Žemyn reguliavimas Thrombospondin2 prognozuoja prastą prognozę pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu

Žemyn reguliavimas Thrombospondin2 prognozuoja prastą prognozę pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu
tezės
Background pervežimas Thrombospondins (THBSs) Yra multidomain ir išskiriami matricellular Ca šeima 2 + -binding glikoproteinai, kurie turi bent penkis prisijungę užkoduota nepriklausomų genuose. Kaip THBSs šeimos nariui, Thrombospondin2 (THBS2) buvo pranešta reguliuoti angiogenezę. Nepaisant to, funkcijos ir klinikinė reikšmė THBS2 dar lieka neaišku, skrandžio vėžio.
Metodai Viesbutis The iRNR ir baltymų ekspresijos lygis THBS2 buvo įvertintas 14 suporuotas skrandžio vėžio egzempliorių ir atitinkamai normalus mucosas naudojant kiekybinius realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė analizė. Imunohistocheminis iš THBS2 ir CD34 dėl gyventojų pagrindu audinių mikrogardelių sudėtyje yra 129 skrandžio vėžio atvejų buvo naudojamas įvertinti prognostinę reikšmę kiekvieno bandinio THBS2 ir kraujagyslių tankį (MVD). Išgyvenimo analizė buvo atliekama Kaplan-Meier metodu ir Cox proporcinės rizikos modelį. Kolonija formavimas tyrimas, endotelio ląstelių vamzdis formavimas tyrimas, ląstelių migracija tyrimas ir apoptozė analizė MKN-45 ir SGC-7901 ląstelių linijų buvo atliekami, siekiant įvertinti THBS2 poveikį skrandžio vėžio in vitro
.
Rezultatai
85.71% (12 iš 14) skrandžio vėžys audiniai išreikšti nepaprastai mažesnę THBS2 abiejose mRNR ir baltymų koncentracijos už atitinkamą įprastos kontrolės. Nuosekliai, audinių mikrogardeliq (PMA) rezultatai parodė, THBS2 lygiai taip pat buvo slopinamas skrandžio vėžio audiniuose, lyginant su įprastais valdikliais. Be to, mes nustatėme, kad pacientams, sergantiems aukštesnio lygio THBS2 buvo reikšmingai koreliavo su daugiau palanki prognozė, o sumažėjo THBS2 išraiška buvo susiję su skurdesnių histologinių rūšių skrandžio vėžio. Be to, mūsų in vitro eksperimentų dar parodė, kad padidėjusią THBS2 gali trukdyti tiek platinimo norma ir vamzdelio formavimąsi žmogaus bambos venos endotelio ląstelių (HUVECs) į MKN-45 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių linijų.
Išvada
Mūsų tyrimas rodo, THBS2 yra nenormaliai išreikštas skrandžio vėžio ir vaidina svarbų vaidmenį vėžio progresavimą, kuris gali būti potencialus prognozė prognozuoti skrandžio vėžio.
Raktiniai žodžiai
THBS2 skrandžio vėžio angiogenezę prognozinių žymenų Įžanga
skrandžio vėžys yra labai agresyvus ir mirtina piktybinis navikas. Iš 952,000 naujų skrandžio vėžio atvejų ir 723,000 mirčių viso buvo apskaičiuota, kad įvyko 2012 metais, sudaro 6,8% visų atvejų ir 8,8% visų mirčių. Be to, abu nauji atvejai ir mirčių skrandžio vėžiu Kinijoje, užėmė 1. visame pasaulyje, sudaro daugiau kaip 40% to pasaulyje [1]. Todėl didieji susirūpinimas dėl skrandžio vėžio tyrimų.
Thrombospondins (THBSs) yra iš multidomain ir matricellular Ca šeima 2 + -binding glikoproteinai išskiriami stromos fibroblastų, endotelio ląstelių ir imuninės ląstelės [2]. Jie turi ne mažiau kaip penki nariai užkoduotus nepriklausomų genų. Iki privalomas su daugybe tikslinių baltymų, jie dalyvauja įvairių biologinių procesų, pavyzdžiui, angiogenezę, ląstelių judrumui, apoptozės, Citoskeletas organizacija, ir tarnauja kaip sąveika platformų tarpląsteliniame (ECM) [3, 4]. Pažymėtina, THBS1 ir THBS2 yra ypatingas tuo šios šeimos už jų I tipo kartojasi ir jie abu yra daugiausia rodomi kaip inhibitoriais angiogenezę [5, 6], viena esminė vėžio tyrimų [7-9]. Kraujagyslių tankis (VRM) yra plačiai naudojamas parametras įvertinti angiogenezę laipsnį auglių su CD34 būdamas kraujagyslių virimo aparatas skrandžio vėžio [10]. Remiantis ankstesnių tyrimų išvadas [2], mes pateikti hipotezę mūsų tyrime, kad ji taip pat gali turėti įtakos skrandžio vėžio angiogenezę.
