolonibildningsanalys, endotelceller rör bildningsanalys, cellmigrationsassay och apoptos utförts i MKN-45 och SGC-7901 cellinjer att utforska vitro
effekten av THBS2 i gastric cancerceller i.
resultat
Patient egenskaper och kliniska utfall
i den aktuella studien, inskrivna vi 129 valbara patienter, som bestod av 101 män och 28 kvinnor. Åldern på patienterna varierade från 29 till 80 år (y) med en medianålder på 61Y. Alla kliniskt patologiska egenskaper sammanfattas i Tabell 1. Medianöverlevnaden (OS) av patienterna var 57 månader, och menar OS var 44,01 [95% konfidensintervall (CI) 39.78-49.24 månader] .table ett Association bland kliniskt patologiska variabler och THBS2 uttryck och total överlevnad av magcancer patienter
Variabler
Negativ
Positiv
Totalt antal
P värdeA
total överlevnad OS
log-rank Pb
HR (95% CI)
nr. (%) Review nr. (%) Review Age (y ) katalog 0,112
0,743 Hotel < 61
24 (38,1) Review 39 (61,9) katalog 63
en (referens) katalog ≥61
35 ( 53,0) Review 31 (47,0) katalog 66
1,09 (0,67-1,77) Review Kön
0,831
0,405
Man
47 (46,5) Review 54 ( 53,5) katalog 101
en (referens) Review Kvinna
12 (42,9) Review 16 (57,1) katalog 28
0,76 (0,40-1,45) Review Histologisk klass
0,005
0,011
väl och måttlig
24 (33,8) Review 47 (66,2) katalog 71
en (referens) Review Poor och andra
35 (60,3 ) Review 23 (39,7) katalog 58
1,89 (1,16-3,09) Review tumörlokalisation
0,419 0,204
Övre
27 (40,3) Review 40 ( 59,7) katalog 67
en (referens) Review USA
15 (53,6) Review 13 (46,4) katalog 28
1,66 (0,86-3,18) Review Lower
17 (50,0) Review 17 (50,0) katalog 34
1,90 (0,90-4,01) Review djup invasion
0,271
0,001
T1-T2
9 ( 34,6) Review 17 (65,4) katalog 26
en (referens) Review T3-T4
50 (48,5) Review 53 (51,5) katalog 103
11,60 (2,83 -47,45) Review Lymfkörtel metastaser
0,454 Hotel < 0,001
Frånvarande
17 (40,5) Review 25 (59,5) katalog 42
en (referens)
Nuvarande
42 (48,3) Review 45 (51,7) katalog 87
5,16 (2,46 till 10,84) Review TNM stadium
0,283 Hotel < 0,001
I-II
21 (39,6) Review 32 (60,4) katalog 53
en (referens) Review III-IV
38 (50,0) Review 38 (50,0) Review 76
7,14 (3,52 till 14,49) Review Fet värde är statistiskt signifikant vid P Hotel < 0.05, HR hazard ratio.
En P
värde av kliniskt patologiska variabler och THBS2 uttryck.
B, P
värde för association mellan kliniskt patologiska variabler och total överlevnad av patienter med ventrikelcancer.
THBS2 nedregleras i magcancer
för att bestämma uttrycksnivåer av THBS2 i magcancer, först utvärderade vi mRNA expressionsnivåer av THBS2
i magcancer genom kvantitativ realtids i den andra gruppen. Denna kohort av prover som nämns i Methods, ingår 14 human magcancer och motsvarande normala vävnader. Såsom visas i figur 1 A, THBS2
nivåer var markant lägre i 85,7% (12 av 14) av de gastriska cancervävnader än sina normala kontroller, medan de återstående två paren av proverna uppvisade det motsatta. Sedan upptäckte vi proteinexpressionsnivåer av THBS2 via western blöt i samma kohort. Såsom visas i Figure1B och C, observerade vi att THBS2 proteinexpressionsnivåer minskade i 85,7% (12 av 14) av de tumörprover jämfört med motsvarande kontroll, medan prov 5 och 11 visas omvänt. För att bekräfta detta fynd, vidare utförs vi en vävnad microarray (TMA) och bedömde de proteinexpressionsnivåer av THBS2 enligt immunoreaktiviteten score (IRS) i varje prov. Vi hittade THBS2 proteiner uttrycks huvudsakligen i cytoplasmor av gastric celler (Figur 2A), och i enlighet med resultaten av western blöt, nivåerna av THBS2 var signifikant mindre i magcancer vävnader jämfört med normala kontroller (Figur 2B, P < 0,05). Sammantaget visar våra resultat att THBS2 nedregleras i magcancer i både mRNA och proteinnivåer. Figur 1 mRNA och proteinexpressionsnivån av THBS2 i 14 gastriska cancervävnader och motsvarande normal vävnad. (A) Relativ mRNA-uttryck av THBS2 detekterades genom kvantitativ realtids-PCR. Expression av normala vävnader normaliserades till 1,0 såsom indikeras. (B) Den densitometri analysresultat av de THBS2 banden normaliserades till GAPDH med Image J. Expression av normala vävnader normaliserades till 1,0 såsom indikeras. (C) Relativ proteinuttryck av THBS2 uppskattades genom Western blot-analys.
