La régulation du Thrombospondin2 prédit un mauvais pronostic chez les patients atteints cancer

gastrique Down régulation de Thrombospondin2 prédit un mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
thrombospondines (THBSs) sont une famille de multidomaine et sécrétée Ca matricellular 2 + qui a glycoprotéines liant le au moins cinq membres codées par des gènes indépendants. En tant que membre de la famille THBSs, Thrombospondin2 (THBS2) a été signalé pour réguler l'angiogenèse. Néanmoins, les fonctions et la signification clinique de THBS2 reste encore incertain dans le cancer gastrique.
Méthodes
Les niveaux d'ARNm et THBS2 expression de la protéine ont été évalués dans 14 paires de spécimens de cancer de l'estomac et des muqueuses normales correspondantes en utilisant une PCR quantitative en temps réel et l'analyse western blot. Immunohistochimie de THBS2 et CD34 sur les microréseaux de tissus en population composé de 129 cas de cancer gastrique ont été utilisés pour évaluer l'importance pronostique de THBS2 et microvaisseaux densité (MVD) de chaque échantillon. Les analyses de survie ont été réalisées par la méthode de Kaplan-Meier et modèle à risques proportionnels de Cox. Colony essai de formation, endothéliale essai de formation de tube de cellules, le dosage de la migration cellulaire et l'analyse de l'apoptose dans MKN-45 et des lignées de cellules SGC-7901 ont été réalisées pour évaluer les effets de THBS2 sur le cancer gastrique in vitro.
: Résultats
85,71% (12 sur 14) des tissus de cancer gastrique exprimées THBS2 remarquablement faible dans les deux niveaux de protéines que les contrôles normaux correspondants ARNm et. Systématiquement, puces à ADN tissulaire (TMA) ont montré des niveaux THBS2 ont également été inhibée dans des tissus de cancer gastrique par rapport aux témoins normaux. De plus, nous avons observé que les patients avec des niveaux plus élevés de THBS2 étaient significativement corrélés avec un pronostic plus favorable alors diminué THBS2 expression étaient associés à des pauvres grades histologiques de cancer gastrique. En outre, nos expériences in vitro ont démontré en outre que la surexpression de THBS2 pourrait faire obstacle à la fois le taux de prolifération et la formation de tubes de cellules endotheliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) dans MKN-45 et CGS-7901 lignées cellulaires.
Conclusion
Notre étude suggère THBS2 est exprimé de manière aberrante dans le cancer gastrique et joue un rôle crucial dans la progression du cancer, qui peut être un facteur prédictif de pronostic potentiel du cancer de l'estomac. Le cancer gastrique
Mots-clés
THBS2 cancer gastrique angiogenèse Prognostic biomarqueur introduction est un très agressive et la malignité mortelle. Un total de 952,000 nouveaux cas de cancer de l'estomac et 723.000 décès ont été estimés avoir eu lieu en 2012, ce qui représente 6,8% du total des cas et 8,8% du total des décès. De plus, deux nouveaux cas et des décès de cancer de l'estomac en Chine, classé 1er au niveau mondial, ce qui représente plus de 40% que dans le monde [1]. Par conséquent, de grandes préoccupations sont soulevées pour les recherches de cancer gastrique