Be angiogenezę, THBS2 buvo pranešta bendrauti su keliais ląstelių receptorių, augimo faktorių ir ECM baltymų taip pat reguliuoja apoptozę, ląstelių proliferaciją ir sukibimą [11]. Vėžiu tyrimų, vis mandagumas buvo sutelktas į THBS2. Tokunaga ir kt. [12] nustatė, kad THBS2 išreiškė pacientams, sergantiems storosios žarnos vėžio eksponuojami didelę mažesnę riziką kepenų metastazių ir naviko kraujagyslių palyginti su pacientų, kurių navikuose buvo THBS2 trūkumas. Be to, De FRAIPONT ir kt. [13] parodė, kad THBS2 reikšmingai koreliavo su klinikinės būklės ir rezultatus, o daugumai auglių, buvo atvirkštinė koreliacija tarp THBS2 ekspresijos lygį ir jų piktybinių navikų laipsnį. Be to, THBS2 taip pat suvaidino svarbų vaidmenį krūties vėžio [14], mieloma [15], piktybinės melanomos [16], prostatos vėžio [17] ir plaučių adenokarcinomos [18, 19]. Skrandžio vėžio, kiti nariai THBSs, THBS1 [20] ir THBS4 [21] galėtų būti kaip prognostinis biologinis žymuo ar galingas žymeklis difuzinis tipo skrandžio adenokarcinomos. Tačiau detalusis funkcija THBS2 skrandžio vėžio ir jos pasekmės klinikinės diagnozuoti tebėra niūrus. Taigi, mes bandėme atskleisti klinikinė reikšmė THBS2 ir jos poveikį skrandžio vėžio.
Norėdami patikrinti mūsų minėtą hipotezę, mes išnagrinėjome THBS2 raiškos lygį žmogaus skrandžio vėžio audiniuose ir atitinkamas normalius audinius ir tada ištirti galimą koreliaciją tarp išraiška THBS2 ir klinikos ypatumus, klinikinės prognozės ir MVD skaičiavimo pacientams su skrandžio vėžiu. Be to, kolonija formavimas tyrimas, endotelio ląstelių vamzdis formavimas tyrimas, ląstelių migracija tyrimas ir apoptozė analizė buvo atliekama MKN-45 ir SGC-7901 ląstelių linijų ištirti in vitro
poveikį THBS2 skrandžio vėžio ląsteles.
rezultatai
pacientų charakteristikos ir klinikiniai rezultatai
Šiame tyrime mes mokosi 129 atrinktų pacientų, kurį sudarė 101 vyrų ir 28 moterų. Iš pacientų amžius svyravo nuo 29 iki 80 metų (y), kurių vidutinis amžius 61y. Visi klinikos charakteristikos yra apibendrinti 1 lentelėje vidutinis bendrasis išgyvenamumas (BI) pacientų buvo 57 mėnesių, vidutinė OS buvo 44,01 [95% pasikliautinasis intervalas (PI) 39.78-49.24 mėnesių] .table 1 asociacija tarp klinikos kintamųjų ir THBS2 išraiška ir bendras išgyvenamumas skrandžio vėžio pacientų
Kintamieji
Neigiama
Positive
Viso kodas
P valuea
bendras išgyvenamumas OS
log-rank PB
HR (95% PI)
Ne. (%)
Ne. (%)
Amžius (m )
0,112
0,743
< 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (nuoroda)
≥61
35 ( 53,0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67-1,77)
Lytis
0,831
0.405
Vyras
47 (46,5) 54 (
53,5)
101
1 (nuoroda)
Moteris
12
(42,9) 16 (57,1)
28
0.76 (0.40-1.45)
histologinio laipsnio
0,005
0,011
Na ir vidutinio
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (nuoroda)
neturtingųjų ir kitų
35 (60,3 )
23 (39,7) 58
1.89 (1.16-3.09)
auglio vietą
0,419
0,204
Aukštutinė
27 (40,3)
40 ( 59.7)
67
1 (nuoroda)
Vidurio
15 (53,6)
13 (46,4) 28
1,66 (0,86-3,18)
Žemutinės
17 (50,0)
17 (50,0)
34 (0,90-4,01)
invazijos gylis

1.90 0.271
0,001
T1-T2
9 ( 34,6)
17 (65,4)
26
1 (nuoroda)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11.60 (2.83 -47,45)
Limfmazgių metastazės
0,454
< 0,001
Nėra
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (nuoroda)
dabartis
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5.16 (2,46-10,84)
TNM etapą
0.283 pervežimas < 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (nuoroda)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52-14,49)
Bold vertė yra statistiškai reikšmingi, kai p
< 0,05 HR rizikos santykis.