Figur 2 Immunhistokemisk analys av THBS2, CD34. (A) Representativa bilder av THBS2 och CD34 uttryck: N1, N2, N3, N4, normal gastrisk vävnad (N); M1, M2, M3, M4, måttligt differentierad (M); P1, P2, P3, P4, dåligt differentierad (P). Förstoring: 100 x (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 x (N4, M4, P4) och 400 x (N2, M2, P2). (B) Jämförelse av THBS2 uttryck av magcancer (n = 129) och normala mag vävnader (n = 24) i TMA. Den THBS2 expressionsnivå presenteras som medelvärde ± SEM. (C) Jämförelse av MVD i THBS2-positiva magcancer-gruppen (n = 70) och THBS2 negativa magcancer gruppen (n = 59). Prickar MVD av varje prov. Värdena är medel ± SEM.
THBS2 uttrycksnivåer är omvänt korrelerade med histologiska kvaliteter av magcancer
att ytterligare klargöra den kliniska betydelsen av THBS2, analyserade vi förhållandet mellan THBS2 proteinuttryck och kliniska funktioner, inklusive ålder, kön, histologiska grad, tumörplacering, djup invasion, lymfkörtel metastas och TNM stadium av gastric patienter i THBS2-positiva och negativa grupper cancer. Som framgår av tabell 1, fann vi en signifikant omvänd korrelation med de histologiska kvaliteter av magcancer (P Hotel < 0,01). De histologiska kvaliteter av patienter i THBS2-positiva gruppen var mer benägna att vara väl och måttlig, medan patienter i THBS2-negativa gruppen tenderade att vara dålig och andra. Men kunde vi inte upptäcka någon betydelse statist mellan uttrycksnivåerna THBS2 och andra kliniska parametrar. Kollektivt tyder våra resultat att THBS2 inverterad korrelerad med histologisk grad av magcancer.
THBS2 uttrycksnivåer är omvänt korrelerade med MVD i magcancer
Tidigare rapporter underförstådda THBS2 kunde reglera tumör angiogenes [6], men ingen rapporterades i magcancer. Därför frågade vi om det fanns några samband mellan MVD och THBS2 expressionsnivåer samt andra kliniska parametrar i våra kliniska prover. MVD 129 magcancer prover varierade från 0 till 120, med medianen av 40 och medelvärde av 48,12 ± 28,99 (medelvärde ± SD) i enlighet med immunoreaktiviteten av CD34 i vår TMA. Såsom visas i fig 2C, var THBS2 signifikant korrelerad till MVD. MVD i THBS2-negativa gruppen var mycket högre än den i THBS2-positiva gruppen (P
< 0,001). Men vi kunde inte konstatera några statistiska skillnader mellan MVD och andra clinicopathologic funktioner, inklusive klinisk prognos i våra prover (data ej visade). Sammanfattningsvis våra upptäckter visar att THBS2 inverterad korrelerad med MVD i magcancer.