. Thrombospondines (THBSs) sont une famille de multidomaine et matricellular Ca 2 + glycoprotéines sécrétées par liant le fibroblastes stromales, cellules endothéliales et des cellules immunitaires [2]. Ils ont au moins cinq membres codées par des gènes indépendants. En se liant avec de nombreuses protéines cibles, ils participent à divers processus biologiques tels que l'angiogenèse, la motilité cellulaire, l'apoptose, l'organisation du cytosquelette, et servent de plates-formes d'interaction dans la matrice extracellulaire (ECM) [3, 4]. Notamment, THBS1 et THBS2 sont spéciaux dans cette famille pour leurs répétitions de type I et les deux d'entre eux sont principalement représentés par des inhibiteurs de l'angiogenèse [5, 6], un élément clé de la recherche sur le cancer [7-9]. la densité de microvaisseaux (MVD) est un paramètre largement utilisé pour estimer le degré d'angiogenèse dans des tumeurs avec des cellules CD34 étant le fabricant de microvaisseaux dans le cancer gastrique [10]. Sur la base des résultats précédents [2], nous avons proposé une hypothèse dans notre étude que cela pourrait également affecter l'angiogenèse dans le cancer gastrique.
Outre l'angiogenèse, THBS2 a été signalé à interagir avec plusieurs récepteurs cellulaires, des facteurs de croissance et des protéines ECM ainsi que de réguler l'apoptose, la prolifération cellulaire et l'adhérence [11]. Dans les recherches sur le cancer, les attentions croissantes ont été concentrés sur THBS2. Tokunaga et al. [12] ont constaté que THBS2 exprimé chez les patients atteints d'un cancer du côlon présentait un risque plus faible de métastases hépatiques et la vascularisation tumorale significative par rapport aux patients dont les tumeurs étaient carence THBS2. En outre, De Fraipont et al. [13] ont démontré que THBS2 était significativement corrélée avec l'état clinique et des résultats, ainsi que pour la plupart des tumeurs, il y avait une corrélation inverse entre le niveau d'expression de THBS2 et le degré de leur tumeur maligne. En outre, THBS2 a également joué un rôle clé dans le cancer du sein [14], le myélome [15], le mélanome malin [16], le cancer de la prostate [17] et l'adénocarcinome pulmonaire [18, 19]. Dans le cancer gastrique, d'autres membres de THBSs, THBS1 [20] et THBS4 [21] peuvent être en tant que biomarqueur pronostique ou un marqueur puissant pour les adénocarcinomes gastriques de type diffus. Cependant, la fonction détaillée de THBS2 dans le cancer gastrique et ses implications pour diagnostic clinique restent lamentables. Ainsi, nous avons tenté de dévoiler la signification clinique de THBS2 et son effet dans le cancer gastrique.
Pour vérifier notre hypothèse mentionnée ci-dessus, nous avons examiné les niveaux d'expression THBS2 dans les tissus de cancer gastrique et tissus humains et normaux correspondants, puis exploré les corrélations possibles entre le expression de THBS2 et les caractéristiques clinico, le pronostic clinique et le comptage de MVD chez les patients atteints d'un cancer gastrique. En outre, une colonie essai de formation, endothélial essai de formation de tubes de cellules, le dosage de la migration cellulaire et l'analyse de l'apoptose ont été réalisées dans MKN-45 et les lignées cellulaires CGS-7901 pour explorer in vitro
effet dans des THBS2 dans les cellules cancéreuses gastriques.
les caractéristiques des patients de résultats et les résultats cliniques
Dans la présente étude, nous avons inscrit 129 patients éligibles, qui se composait de 101 hommes et 28 femmes. L'âge des patients variait de 29 à 80 ans (y) avec un âge médian de 61y. Toutes les caractéristiques clinico sont résumées dans le tableau 1. La médiane de survie globale (OS) des patients était de 57 mois, et la moyenne OS était 44.01 [95% intervalle de confiance (IC) 39.78-49.24 mois] .Tableau 1 Association des variables clinicopathologiques et THBS2 expression et la survie globale des patients atteints de cancer gastrique Variables de
Negative
P positif
total No. valeura
Globalement survie OS
log-rank
HR de Pb (IC à 95%)
Non. (%)
Non. (%)
âge (y )
0,112
0,743
< 61
24 (38,1)
39 (61,9) 63