A, p
vertė klinikos kintamųjų ir THBS2 išraiška.
B, p
vertė asociacijos tarp klinikos kintamųjų ir bendro išgyvenamumo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.
THBS2 yra žemyn reguliuoja skrandžio vėžio
siekiant nustatyti raiškos lygius THBS2 skrandžio vėžio, mes pirmą kartą įvertino iRNR raiškos lygius THBS2
skrandžio vėžio kiekybinio realiu laiku antroje kohortos. Tai mėginių kohortos, paminėta metodų, įtrauktų 14 žmogaus skrandžio vėžiu ir atitinkamas normalius audinius. Kaip parodyta 1a paveiksle, THBS2
lygis buvo gerokai mažesnis 85,7% (12 iš 14), skrandžio vėžio audiniuose nei jos įprastos kontrolės, o likusios dvi poros pavyzdžių eksponuojama priešingai. Tada mes aptiko baltymo ekspresija lygius THBS2 per Vakarų dėmė toje pačioje kohortos. Kaip parodoje Figure1B ir C, mes nustatėme, kad THBS2 baltymo ekspresija koncentracija sumažėjo 85,7% (12 iš 14) iš navikų mėginiuose, palyginti su atitinkamu kontrolės, o 5 ir 11 pavyzdys rodomas atvirkščiai. Norėdami patvirtinti šią išvadą, mes dar atliekami audinių mikrogardeliq (PMA) ir įvertino baltymo ekspresija lygius THBS2 pagal reaktyvumas balas (IRS) kiekvieno bandinio. Mes nustatėme, THBS2 baltymai daugiausia buvo išreikštas skrandžio ląstelių (2a pav) cytoplasms ir laikantis Vakarų dėmė rezultatai, THBS2 lygis buvo žymiai slopinamas skrandžio vėžio audiniuose, lyginant su įprastais kontrolės (2b pav P < 0,05). Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, kad THBS2 yra žemyn reguliuojama skrandžio vėžio tiek mRNR ir baltymų koncentracijos. 1 pav iRNR ir baltymų ekspresijos lygis THBS2 14 skrandžio vėžiu audinių ir atitinkama normalių audinių. (A), Santykinis iRNR raiška THBS2 buvo aptikta kiekybinė realaus laiko PGR. Išraiška normaliuose audiniuose buvo normalizuoti iki 1,0, kaip nurodyta. (B) Densitometry analizės rezultatai, THBS2 juostų buvo normalizuotas GAPDH naudojant Vaizdo J. išraiška normaliuose audiniuose buvo normalizuotas iki 1,0 kaip nurodyta. (C) Santykinis baltymų ekspresija THBS2 buvo apskaičiuota Vakarų blot tyrimu.
2 paveikslas Imunohistocheminiais analizę THBS2, CD34. (A), atstovas vaizdai THBS2 ir CD34 ekspresijos: N1, N2, N3, N4, normalus skrandžio audinių (N); M1, M2, M3, M4, vidutiniškai diferencijuoti (M); P1, P2, P3, P4, prastai diferencijuoti (P). Didinimas: 100 × (N1, P1 P1, N3, P3, P3), 200 × (N4, M4, P4) ir 400 × (N2, M2, P2). (B), palyginimas THBS2 išraiškos skrandžio vėžiu (n = 129) ir normalių skrandžio audinių (n = 24) TMA. THBS2 išraiška lygis pateikiami kaip vidurkis ± SEM. (C) palyginimas MVD į THBS2-teigiamas skrandžio vėžys grupė (n = 70) ir THBS2-neigiamas skrandžio vėžio grupėje (n = 59). Dots atstovauti MVD kiekvienos mėginių. Vertybės yra priemonė ± SEM.
THBS2 ekspresijos lygis atvirkštinė koreliacija su histologinių rūšių skrandžio vėžio
išsamiau paaiškinti klinikinę svarbą THBS2, mes analizavo tarp THBS2 baltymų ekspresijos ir klinikiniais požymiais santykius, įskaitant amžių, lytį, histologinių kokybės, naviko vietą, gylis invazija, limfmazgių metastazės ir TNM stadija skrandžio vėžiu pacientams THBS2-teigiamų ir neigiamų grupių. Kaip parodyta 1 lentelėje, mes nustatė reikšmingą atvirkštinę koreliaciją su histologinių rūšių skrandžio vėžio (P
< 0,01). Histologinės rūšių Pacientų THBS2-teigiamas grupėje buvo labiau tikėtina, kad bus gerai ir vidutinio sunkumo, o pacientai THBS2-neigiamas grupės linkusios būti prasta ir kt. Tačiau, mes, nepavyko rasti kokią nors reikšmę statistiškai tarp ekspresijos lygių THBS2 ir kitų klinikinių parametrų. Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad THBS2 yra atvirkštinė koreliacija su histologinio laipsnio skrandžio vėžio.