THBS2 signifikant associerad med klinisk prognos gastric cancerpatienter
att undersöka sambandet mellan THBS2 uttryck och den kliniska prognosen för gastric cancerpatienter, vi genomförde överlevnad analyser av univariat och multivariat Cox proportionella faror regressionsmodell. Som framgår av tabell 1, fann vi histologiska grad, djup invasion, lymfkörtel metastas och TNM stadium var statistiskt signifikanta faktorer för OS i univariat analys. Eftersom TNM stadium innehåller också information om djup invasion och lymfkörtel metastas, vi vidare utfört multivariata överlevnad analyser med justering för den histologiska grad och TNM stadium. Vi märkte att TNM stadium (P Hotel < 0,001) och THBS2 uttryck (P Hotel < 0,01) var båda oberoende prognostiska faktorer för bedömning av behandlingsresultat. Högre TNM stadium var en riskfaktor för längre OS [P Hotel < 0,001, HR (hazard ratio) = 7,23, 95% CI 3,55-14,69) och förhöjt uttryck av THBS2 var ännu en positiv faktor för längre OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% CI 0,31 till 0,85). Dessutom Kaplan-Meier överlevnadsanalys bekräftade vidare att THBS2 uttryck var signifikant korrelerad med kliniska utfall (Figur 3, P < 0,01, n = 129). Patienter med lägre THBS2 uttryck visade en betydligt kortare OS [median 36 månader, menar 40,07 ± 3,65 (medelvärde ± SE) månader], medan patienter med högre THBS2 uttryck visade en gynnsam prognos [median 59 månader, menar 53,70 ± 2,95 (medelvärde ± SE ) månader]. Tillsammans våra resultat visar THBS2 signifikant samband med den kliniska prognosen för gastric cancerpatienter, vilket kan bli en prognostisk markör för magcancer. Figur 3 Kaplan-Meier överlevnadsanalyser med log-rank test för total överlevnad (OS). Kaplan-Meier-analys av sambanden mellan olika THBS2 expressionsnivåer och OS i 129 gastric cancerpatienter Uttryck av THBS2.
Hämmar tillväxten av gastric cancerceller in vitro
Eftersom THBS2 var betydligt nedregleras i magsäcken cancer, sluta vi att THBS2 kan hämma tillväxten, främja apoptos och förbättra migrations förmåga gastric cancerceller. För att verifiera vår hypotes, byggdes vi en Lentiviral vektor stabila express THBS2 transkript i gastric cancercellinjer. Förändrat uttryck av THBS2 i 293 T-celler bekräftades genom western blot-analys (Figur 4A). Då, valde vi MKN-45 och SGC-7901 cellinjer för våra in vitro-
studie eftersom de mRNA-expressionsnivåer av THBS2 var lägre än andra (data ej visade). Vi utförde sedan kolonibildningsanalys för att utvärdera effekterna av THBS2 på tillväxten av MKN-45 och SGC-7901-celler. Såsom visas i figur 4B, fann vi celler med THBS2 överuttryck som bildas signifikant färre kolonier på mjuk agar jämfört med de hos kontrollvektorinfekterade celler (P
< 0,01 för MKN-45-celler och P
< 0,001 för SGC-7901 celler, respektive). Dessutom undersökte vi apoptos nivåer mellan de två grupperna i båda cellinjerna och upptäckte att THBS2 främjade apoptos i SGC-7901 celler (Figur 4F) men inte i MKN-45-celler (Ytterligare fil 1: Figur S1A). Och det fanns inga signifikanta skillnader mellan de två grupperna i SGC-7901 och MKN-45 cellinjer i cellmigration enligt Transwell analyser (Ytterligare fil 1: Figur S1B och C). Sammanfattningsvis våra data stöder att THBS2 hindrar tillväxten av gastriska cancerceller in vitro eventuellt via regleringen av apoptos. Figur 4 Uttryck av THBS2 hämmade spridningen av gastric cancerceller, undertryckte angiogenes av magcancer, och främjade apoptos i SGC-7901 cellinje in vitro. (A) Western blot-analys av flagga i 293 T celler med THBS2 uttryck. (B) Colony nummeranalys för MKN-45 och SGC-7901 celler med THBS2 uttryck och negativ kontroll. Värden är medelvärden ± SD från tre oberoende experiment. (C) Bilder av kolonibildningsanalys. (D) AngiogenicIndexCh1 analys av endotelial cellröret bildningsanalys. Värden är medelvärden ± SD. (E) Bilder av endotelceller rör bildningsanalys. (F) Analys av apoptos i MKN-45 cellinje. Värden är medelvärde ± SD.
