Вниз регулирование Thrombospondin2 предсказывает плохой прогноз у больных раком желудка

Вниз регулирование Thrombospondin2 предсказывает плохой прогноз у больных раком желудка
Аннотация
Справочная информация
Thrombospondins (THBSs) представляют собой семейство многодоменном и секретируется matricellular Ca 2 + -связывающие гликопротеинов, который имеет по крайней мере, пять членов кодируются независимыми генами. В качестве члена семьи THBSs, Thrombospondin2 (THBS2) сообщается регулировать ангиогенез. Тем не менее, функции и клиническое значение THBS2 до сих пор остается неясным, при раке желудка.
Методы
Уровни мРНК и экспрессии белка из THBS2 были оценены в 14 парных желудочных образцов рака и соответствующие нормальные слизистые оболочки с помощью количественной ПЦР в реальном времени и вестерн-блот анализ. Иммуногистохимия THBS2 и CD34 на микрочипов ткани населения на основе состоящих из 129 случаев рака желудка были использованы для оценки прогностической значимости THBS2 и микрососудов плотности (MVD) каждого образца. Анализ выживаемости проводили по методу Каплана-Мейера и модель пропорциональных рисков Кокса. Колонии формирования анализа, клеточной трубки анализ эндотелиальной образования, миграции клеток анализ и анализ апоптоза в MKN-45 и ЮГК-7901 клеточных линий были проведены, чтобы оценить влияние THBS2 на рака желудка в пробирке
.
Результаты <бр> 85,71% (12 из 14) желудочные раковые ткани, выраженные значительно ниже THBS2 в обеих мРНК и уровня белка, чем соответствующие нормальным контролем. Последовательно, ткани микрочипов (TMA) Результаты показали THBS2 уровни были также ингибируется в желудочном раковых тканей по сравнению с нормальным контролем. Кроме того, мы обнаружили, что пациенты с более высокими уровнями THBS2 были достоверно коррелирует с более благоприятным прогнозом в то время как уменьшилось THBS2 выражение было связано с более бедных гистологических сортов рака желудка. Кроме того, наши эксперименты в пробирке показали, что в дальнейшем избыточная экспрессия THBS2 может затруднять как скорость пролиферации и образование тюбик пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) в MKN-45 и СГК-7901 клеточных линий.
Заключение
Наши исследование предполагает THBS2 является аберрантно выражается в раке желудка и играет важную роль в прогрессировании рака, который может быть потенциальный прогноз предиктором рака желудка.
Ключевые слова
THBS2 рак желудка ангиогенеза прогностическим биомаркером Введение
рак желудка является высоко агрессивной и летальным злокачественности. В общей сложности 952,000 новых случаев рака желудка и 723,000 смертей, по оценкам, имели место в 2012 году, что составляет 6,8% от общего числа случаев и 8,8% от общего числа смертей. Кроме того, оба новых случаев заболевания и смерти от рака желудка в Китае, занимает первое во всем мире, что составляет более 40%, что в мире [1]. Поэтому большие проблемы поднимаются для исследований рака желудка.
Thrombospondins (THBSs) являются семейство многодоменном и matricellular Ca 2 + -связывающим гликопротеинов, секретируемые стромальных фибробластов, эндотелиальных клеток и клеток иммунной системы [2]. Они имеют по меньшей мере пять членов, кодируемые независимыми генами. Связываясь с многочисленными белками-мишенями, они участвуют в различных биологических процессах, таких как ангиогенез, подвижность клеток, апоптоз, организации цитоскелета, и служат в качестве взаимодействия платформ в внеклеточного матрикса (ECM) [3, 4]. Следует отметить, что THBS1 и THBS2 особенные в этой семье для их I типа повторами и оба они в основном показаны как ингибиторы ангиогенеза [5, 6], одна ключевая часть исследования рака [7-9]. Плотность микрососудов (MVD) является широко используемым параметром для оценки степени ангиогенеза в опухолях с CD34 является микрососудов производителем при раке желудка [10]. На основе предыдущих результатов [2], мы выдвинули гипотезу, в нашем исследовании, что это также может влиять на ангиогенез при раке желудка.
Кроме ангиогенеза, THBS2 Сообщалось, что взаимодействовать с несколькими рецепторами клеток, факторов роста и белков ЕСМ а также регулировать апоптоз, клеточную пролиферацию и адгезию [11]. В раковых исследований, все большее знаки внимания были сосредоточены на THBS2. Токунага и др. [12] установлено, что THBS2 выражено у пациентов с раком толстой кишки наблюдалось значительное снижение риска метастазов в печени и опухоли кровеносных сосудов по сравнению с пациентами, у которых опухоли были дефицит THBS2. Кроме того, Де Fraipont и др. [13] показали, что THBS2 достоверно коррелирует с клиническим состоянием и результатами, а также для большинства опухолей, существует обратная корреляция между уровнем экспрессии THBS2 и степени их злокачественности. Кроме того, THBS2 также играет ключевую роль при раке молочной железы [14], миеломы [15], злокачественной меланомы [16], рак предстательной железы [17] и легочной аденокарциномы [18, 19]. При раке желудка, другие члены THBSs, THBS1 [20] и THBS4 [21] может быть в качестве прогностического биомаркера или мощным маркером для диффузного типа желудка аденокарциномы. Тем не менее, подробная функция THBS2 при раке желудка и его последствия для клинической диагностики по-прежнему остается крайне низким. Таким образом, мы попытались раскрыть клиническую значимость THBS2 и его влияние на рак желудка.
Чтобы проверить нашу гипотезу вышеупомянутого, мы исследовали уровни экспрессии THBS2 в желудочном раковых тканях человека и соответствующих нормальных тканей, а затем исследовали возможные корреляции между этими выражение THBS2 и клинико-патологическими особенностями, клиническим прогнозом и подсчета МВД РФ у больных раком желудка. Кроме того, колонии формирования пробирного анализа образование эндотелиальных клеток трубки, миграцию клеток для анализа и анализа апоптоза проводили в MKN-45 и СГК-7901 клеточных линий, чтобы исследовать ин витро
эффект THBS2 в желудочном раковых клеток.