THBS2 ekspresijos lygis atvirkštinė koreliacija su MVD skrandžio vėžio
Ankstesnės ataskaitos numanomų THBS2 gali reguliuoti naviko angiogenezę [6], tačiau nė vienas buvo pranešta skrandžio vėžio. Taigi, mes paprašėme, ar buvo kokių nors koreliacija tarp MVD ir THBS2 ekspresijos lygį, taip pat kiti klinikiniai parametrai mūsų klinikinių mėginių. Į 129 skrandžio vėžio egzempliorių VRM svyravo nuo 0 iki 120, su 40 mediana ir vidurkis 48.12 ± 28.99 (vidurkis ± SN) pagal CD34 reaktyvumas mūsų TMA. Kaip parodyta 2C paveiksle, THBS2 reikšmingai koreliavo su MVD. Į THBS2-neigiamas grupės VRM buvo daug didesnis nei, kad THBS2-teigiamas grupėje (p
< 0,001). Tačiau mes negalėjome laikytis visų statistinius skirtumus MVD ir kitų clinicopathologic funkcijų, įskaitant klinikinės prognozės mūsų mėginių (duomenys neparodyti). Taigi, mūsų atradimai rodo, kad THBS2 yra atvirkštinė koreliacija su MVD skrandžio vėžio.
THBS2 yra reikšmingai susijęs su klinikiniais prognozė skrandžio vėžiu sergantiems pacientams
išnagrinėti ryšį tarp THBS2 saviraiškos ir klinikinės prognozė skrandžio vėžiu sergančių pacientų santykius, mes atlikome išlikimo analizuoja vieną požymį ir daugiamatis Cox proporcinės rizikos regresijos modelį. Kaip parodyta 1 lentelėje, mes nustatėme, histologiniai kokybės, gylis invazija, limfmazgių metastazės ir TNM stadija buvo statistiškai reikšmingi veiksniai OS į vieną požymį analizė. Tačiau, kadangi TNM stadija taip pat yra iš gylio invazija ir limfmazgių metastazių informaciją, mes dar atliekami daugiamatis išlikimo analizių koregavimo histologinės lygio ir TNM etape. Pastebėjome, kad TNM stadija (p
< 0,001) ir THBS2 išraiška (p
< 0,01) buvo abu nepriklausomi prognostiniai veiksniai pacientų rezultatų vertinimą. Aukštojo TNM stadija buvo rizikos veiksnys ilgesnį OS [P
< 0,001 HR (rizikos santykis) = 7,23, 95% PI 3,55-14,69) ir padidėjusi išraiška THBS2 buvo dar palankus veiksnys ilgesniam OS (p
< 0,01, ŠS = 0,51, 95% PI 0,31-0,85). Be to, Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė dar kartą patvirtino, kad THBS2 išraiška reikšmingai koreliavo su klinikiniais rezultatais (pav 3, p < 0,01, n = 129). Pacientai, kurių apatinė THBS2 raiškos ekrane žymiai trumpesnį OS [vidutinis 36 mėnesių, reiškia 40,07 ± 3,65 (vidurkis ± SE) mėnesių], kadangi pacientams, sergantiems didesnis THBS2 išraiškos parodė teigiamą prognozę [vidutinis 59 mėnesių, reiškia 53.70 ± 2.95 (vidurkis ± SE ) mėnesių]. Kartu, mūsų rezultatai rodo, THBS2 yra reikšmingai susijęs su klinikine prognozė skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kurie gali tapti prognostinė žymeklis skrandžio vėžio. 3 Kaplan-Meier išgyvenamumo analizė su log-rank testas bendro išgyvenamumo (OS). Kaplan-Meier analizė iš skirtingų THBS2 ekspresijos lygį ir OS į 129 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams koreliacijas.