1 (référence)
≥61
35 ( 53,0)
31 (47,0) 66

1,09 (0,67 à 1,77)
Sexe
0,831
0,405
Homme
47 (46,5) 54
( 53,5)
101
1 (référence)
12 (42,9)
16 (57,1) 28

0,76 (0,40 à 1,45)
Le grade histologique de Femme
0,005
0,011
bien et modéré
24 (33,8)
47 (66,2) 71

1 (référence)
pauvre et bien d'autres 35 (60,3 )
23 (39,7)
58
1,89 (1,16 à 3,09)
emplacement de la tumeur
0,419
0,204
Upper
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (référence)
Moyen
15 (53,6)
13 (46,4) 28

1,66 (0,86 à 3,18)
Lower
17 (50,0)
17 (50,0) 34

1,90 (0,90 à 4,01)
Profondeur de l'invasion
0,271
0,001
T1-T2
9 ( 34.6)
17 (65,4) 26

1 (référence)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11,60 (2,83 -47,45)
métastases ganglionnaires
0,454
< 0,001
Absent
17 (40,5)
25 (59,5) 42

1 (référence)

Présent 42 (48.3)
45 (51,7) 87

5,16 (2,46 à 10,84)
stade TNM
0,283
< 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4) 53

1 (référence)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52 à 14,49)
valeur Gras est statistiquement significative à P
< 0,05, rapport des risques RH.
A, P la valeur des variables clinicopathologiques et THBS2 expression.
B, P la valeur d'association entre les variables clinicopathologiques et la survie globale des patients atteints de cancer gastrique.
THBS2 est régulée à la baisse dans le cancer gastrique
afin de déterminer les niveaux d'expression de THBS2 dans le cancer gastrique, nous avons d'abord évalué les niveaux de THBS2
d'expression de l'ARNm dans le cancer gastrique par quantitative en temps réel dans la deuxième cohorte. Cette cohorte d'échantillons, mentionné dans les méthodes, inclus 14 cancer de l'estomac humain et les tissus normaux correspondants. Comme cela est représenté sur la figure 1A, les niveaux de THBS2 étaient nettement inférieurs à 85,7% (12 sur 14) des tissus de cancer gastrique que les contrôles normaux, tandis que les deux paires restantes des échantillons exposés à l'opposé. Ensuite, nous avons détecté les niveaux de THBS2 d'expression de protéines par western blot dans la même cohorte. Comme le montrent dans Figure1B et C, nous avons observé que THBS2 niveaux d'expression de protéines ont diminué chez 85,7% (12 sur 14) des échantillons de tumeurs par rapport à son contrôle correspondant, tandis que l'échantillon 5 et 11 affichés inversement. Pour confirmer cette constatation, nous avons encore réalisé un microréseau tissulaire (TMA) et évalué les niveaux de THBS2 d'expression de protéines en fonction du score de immunoréactivité (IRS) de chaque échantillon. Nous avons trouvé que THBS2 protéines sont principalement exprimés dans les cytoplasmes des cellules gastriques (figure 2A), et en conformité avec les résultats du transfert de Western, les niveaux de THBS2 ont inhibé de façon significative dans les tissus de cancer gastrique par rapport aux témoins normaux (figure 2B, P <0,05). Pris ensemble, nos résultats démontrent que THBS2 est régulée à la baisse dans le cancer gastrique dans les deux niveaux de protéine et l'ARNm. La figure 1 ARNm et la protéine niveau d'expression de THBS2 dans 14 les tissus du cancer de l'estomac et le tissu normal correspondant. (A) L'expression d'ARNm relative de THBS2 a été détectée par PCR quantitative en temps réel. Expression des tissus normaux ont été normalisés à 1,0 comme indiqué. les résultats d'analyse (B) de densitométrie des bandes THBS2 ont été normalisées à la GAPDH en utilisant l'image J. Expression des tissus normaux ont été normalisées à 1,0, comme indiqué. (C) l'expression protéique relative de THBS2 a été estimée par dosage Western blot.
Figure 2 L'analyse immunohistochimique de THBS2, CD34. (A) Des images représentatives de THBS2 et l'expression de CD34: N1, N2, N3, N4, le tissu gastrique normale (N); M1, M2, M3, M4, modérément différencié (M); P1, P2, P3, P4, peu différencié (P). Grossissement: 100 x (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) et 400 × (N2, M2, P2). (B) Comparaison de l'expression THBS2 du cancer gastrique (n = 129) et les tissus gastriques normaux (n = 24) dans la TMA. Le niveau d'expression de THBS2 présenté sous forme de moyenne ± SEM. (C) Comparaison des MVD dans le groupe de cancer gastrique THBS2 positif groupe de cancer gastrique (n = 70) et THBS2 négatif (n = 59). Les points représentent MVD de chaque échantillon. Les valeurs sont des moyennes ± SEM. Les niveaux d'expression
de THBS2 sont inverse corrélées avec des notes histologiques de cancer gastrique
Pour clarifier davantage l'importance clinique de THBS2, nous avons analysé la relation entre l'expression de la protéine THBS2 et les caractéristiques cliniques, y compris l'âge, le sexe, histologiques qualité, l'emplacement de la tumeur, la profondeur de l'invasion, métastase ganglionnaire et le stade TNM des patients atteints de cancer gastrique dans les groupes THBS2-positifs et négatifs. Comme on le voit dans le tableau 1, nous avons trouvé une corrélation inverse significative avec les grades histologiques de cancer gastrique (P