Результаты характеристики пациентов и клинические исходы
В настоящем исследовании мы зачислены 129 подходящих пациентов, состоящих из 101 мужчин и 28 женщин. Возраст пациентов колебался от 29 до 80 лет (у) с средним возрастом 61y. Все клинико-патологические характеристики приведены в таблице 1. Медиана общей выживаемости (ОВ) пациентов составил 57 месяцев, а значит, OS была 44,01 [95% доверительный интервал (ДИ) 39.78-49.24 месяцев] .table 1 Ассоциация среди клинико-патологическими переменных и THBS2 экспрессии и общей выживаемости больных раком желудка
переменные

Негативный

позитиве

общее количество

P

значение а Общая выживаемость ОС

Log-Rank Pb

HR (95% ДИ)

Нет. (%)
Нет. (%)
Возраст (лет )
0,112
0,743
&л; 61
24 (38,1) 39
(61,9)
63
1 (ссылка)
≥61
35 ( 53,0)
31 (47,0) 66

1.09 (0.67-1.77)
Пол
0,831
0,405
Мужчина
47 (46,5)
54 ( 53,5)
101
1 (ссылка)
Женский
12 (42,9) 16
(57,1)
28
0.76 (0.40-1.45)
гистологического класса
0,005
0,011
Ну и умеренные
24 (33,8) 47
(66,2)
71
1 (ссылка)
бедных и других
35 (60,3 )
23 (39,7) 58