THBS2 trycker magcancer angiogenes in vitro
THBS2 är känt som en inhibitor av angiogenes [2]. Att tillhandahålla bevis av THBS2 reglerar den angiogena fenotypen av magcancer, var endoteliala cell rörbildning analyser utföras. Såsom visas i fig 4E och D, i både MKN-45 och SGC-7901 cellinjer, humana navelvenendotelceller (HUVEC) odlade med mediet från THBS2-överuttryck gastriska cancerceller uppvisade signifikant lägre AngiogenicIndexCh1 än den negativa kontrollen (P
< 0,05 för MKN-45-celler och P Hotel < 0,001 för SGC-7901 celler, respektive). Kollektivt, våra resultat antyder att THBS2 trycker angiogenes av gastriska cancerceller in vitro
.
Diskussion
THBS2 är känd som en naturlig potent inhibitor av angiogenes och en modulator av den remodelleringsprocessen [22, 23]. Men ingen av de tidigare undersökningar diskuterade roller THBS2 och dess kliniska betydelse i magcancer.
Första fann vi att mRNA och proteinuttrycksnivåer av THBS2 var nedregleras i de flesta prover. Men en tidigare forskning rapporterade THBS2 mRNA expressionsnivåer i magcancer var högre än normalt kontroll [24]. Med tanke på den begränsade provstorleken i denna studie, som införlivade endast 6 vävnadsprover, är det möjligt att denna skillnad beror på tumör heterogenitet för två par av våra andra gruppen hade också visar samma mönster. Men vår efterföljande resultat av TMA, större provstorlek, överensstämde med resultatet från den andra gruppen. Sammantaget ansåg vi att THBS2 var mer sannolikt att nedregleras i magcancer cell kontra normal slemhinna.
Dessutom märkte vi också att den relativa uttrycket av proverna uppvisade annorlunda i mRNA och proteinnivå. Saknar tillräckliga bevis, vi dra slutsatsen att funktionen hos THBS2 inom gastric cancerceller kan regleras av vissa intracellulära uppströms signaleringsfaktorer, protein ubiquitinering och andra möjliga sätt, som kan påverka proteinnivåer THBS2 och fenotyper i gastric cancerceller. Och ytterligare tonvikt kan läggas på detta intressanta fenomen. Ändå majoriteten av proven från våra andra kohort uppvisade samma uttrycksmönster mellan mRNA och proteinnivåer.
Det andra våra data visade att THBS2 skulle kunna främja apoptos endast i SGC-7901-celler men inte i MKN-45-celler. Tidigare undersökningar visade att en N-terminal rekombinant fragment av THBS2 skulle kunna aktivera CD36-medierad endotelcell apoptos [14], och kombinationen av CD36 och THBS2 kunde aktivera kaspas signalväg [25]. Därför antog vi att heterogeniteten av de två cellinjer som används i vår studie, som differentierade CD36 uttryck, kanske delvis vara orsaken till olika nivåer av apoptos inducerad av THBS2, som kallas för fortsatta undersökningar.
Tredje visade våra resultat att THBS2 kunde undertrycka angiogenes av magcancer. Det är känt att tumörproliferation, invasion eller metastas är beroende av angiogenes [26]. Och baserade bevis stöder vår upptäckt och påpeka att de möjliga mekanismer som THBS2 hämmar angiogenes: 1) en apoptosoberoende sätt genom att inducera endotelceller apoptos, cellcykeln arrestera och minskande av endotelceller migration [27], 2) beroende av kaspas-signalering vägen aktiveras av CD36 [28]. 3) fungera som co-receptorer för lågdensitetslipoprotein receptorrelaterad protein (LRP1), vilket skulle kunna rensa komplexen enligt THBS2 med matrismetalloproteinaser-2, -9 eller vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) från pericellulär miljön i mesenkymala celler [ ,,,0],29-32].