< 0,01). Les grades histologiques de patients dans le groupe THBS2 positifs étaient plus susceptibles d'être bien et modérée, alors que les patients du groupe THBS2 négatif ont tendance à être pauvres et d'autres. Cependant, nous avons échoué à découvrir une signification statistique entre les niveaux d'expression de THBS2 et d'autres paramètres cliniques. Collectivement, nos résultats suggèrent que THBS2 est inverse en corrélation avec le grade histologique du cancer gastrique. Les niveaux d'expression
de THBS2 sont inverse corrélés avec MVD dans le cancer gastrique
rapports précédents THBS2 implicite pourraient réguler l'angiogenèse tumorale [6], mais aucun n'a été signalé dans le cancer gastrique. Par conséquent, nous avons demandé s'il y avait des corrélations entre les niveaux d'expression THBS2 MVD et ainsi que d'autres paramètres cliniques dans nos échantillons cliniques. MVD dans 129 échantillons de cancer gastrique variait de 0 à 120, avec la médiane 40 et la moyenne de 48,12 ± 28,99 (moyenne ± écart-type) en fonction de la réactivité immunologique du CD34 dans notre TMA. Comme on le voit sur la figure 2C, THBS2 était significativement corrélée avec MVD. Le MVD dans le groupe THBS2 négatif était beaucoup plus élevé que dans le groupe positif THBS2 (P
< 0,001). Cependant, nous ne pouvions pas observer les différences statistiques entre MVD et d'autres caractéristiques clinicopathologiques dont le pronostic clinique dans nos échantillons (données non présentées). En conclusion, nos découvertes démontrent que THBS2 est inverse en corrélation avec MVD dans le cancer gastrique.
THBS2 est significativement associée à un pronostic clinique des patients atteints de cancer gastrique
Pour examiner la relation entre l'expression THBS2 et le pronostic clinique des patients atteints de cancer gastrique, nous avons effectué des analyses de survie selon le modèle des risques de régression univariée et multivariée de Cox proportionnelle. Comme le montre le tableau 1, nous avons trouvé le grade histologique, la profondeur de l'invasion, métastase ganglionnaire et le stade TNM ont été des facteurs statistiquement significatifs pour OS en analyse univariée. survie multivariée Cependant, depuis le stade TNM contient également les informations de profondeur de l'invasion et de métastase ganglionnaire, nous avons encore effectué des analyses avec l'ajustement pour le grade histologique et le stade TNM. Nous avons remarqué que le stade TNM (P
< 0,001) et d'expression THBS2 (P
< 0,01) étaient les deux facteurs pronostiques indépendants pour l'évaluation des résultats pour les patients. stade TNM supérieur était un facteur de risque pour plus OS [P
< 0,001, HR (hazard ratio) = 7,23, IC à 95% 3,55 à 14,69) et une expression élevée de THBS2 était encore un facteur favorable pour plus OS (P
< 0,01, HR = 0,51, IC à 95% 0,31 à 0,85). En outre, Kaplan-Meier analyse de survie a confirmé en outre que l'expression THBS2 était significativement corrélée avec les résultats cliniques (Figure 3, P < 0,01, n = 129). Les patients atteints d'expression THBS2 inférieure affichent un système d'exploitation significativement plus courte [médiane de 36 mois, la moyenne 40,07 ± 3,65 (moyenne ± SE) mois], alors que les patients avec une expression de THBS2 supérieure ont montré un pronostic favorable [médiane 59 mois, la moyenne de 53,70 ± 2,95 (moyenne ± SE ) mois]. Ensemble, nos résultats démontrent THBS2 est associée de manière significative avec le pronostic clinique des patients atteints de cancer de l'estomac, ce qui pourrait devenir un marqueur pronostique pour le cancer gastrique. Figure 3 de survie de Kaplan-Meier analyse avec le test du log-rank pour la survie globale (OS). L'analyse de Kaplan-Meier des corrélations entre les différents niveaux d'expression de THBS2 et OS chez 129 patients atteints de cancer gastrique de. surexpression de THBS2 inhibe la croissance des cellules de cancer gastrique in vitro
Parce THBS2 était significativement régulée à la baisse dans l'estomac le cancer, nous avons déduit que THBS2 pourrait inhiber la croissance, la promotion de l'apoptose et d'améliorer la capacité de migration des cellules cancéreuses gastriques. Pour vérifier notre hypothèse, nous avons d'abord construit un vecteur lentiviral à stable express transcriptions de THBS2 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. l'expression altérée de THBS2 dans 293 cellules T a été confirmée par analyse par Western Blot (figure 4A). Ensuite, nous avons choisi MKN-45 et SGC-7901 lignées cellulaires pour notre vitro