1.89 (1.16-3.09)
опухолевого местоположение
0,419
0,204
Верхняя
27 (40,3) 40
( 59,7)
67
1 (ссылка)
Средний
15 (53,6) 13
(46,4)
28
1.66 (0.86-3.18)
<бр Нижняя> 17 (50,0) 17
(50,0)
34
1.90 (0.90-4.01)
Глубина вторжения
0,271
0.001
T1-T2
9 ( 34,6)
17 (65,4)
26
1 (ссылка)
T3-T4
50 (48,5) 53
(51,5)
103
11.60 (2.83 -47,45)
лимфоузлов метастаз
0,454
< 0,001
Отсутствует
17 (40,5) 25
(59,5)
42
1 (ссылка) <бр> Present
42 (48,3) 45
(51,7)
87
5.16 (2.46-10.84)
TNM стадии
0,283
< 0,001
I-II
21 (39,6) 32
(60,4)
53
1 (ссылка)
III-IV
38 (50,0) 38
(50,0)
76
7,14 (3.52-14.49)
Жирный значение является статистически значимым при P &
ЛТ; 0,05, отношение рисков HR.
A, P
значение клинико-патологическими переменных и THBS2 выражение.
B, P
значение связи между клинико-патологическими переменных и общей выживаемости больных раком желудка.
THBS2 подавляется в желудочном
рака для того чтобы определить уровни экспрессии THBS2 в раке желудка, мы сначала оценивали уровни экспрессии мРНК THBS2
в раке желудка с помощью количественной реальном времени во второй группе. Эта когорта образцов, указанных в методах, включал 14 человека рак желудка и соответствующие нормальные ткани. Как показано на рисунке 1А, THBS2
уровни были значительно ниже у 85,7% (12 из 14) желудочных раковых тканей, чем его нормальным контролем, в то время как остальные две пары образцов выставлены противоположное. Затем мы обнаружили уровни экспрессии белка согласно THBS2 через вестерн-блоттинга в той же самой группе. Как показывают на Figure1B и С, мы наблюдали, что уровни экспрессии белка THBS2 уменьшились в 85,7% (12 из 14) образцов опухоли по сравнению с соответствующим контролем, в то время как образец 5 и 11 показаны в обратном направлении. Чтобы подтвердить этот вывод, мы дополнительно провели микрочипов ткани (АПМ) и оценивали уровни экспрессии белка согласно THBS2 по шкале иммунореактивности (IRS) каждого образца. Мы нашли THBS2 белки в основном экспрессируется в цитоплазме желудочных клеток (фиг.2А), и в соответствии с результатами вестерн-блоттинга, уровни THBS2 были значительно ингибируется в желудочном раковых тканей по сравнению с нормальным контролем (Фигура 2В, P &ЛТ; 0,05). Взятые вместе, наши результаты показывают, что THBS2 подавляется при раке желудка в обеих мРНК и уровня белка. Рисунок 1 мРНК и уровень экспрессии белка THBS2 в 14 желудочного раковых тканей и соответствующая нормальная ткань. (А) выражение Относительная мРНК THBS2 была обнаружена количественная ПЦР в реальном времени. Экспрессия нормальных тканей нормализовали до 1,0, как указано. Результаты (Б) денситометрии Анализ полос THBS2 были нормированы на GAPDH с использованием изображения J. Экспрессия нормальных тканей нормализовали до 1,0, как указано. (C) Относительная экспрессия белка THBS2 оценивали с помощью Вестерн-блот-анализа.
Рисунок 2 иммуногистохимического анализа THBS2, CD34. (A) Типичные изображения THBS2 и экспрессии CD34: N1, N2, N3, N4, нормальная ткань желудка (N); М1, М2, М3, М4, умеренно дифференцированной (М); Р1, Р2, Р3, Р4, плохо дифференцированные (Р). Увеличение: 100 × (N1, M1, P1, N 3, M3, P3), 200 × (Н4, M4, P4) и 400 × (N2, M2, P2). (B) Сравнение THBS2 экспрессии рака желудка (n = 129) и нормальных тканей желудка (п = 24) в районе аэродрома. Уровень экспрессии THBS2 представлены как среднее ± SEM. (C) Сравнение МВД РФ в THBS2-положительной желудка группы рака (п = 70) и THBS2-отрицательной группы рака желудка (п = 59). Точки представляют собой MVD каждого образца. Значения являются средние значения ± SEM. Уровни экспрессии
THBS2 обратны коррелируют с гистологическим сортами рака желудка