Padidėjusi THBS2 slopina skrandžio vėžio ląsteles in vitro
augimą Kadangi THBS2 buvo gerokai žemyn reguliuojama skrandžio vėžys, mes daryti išvadą, kad THBS2 gali slopinti augimą, skatina apoptozę ir stiprinti migracijos galimybę skrandžio vėžio ląsteles. Norėdami patikrinti savo hipotezę, mes pirmą kartą pastatytas vienas lentiviruso vektorių stabilių greitojo THBS2 nuorašai skrandžio vėžio ląstelių linijas. Altered išraiška THBS2 293, T ląstelių buvo patvirtinta Vakarų dėmė analizė (4a pav.) Tada mes pasirinkome MKN-45 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių linijas mūsų in vitro pervežimas tyrimo, nes iRNR raiška lygiai THBS2 buvo mažesnės nei kiti (duomenys neparodyti). Mes tada atliko kolonija formavimo tyrimą, siekiant įvertinti THBS2 poveikį MKN-45 ir SGC-7901 ląstelių augimą. Kaip nurodyta 4B paveiksle, mes nustatėme ląsteles THBS2 raiškos suformuota žymiai mažiau kolonijų ant minkšto agaro, palyginti su tais, kontrolės užkrato užkrėstas ląsteles (p
< 0,01 MKN-45 ląstelių ir p
< 0,001 SGC-7901 ląstelių, atitinkamai). Be to, mes išnagrinėjome apoptozę lygių tarp šių dviejų grupių abiejų ląstelių linijų ir atrado, kad THBS2 skatinamas apoptozę SGC-7901 ląstelių (4f pav), bet ne MKN-45 ląstelių (papildomas failą 1: S1A pav). Ir nebuvo jokių reikšmingų skirtumų tarp dviejų grupių SGC-7901 ir MKN-45 ląstelių linijų ląstelių migraciją pagal į transwell tyrimai (papildomos failą 1: S1B ir C pav.) Apibendrinant galima teigti, kad mūsų duomenys patvirtina, kad THBS2 trukdo skrandžio vėžio ląstelių augimą in vitro galbūt per apoptozės reglamentą. 4 pav Padidėjusi THBS2 slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, slopino skrandžio vėžio angiogenezę, ir skatinti apoptozę SGC-7901 ląstelių linijos in vitro. (A), Vakarų dėmė analizė Žymėti 293, T ląstelių su THBS2 raiškos. (B), kolonija skaičius analizė MKN-45 ir SGC-7901 ląstelių su THBS2 raiškos ir neigiamos kontrolės. Vertybės yra priemonė ± SD nuo trijų nepriklausomų eksperimentų. (C) vaizdai kolonija formavimo metodu. (D) AngiogenicIndexCh1 analizė endotelio ląstelių vamzdžių formavimo metodu. Vertybės yra priemonė ± SD. (E) Vaizdai iš endotelio ląstelių vamzdelio formavimosi tyrime. (F) analizė Apoptozės MKN-45 ląstelių linija. Vertybės yra priemonė ± SD.
THBS2 slopina skrandžio vėžys angiogenezę in vitro
THBS2 yra žinomas kaip angiogenezę inhibitorius [2]. Pateikti įrodymus apie THBS2 reguliuoja angiogenezds fenotipą skrandžio vėžio, endotelio ląstelių vamzdžių formavimo tyrimai buvo atlikti. Kaip parodyta 4E ir D pav abiem MKN-45 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių linijų, žmogaus bambos venos endotelio ląstelių (HUVECs) išauginti su laikmenoje THBS2-raiška skrandžio vėžio ląstelių parodė žymiai mažesnes AngiogenicIndexCh1 nei neigiamos kontrolės (p
< 0,05 MKN-45 ląstelių ir P
< 0,001 SGC-7901 ląstelių, atitinkamai). Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad THBS2 slopina skrandžio vėžio ląsteles in vitro
angiogenezę.
Diskusijos
THBS2 yra žinomas kaip natūralus stipriai slopina angiogenezę priklausantis remodeling procesas [22, 23] moduliatorius. Tačiau nė vienas iš buvusių tyrimų aptarė THBS2 ir jo klinikinės reikšmės skrandžio vėžio vaidmenis.
Pirma, mes nustatėme, kad iRNR ir baltymų ekspresijos lygis THBS2 buvo žemyn reguliuojama daugeliu pavyzdžių. Tačiau vienas ankstesnių tyrimų pranešė THBS2 iRNR raiška lygiai skrandžio vėžiu buvo didesnė nei įprasta kontrolės [24]. Atsižvelgiant į ribotą imties dydį šiame tyrime, kuris įtrauktas tik 6 audinių pavyzdžius, galima šio skirtumo dėl naviko heterogeniškumo dvi poros mūsų antrajame pulke nebuvo taip parodyti pačius modelius. Tačiau mūsų vėlesnis rezultatas TMA, didesnis imties dydis, atitiko to nuo antros kohortos. Kartu paėmus, mes tikime, kad THBS2 buvo labiau tikėtina, kad būti žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ląstelių, lyginant su normalios gleivinės.