Slutligen MVD är ett av de mest använda parametrar för att bedöma graden av tumörangiogenes och tidigare studier har visat MVD skulle kunna vara en oberoende prognostisk faktor i magcancer och andra tumör [33-35]. I vår studie fann vi MVD var signifikant korrelerad med THBS2 proteinuttryck (P Hotel < 0,001) i magcancer, men inte med kliniska och kliniska prognoser. Dessa resultat visade att THBS2 kan påverka angiogenes i magcancer, ändå, på grund av ingen korrelation mellan MVD och prognos i våra prover, misstänkte vi att högre THBS2 uttryck indikerar längre överlevnad var inte enbart genom att hämma angiogenes av magcancer, andra mekanismer såsom att reglera ECM omformning [23] och proliferationshastighet av gastric cancerceller kan också vara orsaker som behöver ytterligare undersökningar för att utforska. Review Tillsammans betonade våra resultat på de viktiga roller THBS2 i prognos betydelser samt tumörproliferation och angiogenes i magsäcken cancer. Dessa data tyder på THBS2 kan vara en viktig prognostisk markör för gastric cancerpatienter. Dessutom, baserat på effekterna av THBS2 på tumörutveckling och angiogenes, våra undersökningar ge värdefulla ledtrådar för klinisk praxis för att utveckla molekylära hämmande läkemedel med hjälp av mål härledda från biologiska kunskap som finns inom THBS2 signatur.
Slutsats
vår studie presenterar den första raden av bevis som THBS2 uttryck nedregleras både mRNA och proteinnivåer och minskade THBS2 uttryck i samband med den dåliga histologiska betyget magcancer. Avgörande, överuttryck av THBS2 har en signifikant korrelation med god prognos gastric cancerpatienter. Å andra sidan, THBS2 påverkade prognos vid gastrisk cancer kan inte bara genom att reglera angiogenes, men i vissa andra sätt såsom att reglera ECM omformning och hämma proliferation av gastriska cancerceller. Dessa fynd tyder på att THBS2 kan vara en potentiellt kritisk roll i patogenesen och utvecklingen av magcancer. Vi bekräftar att med den gradvisa djupstudier av THBS2, kan det vara en lovande användbar och enkel biomarkör för att förutsäga det kliniska resultatet för gastric cancerpatienter.
Metoder
Patienter och vävnadsprover sälja I den aktuella studien, vi införlivas två grupper av prover. Den första kohorten innehöll 129 formalinfixerade, paraffininbäddade human magcancer och 24 slumpmässigt utvalda normala mag vävnader. De följd rekryterades mellan december 2006 och maj 2008 från Institutionen för allmän kirurgi, Första Anslutna sjukhuset i Anhui Medical University, Hefei, Kina. Dessa prover införlivas TMA för immunohistokemisk färgning. Histologiska egenskaperna hos dessa prover bekräftades av patologer. Patologisk TNM staging utvärderades i enlighet med 2010 kriterierna i den amerikanska kommittén för cancer (AJCC). Den andra kohorten bestod av 14 gastric cancerpatienter som genomgått tumörresektion terapi vid åttonde Institutionen för allmän kirurgi, den första Anslutna sjukhuset i Anhui Medical University. Den färska gastric cancervävnad och motsvarande normal slemhinna (åtminstone 5 cm avstånd från tumörkanten) frystes omedelbart i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C fram till användning av för Kvantitativ realtids-PCR och Western blot-analys. Patienterna i båda kohorterna inte fick preoperativ kemoterapi och /eller strålning. Skriftligt informerat samtycke lämnades av alla deltagare. Alla prover hanteras anonymt enligt de etiska normer. Studien genomfördes med godkännande av etikprövningskommitté sjukhuset.
RNA-extraktion och kvantitativ realtids-PCR
Totalt RNA extraherades från den andra gruppen med hjälp av Trizol-reagens (Invitrogen) enligt tillverkarens protokoll. cDNA syntetiserades genom slumpmässiga primrar och Superscript II omvänt transkriptas (Toyobo, Osaka, Japan). De primrar som användes för amplifiering för THBS2: framåt primer 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'och omvänd primer 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) amplifierades i samma q-PCR som en intern kontroll med användning av primrar: framåt primer 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'och omvänd primer 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. Reaktionen körde på ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA) i närvaro av SYBR-grön färg (Toyobo, Osaka, Japan). Reaktionsbetingelserna var en denatureringsprogram (95 ° C under 5 min), och en förstärkning och kvantifiering program för 40 cykler (95 ° C under 15 s och 60 ° C under 45 s). Varje prov testades i triplikat, och en smältkurva analys av varje prov användes för att kontrollera specificiteten för amplifieringen. Uttrycksnivån bestämdes som förhållandet mellan THBS2 och den interna kontrollen GAPDH i mängder av mRNA beräknas genom jämförande CT-metoden.