для дальнейшего уточнения клинической значимости THBS2, мы проанализировали связь между экспрессией THBS2 белка и клинических признаков, включая возраст, пол, гистологические класс, местоположение опухоли, глубина инвазии, метастазов в лимфатических узлах и TNM стадия у больных раком желудка в THBS2-положительных и отрицательных групп. Как показано в таблице 1, мы обнаружили значительную обратную корреляцию с гистологическим сортами рака желудка (Р
≪ 0,01). Гистологические сорта пациентов в THBS2-положительной группе, более вероятно, будет хорошо, и умеренный, в то время как пациенты в THBS2-отрицательной группе, как правило, бедные и другие. Тем не менее, мы не обнаружили никакого значения статистически между уровнями экспрессии THBS2 и других клинических параметров. В совокупности наши результаты показывают, что THBS2 обратная коррелирует с гистологической степени рака желудка. Уровни экспрессии
THBS2 обратны коррелируют с МВД РФ в рак желудка
Предыдущие отчеты подразумеваемые THBS2 может регулировать ангиогенеза опухоли [6], но никто не сообщалось при раке желудка. Таким образом, мы спросили, существуют ли какие-либо корреляции между МВД РФ и уровней экспрессии THBS2, а также другие клинические показатели в наших клинических образцах. MVD в 129 желудочных образцов рака в диапазоне от 0 до 120, с медианой 40 и среднее из 48.12 ± 28.99 (среднее ± стандартное отклонение) в соответствии с иммунореактивности CD34 в нашем TMA. Как показано на фиг.2С, THBS2 значимо коррелировали с MVD. MVD в THBS2-отрицательной группе была значительно выше, чем в THBS2-положительной группе (Р
&л; 0,001). Тем не менее, мы не могли наблюдать какие-либо статистические различия между МВД РФ и других функций, включая клиникопатологическими клиническим прогнозом в наших образцах (данные не показаны). В заключение, наши открытия показывают, что THBS2 обратная коррелирует с МВД РФ при раке желудка.
THBS2 значительно связан с клиническим прогнозом у больных раком желудка
исследовать взаимосвязь между экспрессией THBS2 и клиническим прогнозом у больных раком желудка, мы провели анализ выживаемости с помощью метода унивариантного и многовариантного модели пропорциональных опасности регрессии Кокса. Как показано в таблице 1, мы нашли гистологическую оценку, глубину инвазии, метастазов в лимфатических узлах и ТНМ этапе были статистически значимыми факторами для ОС в однофакторного анализа. Однако, поскольку стадия TNM также содержит информацию о глубине инвазии и метастазов в лимфатических узлах, мы дополнительно проводили многофакторный анализ выживаемости с поправкой на гистологическое сорта и TNM стадии. Мы заметили, что TNM стадия (P &
л; 0,001) и экспрессия THBS2 (P &
л; 0,01) оба были независимыми прогностическими факторами для оценки результатов лечения пациентов. Высшая стадия TNM является фактором риска для более OS [P
&л; 0,001, HR (относительный риск) = 7,23, 95% ДИ 3.55-14.69) и повышенная экспрессия THBS2 была еще благоприятным фактором для более OS (P
&л; 0,01, ОР = 0,51, 95% ДИ 0.31-0.85). Кроме того, анализ выживаемости Каплана-Мейера еще раз подтвердил, что экспрессия THBS2 значимо коррелировали с клиническими результатами (рис 3, P < 0,01, п = 129). Пациенты с выражением ниже THBS2 отображается значительно короче ОС [медиана 36 месяцев, среднее 40,07 ± 3,65 (среднее ± SE) месяцев], в то время как пациенты, с выражением выше THBS2 показали благоприятный прогноз [медиана 59 месяцев, среднее 53,70 ± 2,95 (среднее ± SE ) месяцы]. Вместе наши результаты демонстрируют THBS2 в значительной степени связано с клиническим прогнозом у больных раком желудка, что может стать прогностическим маркером для рака желудка. Рисунок 3 выживаемости Каплана-Мейера анализа с помощью тест Log-Rank для общей выживаемости (OS). Каплан-Майера анализ корреляций между различными уровнями экспрессии THBS2 и OS в 129 больных раком желудка.
Гиперэкспрессия THBS2 ингибирует рост клеток рака желудка в пробирке