Be to, mes taip pat pastebėjo, kad santykinė išraiška pavyzdžių eksponuojama skirtingai mRNR ir baltymų lygį. Neturėdami pakankamai įrodymų, mes išvadą, kad THBS2 funkcija per skrandžio vėžio ląstelių galima reguliuoti kai kurių ląstelėje tiekėjų signalizacijos veiksnių, baltymų ubiquitination ir kitų galimų būdų, kurie gali turėti įtakos baltymų lygius THBS2 ir fenotipų skrandžio vėžio ląsteles. Ir toliau dėmesys gali būti skiriamas šio įdomaus reiškinio. Nepaisant to, mėginių iš mūsų antrajame pulke dauguma rodomas tas pačias išraiškos būdus tarp iRNR ir baltymų koncentracijos.
Antra, mūsų duomenys rodo, kad THBS2 galėtų skatinti apoptozę tik SGC-7901 ląstelių, bet ne MKN-45 ląstelių. Buvę tyrimai parodė, kad N-terminalas rekombinantinis fragmentas THBS2 gali aktyvuoti CD36 tarpininkaujant endotelio ląstelių apoptozę [14], ir CD36 ir THBS2 derinys gali aktyvuoti kaspazės signalizacijos kelią [25]. Taigi, mes prielaidą, kad iš dviejų naudojamų ląstelių linijų mūsų tyrime heterogeniškumas, kaip diferencijuotų CD36 raiška, gali iš dalies būti įvairių lygių apoptozės sukeltos THBS2, kuriose raginama tolesnių tyrimų priežastis.
Trečia, mūsų rezultatai parodė, kad THBS2 gali slopinti angiogenezę skrandžio vėžio. Ji yra žinoma, kad naviko proliferaciją ir invazijos, arba metastazių yra priklausomi nuo angiogenezės [26]. Ir pagrįsti įrodymai paremti mūsų atradimą ir atkreipti dėmesį, kad galimi mechanizmai, THBS2 slopina angiogenezę: 1) apoptozė nepriklausomas mados stimuliuoja endotelio ląstelių apoptozę ląstelės ciklo suimti bei mažinant endotelio ląstelių migraciją [27], 2) priklausomai nuo kaspazės signalizacijos kelias aktyvuojamas CD36 [28]. 3) veikia kaip bendraturčių receptoriais mažo tankio lipoproteinų receptorių, susijusių baltymų (LRP1), kuri galėtų išvalyti THBS2 kompleksus su matricos metaloproteinazėmis-2 -9 ar kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) iš pericellular aplinkos mezenchiminių ląstelių [ ,,,0],29-32].
Galiausiai VRM yra vienas iš dažniausiai naudojamų parametrų įvertinti naviko angiogenezę ir ankstesnių tyrimų laipsnį rast VRM gali būti nepriklausomas prognozinis veiksnys skrandžio vėžiui ir kitų vėžinių [33-35]. Mūsų tyrime, mes nustatėme, VRM reikšmingai koreliavo su THBS2 baltymų raiškos (p
< 0,001) skrandžio vėžys, bet ne su klinikiniais požymiais ir klinikinės prognozė. Šie rezultatai parodė, kad THBS2 gali paveikti angiogenezę skrandžio vėžiu, nepaisant to, nes nėra koreliacijos tarp MVD ir prognozės mūsų pavyzdžių, įtarėme, kad didesnis THBS2 išraiška rodo, ilgesnį išgyvenamumą buvo ne tik per slopinančiu angiogenezę skrandžio vėžio, kitų mechanizmų, tokių kaip reguliuoti ECM restauravimo [23] ir platinimu norma skrandžio vėžio ląsteles, taip pat gali būti priežastis, kad reikia tolesnių tyrimų ištirti.
Bendrai, mūsų išvados pabrėžė svarbiausių vaidmenų THBS2 į prognozinių reikšmes, taip pat naviko proliferaciją ir angiogenezę skrandžio vėžys. Šie duomenys rodo, THBS2 gali būti svarbus prognostinis žymuo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Be to, remiantis THBS2 poveikio naviko vystymąsi ir angiogenezę, mūsų tyrimai suteikti vertingų clues dėl klinikinės praktikos plėtoti molekulinius slopina terapija naudojant tikslus Remtasi biologinės žinių teikiamos THBS2 parašu.