Proteinextraktion och Western blot
Totalt protein extraherades från 14 frysta magcancer och dess motsvarande normal slemhinna vävnad av is i radio immunoprecipitation analys Lysis Buffer (RIPA, Beyotime institutet för bioteknik, Jiangsu, Kina), och mäts med hjälp av en BCA-proteinanalyssats (Beyotime institutet för bioteknik, Jiangsu, Kina). Lysatet centrifugerades vid 12000 rpm under 5 minuter, och supernatanten värmdes vid 100 ° C under 5 minuter. Då ekvivalenta proteiner i varje par prover separerades på 8% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores och elektroöver till polyvinylidenfluorid-membran (Millipore, Billerica, MA). Efter Den blockerade med TBST innehållande 5% skummjölk i vid rumstemperatur under en timme, var membranen blottades med anti-THBS2 antikropp (1: 1500; Novus) och anti-Flag (1: 3000; Sigma). Följt membran inkubation med pepparrotsperoxidas-märkt anti-kanin och anti-mus IgG som sekundär antikropp (Beyotime institute of Biotechnology). Anti-GAPDH-antikropp (1: 4000; Aogma) användes som en laddningskontrollantikropp. De bundna antikropparna detekterades med förstärkt kemiluminescens metoden.
Immunohistokemi och TMA-analys
Magcancer och normala magslemhinnan prover formalinfixerade, paraffininbäddade och användes för att konstruera en vävnad TMA. H & E-färgade objektglas screenades för att identifiera optimala intratumoural vävnad för analys. 4-im tjocka sektioner bakades vid 60 ° C under 1 timme, deparaffinised med xylener, och rehydratiserades i graderad etanol till destillerat vatten. Antigenåtervinning uppnåddes med att placera sektionerna med citratbuffert i en ris ångare under 30 minuter. Att släcka den endogena peroxidasaktiviteten var sektionerna behandlades med 3% H 2O 2 i metanol. Sedan använde vi 1% bovint serumalbumin för att blockera ospecifik bindning. Anti-THBS2 antikropp (Novus, 1: 2000) och anti-CD34 (Abcam, 1: 250) inkuberades med sektionerna vid 37 ° C över natt, inkuberades sedan med pepparrotsperoxidas-märkt anti-kanin IgG som den sekundära antikroppen (Life tekniker). I slutändan var diabilder placeras på en Autostainer länk instrument och fortsätta med färgning. För negativa kontroller, var de primära antikropparna ersattes med normalt kaninserum. Den slutliga effektiva immunhistokemisk färgning utvärderades av två oberoende patologer utan att känna till informationen om patienter enligt färgningsintensitet och omfattningen av färgning. Vävnadssnitt poängsattes som den procentuella andelen färgade cytoplasman i magcancer körtelceller och normala körtelceller (0 poäng för inga celler färgas, 1 poäng för < 25%, 2 poäng för 25-75%, och 3 poäng för > 75 % av celler färgade) och färgningsintensiteten av immunoreaktivitet graderades på en skala från 0 till 3. immunreaktivitet score (IRS) till berodde på multiplikation av båda parametrarna. Prover bedömdes enligt följande: negativ (IRS = 0 ~ 2), positiv (IRS = 3 ~ 9) katalog MVD räknar
Immunhistokemisk färgning av CD34 och allmänt accepterade kriterier som utförs av Weidner et al.. [36] användes för MVD räkning. Alla färgade endotelceller eller endotelceller kluster separerades från intilliggande mikrokärl, och tjockleken av varje kärlväggen över 2,75 um skulle uteslutas. Tre separata sektioner som innehåller hot-spots (där det högsta antalet diskreta mikrokärl var färgade) i varje prov av TMA valdes i låga förstoringar (100 ×) under ett ljusmikroskop (Leica, Tyskland). Därefter tillsattes mikrokärl räknades i varje avsnitt i hög förstoring (200 x). P Hotel <

• LNC RNA Hotair fungerar som en konkurrerande endogen RNA att reglera HER2 uttryck genom svamp MIR-331-3p i magsäcken cancer
• Proteomik förändring i gastic adenokarcinom från japanska patients