Поскольку THBS2 значительно подавлялась в желудочном рак, мы сделать вывод, что THBS2 может подавлять рост, стимулирует апоптоз и повысить миграционную способность клеток рака желудка. Чтобы проверить нашу гипотезу, мы сначала построили один вектор Lentiviral стабильных экспресс THBS2 транскриптов в желудочном линиях раковых клеток. Измененная экспрессия THBS2 в 293 Т-клеток, была подтверждена с помощью Вестерн-блот-анализом (фиг.4А). Затем мы выбрали MKN-45 и СГК-7901 клеточных линий для нашего экстракорпорального
исследования в, так как уровни экспрессии мРНК THBS2 были ниже, чем другие (данные не показаны). Затем мы выполнили анализ образования колоний, чтобы оценить влияние THBS2 на рост MKN-45 и ЮГК-7901 клеток. Как показано на фиг.4В, мы обнаружили клетки с избыточной экспрессией THBS2 образуется значительно меньшее количество колоний на мягком агаре по сравнению с теми, борьбы с переносчиком-инфицированных клеток (Р
≪ 0,01 для MKN-45 клеток и P
&ЛТ; 0,001 SGC-7901-клетки, соответственно). Кроме того, мы исследовали уровни апоптоза между двумя группами в обеих клеточных линиях и обнаружил, что способствовало THBS2 апоптоз в SGC-7901 клеток (рис 4F), но не в клетках MKN-45 (дополнительный файл 1: Рисунок S1a). И не было никаких существенных различий между двумя группами в SGC-7901 и MKN-45 клеточных линий в миграции клеток в соответствии с Transwell анализов (дополнительный файл 1: Рисунок s1b и С). Таким образом, наши данные подтверждают, что THBS2 препятствует росту клеток рака желудка в пробирке, возможно, путем регуляции апоптоза. Рисунок 4 Сверхэкспрессия THBS2 ингибирует пролиферацию клеток рака желудка, подавляли ангиогенез рака желудка, а также содействовал апоптоз в клеточной линии SGC-7901 в пробирке. (A) Вестерн-блот анализ Флаг в 293 Т-клеток с THBS2 оверэкспрессии. (B) анализ числа колоний для MKN-45 и ЮГК-7901 клеток с THBS2 избыточной экспрессии и отрицательного контроля. Значения являются средние значения ± SD из трех независимых экспериментов. (C) Изображения анализа образования колоний. (D) AngiogenicIndexCh1 анализ анализа формирования эндотелиальных клеток трубки. Значения являются средние значения ± SD. (E) Изображения анализа формирования эндотелиальных клеток трубки. (F) Анализ апоптоза в клеточной линии MKN-45. Значения являются средние значения ± SD.
THBS2 подавляет ангиогенез рак желудка в пробирке