Išvada
Mūsų tyrimas dovanas pirmoje eilutėje įrodymų, kad THBS2 išraiška žemyn reguliuojamų tiek mRNR ir baltymų koncentracijos ir sumažėjo THBS2 išraiška yra susijusi su prasta histologinio laipsnio skrandžio vėžio. Svarbiausia, padidėjusią THBS2 turi didelę koreliaciją su palanki prognozė skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Kita vertus, THBS2 įtakos prognozę skrandžio vėžio gali ne tik per reguliuojant angiogenezę, tačiau kai kuriais kitais būdais, pavyzdžiui, reguliuojant ECM restauravimo ir slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją. Šie rezultatai rodo, kad THBS2 gali būti potencialiai svarbus vaidmuo į patogenezės ir progresavimo skrandžio vėžio. Mes patvirtiname, kad, palaipsniui gylis tyrimų THBS2, ji gali būti perspektyvus naudinga ir paprasta biologinis prognozuoti klinikinei baigčiai skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.
Metodai
Pacientai ir audinių mėginiai
Šiame tyrime mes įtraukti du kohortos egzempliorių. Pirmasis kohortos pateikta 129 formalinu fiksuoto, parafino-embedded žmogaus skrandžio vėžiu ir 24 atsitiktinai parinktus normalus skrandžio audinius. Jie buvo iš eilės įdarbino nuo 2006 gruodžio iki 2008 gegužės iš departamento Bendrosios chirurgijos, pirmasis Susijusi ligoninė Anhui medicinos universiteto, Hefei, Kinija. Šie mėginiai buvo įtraukta į PMA imunohistochemiškai dažymo. Histologiniai požymiai šių egzempliorių buvo patvirtinta patologai. Patologinė TNM sustojimo buvo vertinami pagal 2010 m kriterijus Amerikos jungtinio komiteto vėžys (AJCC). Antrasis kohortos buvo sudarytas iš 14 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams, kuriems atlikta naviko rezekcijos gydymą Aštuntosios departamento Bendrosios chirurgijos, pirmasis filialas ligoninės Anhui medicinos universitete. Šviežios skrandžio vėžio audinių ir atitinkami normalų gleivinę (ne mažiau kaip 5 cm nuo naviko krašto) buvo nedelsiant įšaldyti skystu azotu ir saugomi -80 ° C iki naudojant kiekybinių realaus laiko PGR ir Vakarų blot analizė. Pacientai tiek narkomanų negavau priešoperacinė chemoterapija ir /ar radiacija. Parašė informuotas sutikimas buvo pateikta visiems dalyviams. Visi egzemplioriai buvo perkrauta anonimiškai pagal etinius standartus. Šis tyrimas buvo atliktas su etinio vertinimo komiteto ligoninę patvirtinimo.
RNR gavyba ir kiekybinius realaus laiko PGR
viso RNR išskirta iš antro kohortos naudojant Trizol reagento (Invitrogen) pagal gamintojo protokolą. kDNR buvo susintetintas atsitiktinių pradmenų ir Viršutinis II atvirkštinės transkriptazės (Toyobo, Osaka, Japonija). Pradmenys naudojamos sustiprinimui už THBS2: pirmyn gruntas 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 "ir pakeisti gruntas 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3". Gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) amplifikuoja toje pačioje q-PGR kaip vidaus valdymo, naudojant pradmenis: persiunčia gruntas 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'ir atbulinės eigos gruntą 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. Reakcija gavo perdavima iš gilumos ABI 7900HT Sequence Detection System (Taikomosios Biosystems, CA, JAV) iš SYBR žalia dažų buvimą (Toyobo, Osaka, Japonija). Reakcija sąlyga buvo denaturavimo programą (95 ° C 5 min), ir amplifikacijos ir kiekybinio įvertinimo programą, skirtą 40 ciklų (95 ° C temperatūroje 15 s ir 60 ° C temperatūroje 45 S). Kiekvienas mėginys buvo tiriamas trimis egzemplioriais, ir lydymosi kreivė analizė kiekvieno mėginio buvo patikrinti naudojamas amplifikacijos specifiškumą. Sąvoka lygis buvo nustatomas kaip santykis tarp THBS2 ir vidaus kontrolės GAPDH į mRNR priskaičiuotas pinigų sumas lyginamosios KT metodu.