THBS2 известен как ингибитор ангиогенеза [2]. Чтобы предоставить доказательства о THBS2 регулирует ангиогенный фенотип рака желудка, анализы формирования эндотелиальных клеток трубки были выполнены. Как показано на рисунке 4д и D, в обеих клеточных линиях MKN-45 и СГК-7901, Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) культивированные со средой из THBS2-избыточной экспрессии клеток рака желудка показали значительно более низкие AngiogenicIndexCh1, чем отрицательный контроль (p
&л; 0,05 для MKN-45 клеток и P
&ЛТ; 0,001 для СГК-7901 клеток, соответственно). В совокупности, из полученных результатов следует, что THBS2 подавляет ангиогенез клеток рака желудка в пробирке
.
Обсуждение
THBS2 известен как естественный сильным ингибитором ангиогенеза и модулятора ремоделирования процесса [22, 23]. Тем не менее, ни один из прежних исследований не обсуждал роль THBS2 и его клиническое значение при раке желудка.
Во-первых, мы обнаружили, что уровни мРНК и экспрессии белка из THBS2 были вниз регулируется в большинстве образцов. Тем не менее, один предыдущие исследования сообщили, уровни экспрессии мРНК в THBS2 рака желудка были выше, чем нормальный контроль [24]. Учитывая ограниченный размер выборки в данном исследовании, в который были включены только 6 образцов тканей, можно эту разницу из-за опухоли гетерогенности для двух пар нашей второй когорте было также показывают одни и те же закономерности. Тем не менее, наш последующий результат ТМА, больше по размеру образца, согласуется с результатом из второй когорты. Взятые вместе, мы считали, что THBS2 был более вероятно, будет подавлен в клетку рака желудка по сравнению с нормальной слизистой оболочкой.
Более того, мы также заметили, что относительное выражение образцов выставлены по-разному в мРНК, так и на уровне белка. Не имея достаточных доказательств, мы делаем вывод, что функция THBS2 внутри клеток рака желудка может регулироваться некоторых внутриклеточных сигнальных факторов вверх по течению, белка убихитинизация и другие возможные способами, которые могут повлиять на уровни протеина THBS2 и фенотипы в желудочном раковых клеток. И далее акцент может быть сделан на этом интересном явлении. Тем не менее, большинство образцов из нашей второй когорте отображаются те же паттерны экспрессии между мРНК и уровня белка.
Во-вторых, наши данные показали, что THBS2 может способствовать апоптозу только в клетках SGC-7901, но не в клетках MKN-45. Бывшие исследования показали, что N-концевой фрагмент рекомбинантного THBS2 может активировать CD36-опосредованный апоптоз эндотелиальных клеток [14], а сочетание CD36 и THBS2 может активировать сигнальный путь каспазы [25]. Таким образом, мы предположили, что разнородность двух клеточных линий, используемых в нашем исследовании, как и дифференцированные выражения CD36, может отчасти быть причиной различных уровней апоптоза, индуцированного THBS2, в котором содержится призыв для дальнейших исследований.
В-третьих, наши результаты показали, что THBS2 может подавлять ангиогенез рака желудка. Известно, что распространение опухоли, инвазии или метастазирования зависят от ангиогенеза [26]. И на основе свидетельства поддерживают наше открытие и указывают, что возможные механизмы, которые THBS2 ингибирует ангиогенез: 1) апоптоз-независимым образом за счет индукции эндотелиальных клеток апоптоз, клеточный цикл ареста и снижение миграции эндотелиальных клеток [27], 2) зависит от сигнализации каспазы путь активируется CD36 [28]. 3) функционировать в качестве ко-рецепторов для связанного белка с низким рецепторов липопротеинов низкой плотности (LRP1), что может очистить комплексы THBS2 с матриксных металлопротеиназ-2, -9 или фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) от околоклеточном среды мезенхимных клеток [ ,,,0],29-32].
Наконец, МВД РФ является одним из наиболее часто используемых параметров для оценки степени ангиогенеза опухоли и предыдущих исследований было установлено, МВД РФ может быть независимым прогностическим фактором при раке желудка и других опухолей [33-35]. В нашем исследовании мы обнаружили МВД РФ было достоверно коррелирует с экспрессией белка THBS2 (P &
л; 0,001) при раке желудка, но не с клиническими признаками и клиническим прогнозом. Эти результаты показали, что THBS2 может повлиять на ангиогенез в рак желудка, тем не менее, из-за отсутствия корреляции между МВД РФ и прогноза в наших образцах, мы подозревали, что более высокое выражение THBS2 указывает на более длительный выживание не только за счет ингибирования ангиогенеза рака желудка, другие механизмы, такие как регулирующие ECM переделки [23] и скорость пролиферации клеток рака желудка также могут быть причины, требующие дальнейшего исследования для изучения.
в совокупности наши результаты акцент на важной роли THBS2 в прогностические значимостей, а также пролиферации опухоли и ангиогенез в желудочном рак. Эти данные свидетельствуют о том THBS2 может быть важным прогностическим маркером для больных раком желудка. Кроме того, на основе эффектов THBS2 на развитие опухолей и ангиогенеза, наши исследования дают ценные подсказки для клинической практики с целью разработки молекулярных ингибирующие терапии с использованием целевых показателей, выведенные из биологических знаний, предоставленной подписью THBS2.
Заключение
Наше исследование подарки первая линия доказательств того, что выражение THBS2 подавляется на обоих мРНК и уровня белка и снижение THBS2 выражение связано с плохим гистологической степени рака желудка. Важно отметить, что избыточная экспрессия THBS2 имеет значительную корреляцию с благоприятным прогнозом у больных раком желудка. С другой стороны, THBS2 влияет прогноз при раке желудка может не только через регулирующий ангиогенез, но некоторыми другими способами, как регулирующий ЕСМ переделки и ингибирования пролиферации клеток рака желудка. Эти данные позволяют предположить, что THBS2 может быть потенциально важная роль в патогенезе и прогрессии рака желудка. Мы подтверждаем, что, с постепенным углубленных исследований THBS2, это может быть полезным и перспективным простой биомаркером для прогнозирования клинического исхода для больных раком желудка.
Методы
Пациенты и образцы ткани
В настоящем исследовании мы включены две когорты образцов. Первая группа содержала 129 фиксированных формалином, залитых парафином рака желудка человека и 24 случайно выбранных нормальных тканей желудка. Они были последовательно набраны в период с декабря 2006 года по май 2008 года от кафедры общей хирургии, Первый филиал больницы Аньхой медицинского университета, Хэфэй, Китай. Эти образцы были включены в TMA для иммуногистохимического окрашивания. Гистологические особенности этих образцов были подтверждены патологоанатомов. Патологический TNM постановка была оценена в соответствии с критериями Американского Объединенного комитета по вопросам рака (AJCC) 2010. Вторая когорта состояла из 14 больных раком желудка, которые подверглись резекции опухоли терапии на восьмой кафедры общей хирургии, первый филиал больницы Аньхой медицинского университета им. Свежее желудка раковой ткани и соответствующую нормальную слизистую оболочку (не менее 5 см, удаленные от края опухоли) сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С до использования для количественной ПЦР в реальном времени и Вестерн-блот-анализа. Пациенты в обеих группах не получали предоперационной химиотерапии и /или радиации. Письменное информированное согласие было предоставлено всем участникам. Все образцы были обработаны анонимно в соответствии с этическими стандартами. Данное исследование было проведено с одобрения Этического Комитета по рассмотрению больницы.
Экстракции РНК и количественного ПЦР в реальном времени
Суммарную РНК экстрагировали из второй когорты с использованием тризола реагента (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. кДНК синтезировали с помощью случайных праймеров и обратной транскриптазы Superscript II (Toyobo, Осака, Япония). Праймеры, используемые для амплификации для THBS2: прямой праймер 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'и обратный праймер 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH), амплифицировали в том же д-PCR в качестве внутреннего контроля с использованием праймеров: прямой праймер 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'и обратный праймер 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. Реакция работала на системе ABI 7900HT последовательности обнаружения (Applied Biosystems, CA, USA) в присутствии SYBR-зеленый краситель (Toyobo, Осака, Япония). Условием реакции была программа денатурация (95 ° С в течение 5 мин), а также программы амплификации и количественного определения в течение 40 циклов (95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 45 с). Каждый образец был испытан в трехкратном повторе, а анализ кривой плавления каждого образца используется для проверки специфичности амплификации. Уровень экспрессии определяли как отношение между THBS2 и GAPDH внутреннего контроля в количествах мРНК, вычисленных сравнительным методом КТ. Экстракции