Baltymai gavybos ir Vakarų dėmė
viso baltymų buvo paimti iš 14 šaldytos skrandžio vėžio ir atitinkamų jos normalus gleivinės audinio ledo radijo imunoprecipitacijos bandymo lizės buferiniame tirpale (Ripa; Beyotime biotechnologijos institutas, Jiangsu, Kinija) ir matuojamas BCA baltymų bandymo rinkinį (Beyotime biotechnologijos institutas, Jiangsu, Kinija). Lizatas buvo centrifuguojamas 12000 rpm 5 minutes, ir viršutinis sluoksnis buvo kaitinamas 100 ° C temperatūroje 5 minutes. Tada lygiaverčiai baltymai kiekviena pora egzempliorių buvo atskirti nuo 8% natrio laurilsulfatas poliakrilamido gelyje ir electrotransferred į polivinilidenfluorido membranų (Millipore, BILLERICA, MA). Po to, kai užblokuotas su TBST, kurių sudėtyje yra 5% lieso pieno kambario temperatūroje vieną valandą, membranas pernešama su anti-THBS2 antikūno (1: 1500; Novus) ir anti-Vėliava (1: 3000; Sigma). Po membranos inkubacijos su krienų peroksidazės žymėto anti-triušių ir anti-pelės IgG kaip antrinio antikūno (Beyotime Biotechnologijos institutas). Anti-GAPDH antikūnas (1: 4000; Aogma) buvo naudojamas kaip pakrovimo antikūnų kontrolinės. Surišti antikūnai buvo aptikta su sustiprinto cheminės liuminescencijos metodas.
Imunohistocheminis ir PMA analizė
Skrandžio vėžio ir normalių skrandžio gleivinės egzempliorių buvo formalinu fiksuoto, parafino-įterptųjų ir buvo naudojami statyti audinių PMA. "H & E-tamsintas skaidres buvo tikrinami, siekiant nustatyti optimalų intratumoural audinį analizei. 4-mkm storio segmentai kepdavo esant 60 ° C temperatūroje 1 valandą, deparaffinised su ksilenas, ir rehidratuoti surūšiuoti etanolio į distiliuoto vandens. Antigenas paieška buvo pasiektas išdėstome skyrius su citrato buferiu į ryžių garlaivis 30 minučių. Numalšinti vidinį peroksidazės aktyvumo, sekcijos buvo gydomi 3% H 2O 2 metanolyje. Tada mes naudojamas 1% galvijų serumo albumino blokuoti nespecifinis privalomas. Anti-THBS2 antikūnas (Novus, 1: 2000) ir anti-CD34 (Abcam, 1: 250) buvo inkubuojamos su sekcijų 37 ° C temperatūroje per naktį, po to inkubuojamos su krienų peroksidazės žymėto anti-triušio IgG kaip antrinio antikūno (Life technologijos). Galų gale, skaidres buvo paguldomas ant autostainer nuorodą priemonės ir darykite su dažymo. Dėl neigiamos kontrolės, pirminiai antikūnai buvo pakeistas su normaliu triušio serumu. Galutinis veiksminga imunohistocheminį dažymo vertino du nepriklausomi patologai nežinant pacientų Pasak dažymo intensyvumo ir apimties dažymo informaciją. Audinių skyriuje buvo įmuštas kaip tamsintas citoplazmoje procentais skrandžio vėžys liaukų ląstelių ir normalių liaukų ląstelių (0 taškų ne ląstelių tamsintas, 1 taškas < 25%, 2 taškai už 25-75%, o 3 taškus > 75 % ląstelių nudažomi), ir raiškos intensyvumas iš reaktyvumas buvo rūšiuojami nuo 0 iki 3. reaktyvumas rezultatas (IRS) buvo atsirado iš abiejų parametrų dauginimo mastu. Mėginiai buvo pelnyti taip: neigiamas (IRS = 0 ~ 2), teigiamas (IRS = 3 ~ 9)
VRM skaičiavimo
Imunohistocheminiais dažymas CD34 ir visuotinai pripažintus kriterijus, pagal Weidner et al atlikti.. [36] buvo naudojami MVD skaičių. Bet nudažomi endotelio ląstelės arba endotelio ląstelių grupės buvo atskirtos nuo gretimų mikrokraujagyslių, ir kiekvieno kraujagyslių sienelių storis per 2,75 mkm būtų atskirta. Trys atskiri skyriai, kuriuose yra karšto-dėmės (kur buvo tamsintas daugiausia diskrečiųjų kraujagyslėms) kiekvienoje iš PMA atrankoje, buvo pasirinktas mažas didinimui (100 ×) pagal šviesos mikroskopu (Leica, Vokietija). Vėliau mikrokraujagyslės buvo skaičiuojami kiekvieno aukšto priartinimas (200 ×) skyriuje. P
<

• LNC RNR HOTAIR veikia kaip konkuruojančio endogeninio RNR reguliuoti HER2 raiška sponging MIR-331-3p skrandžio cancer
• PROTEOMIKOS pakeitimą, gastic adenokarcinomos iš Japonijos patients