Протеин и Вестерн-блот
Общий белок экстрагировали из 14 замороженных рака желудка и его соответствующее нормальное слизистая ткань льдом в радио иммунопреципитации анализа лизирующего буфера (РПСО; Beyotime институт биотехнологии, Цзянсу, Китай), и измеряется с использованием набора для анализа белка (BCA Beyotime Институт биотехнологии, Цзянсу, Китай). Лизат центрифугировали при 12000 оборотах в минуту в течение 5 минут, и супернатант нагревали при 100 ° С в течение 5 минут. Тогда эквивалентные белки из каждой пары образцов были разделены на додецилсульфата электрофореза в полиакриламидном геле с 8% натрия и electrotransferred к поливинилиденфторида мембраны (Millipore, Billerica, MA). После того, как блокированный TBST, содержащий 5% обезжиренным молоком в при комнатной температуре в течение одного часа, мембраны смыл с анти-антителом THBS2 (1: 1500; Novus) и анти-Flag (1: 3000; Sigma). Далее следуют мембраны инкубации с пероксидазой хрена, меченными анти-кролика и анти-мышиного IgG в качестве вторичного антитела (Beyotime Институт биотехнологии). Анти-GAPDH-антителом (1: 4000; Aogma) использовали в качестве контрольного антитела нагрузка. Связанные антитела выявляли с методом усиленной хемилюминесценции.
Immunohistochemistry и ТМА анализ
рак желудка и желудочных нормальных образцов слизистой оболочки были формалином фиксированной, парафин и были использованы для построения тканей ТМА. H &Amp; E-витражные стекла были экранированы, чтобы определить оптимальную intratumoural ткани для анализа. срезы толщиной 4 мкм обжигали при температуре 60 ° С в течение 1 ч, deparaffinised с ксилолов, и регидратации в градуированных этанола в дистиллированной воде. Антиген поиска было достигнуто с размещением секций с цитратного буфера в рисовом пароходе в течение 30 минут. Утолить эндогенной активности пероксидазы срезы обрабатывали 3% H <суб> 2O <подразделам> 2 в метаноле. Затем мы использовали 1% бычьего сывороточного альбумина, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Анти-THBS2 антитела (Novus, 1: 2000) и анти-CD34 (Abcam, 1: 250) инкубировали с секциями при 37 ° С в течение ночи, а затем инкубируют с пероксидазой хрена, меченными анти-кроличьего IgG в качестве вторичного антитела (Life технологии). В конце концов, слайды были помещены на линии инструмента autostainer и приступить к окрашиванию. Для отрицательных контролей, первичные антитела были заменены нормальной кроличьей сыворотки. Окончательное эффективное иммуногистохимического окрашивания оценивали с помощью двух независимых патологи, не зная, информацию о больных, в зависимости от интенсивности окрашивания и степень окрашивания. Срезы тканей оценивали как процент окрашенных цитоплазмы в клетках рака желудка железы и нормальных клеток железы (0 очков для каких-либо клеток, окрашенных, 1 балл за &л; 25%, 2 балла за 25-75%, и 3 балла на > 75 % клеток окрашенных), и интенсивность окрашивания иммунореактивности оценивали по шкале от 0 до 3. иммунореактивности оценка (IRS), был результатом умножения обоих параметров. Образцы были забиты следующим образом: отрицательный (IRS = 0 ~ 2), положительный (IRS = 3 ~ 9)
MVD подсчета
иммуногистохимическое окрашивание CD34 и общепринятых критериев в исполнении Weidner и др.. [36] использовались для MVD подсчета. Любые окрашивали эндотелиальные клетки или кластеры эндотелиальных клеток были отделены от соседних микрососудов, а толщина каждой стенки сосуда более 2,75 мкм, будут исключены. Три отдельные секции, содержащие горячие точки (где окрашивали наибольшее количество дискретных микрососудов) в каждом образце ТМА были выбраны в малых увеличениях (100 ×) под световым микроскопом (Leica, Германия). Впоследствии микрососудов подсчитывали в каждой секции в большом увеличении (200 ×).

• Функции ЛНК РНК HOTAIR как конкурирующего эндогенной РНК, чтобы регулировать экспрессию HER2 на обтирание MIR-331-3p в…
• Протеомный изменения в желудочной аденокарциномы от японских пациентов