étude parce que les niveaux de THBS2 d'expression d'ARNm étaient plus faibles que d'autres (données non présentées). Nous avons ensuite procédé à l'essai de formation de colonies pour évaluer les effets de THBS2 sur la croissance des MKN-45 et les cellules SGC-7901. Comme cela est représenté sur la figure 4B, on a trouvé des cellules surexprimant THBS2 formé de manière significative moins de colonies sur agar mou par rapport à celles des cellules infectées par un vecteur témoin (P
< 0,01 MKN-45 pour des cellules et
P < 0,001 cellules SGC-7901, respectivement). De plus, nous avons examiné les niveaux d'apoptose entre les deux groupes dans les deux lignées cellulaires et découvert que THBS2 promu l'apoptose dans les cellules SGC-7901 (Figure 4F), mais pas dans MKN-45 cellules (fichier supplémentaire 1: Figure S1A). Et il n'y avait pas de différences significatives entre les deux groupes dans le SGC-7901 et MKN-45 lignées cellulaires dans la migration des cellules selon les dosages Transwell (de fichiers supplémentaires 1: Figure S1B et C). En résumé, nos données confirment que THBS2 empêche la croissance des cellules de cancer gastrique in vitro, éventuellement par l'intermédiaire de la régulation de l'apoptose. La figure 4 Surexpression de THBS2 a inhibé la prolifération des cellules du cancer de l'estomac, supprime l'angiogenèse du cancer gastrique et la promotion de l'apoptose dans SGC-7901 lignée cellulaire in vitro. (A) d'analyse par Western blot de drapeau dans 293 cellules T avec THBS2 surexpression. (B) l'analyse du numéro de Colony pour MKN-45 et les cellules SGC-7901 avec THBS2 surexpression et contrôle négatif. Les valeurs sont des moyennes ± SD de trois expériences indépendantes. (C) Les images de test de formation de colonies. (D) Analyse de AngiogenicIndexCh1 endothéliale essai de formation de tubes de cellules. Les valeurs sont des moyennes ± SD. (E) d'images de l'endothélium essai de formation de tubes de cellules. (F) Analyse de l'apoptose dans MKN-45 lignée cellulaire. Les valeurs sont des moyennes ± SD.
THBS2 supprime le cancer gastrique angiogenèse in vitro
THBS2 est connu comme un inhibiteur de l'angiogenèse [2]. Fournir des preuves de THBS2 régule le phénotype angiogénique du cancer gastrique, endothéliaux dosages de formation de tube cellulaire ont été réalisées. Comme cela est représenté sur la figure 4E et D, dans les deux lignées de cellules MKN-45 et CGS-7901, les cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) en culture avec le milieu provenant de cellules de cancer gastrique THBS2 surexpression a montré AngiogenicIndexCh1 significativement inférieur au témoin négatif (P
< 0,05 pour MKN-45 cellules et P
< 0,001 pour les cellules SGC-7901, respectivement). Collectivement, nos résultats indiquent que THBS2 supprime l'angiogenèse des cellules de cancer gastrique in vitro.
Du Rapport
THBS2 est connu comme un puissant inhibiteur naturel de l'angiogenèse et un modulateur du processus de remodelage [22, 23]. Cependant, aucune des recherches antérieures ont discuté des rôles de THBS2 et sa signification clinique dans le cancer gastrique.
Tout d'abord, nous avons constaté que les niveaux de THBS2 ARNm et expression de la protéine ont été régulés à la baisse dans la plupart des échantillons. Toutefois, une recherche précédente a rapporté des niveaux d'expression THBS2 ARNm dans le cancer gastrique étaient plus élevés que la commande normale [24]. Compte tenu de la taille limitée de l'échantillon dans cette étude, qui a incorporé seulement 6 échantillons de tissus, il est possible que cette différence en raison de l'hétérogénéité de la tumeur pour deux paires de notre deuxième cohorte ne montrera également les mêmes motifs. Cependant, notre résultat ultérieur de la TMA, de plus grande taille de l'échantillon était en accord avec le résultat de la deuxième cohorte. Pris ensemble, nous avons cru que THBS2 était plus susceptible d'être bas réglementé dans la cellule gastrique du cancer par rapport à la muqueuse normale.
De plus, nous avons également remarqué que l'expression relative des échantillons présentait différemment dans l'ARNm et des protéines. Faute de preuves suffisantes, nous en déduisons que la fonction de THBS2 dans les cellules de cancer gastrique peut être régulée par des facteurs intracellulaires en amont de signalisation, de protéines ubiquitination, et d'autres manières possibles, qui peuvent affecter les niveaux de protéines de THBS2 et les phénotypes dans les cellules de cancer gastrique. Et davantage l'accent peut être mis sur ce phénomène intéressant. Néanmoins, la plupart des échantillons de notre deuxième cohorte a montré les mêmes schémas d'expression entre les niveaux d'ARNm et de protéines.
Deuxièmement, nos données montrent que THBS2 pourrait favoriser l'apoptose seulement dans les cellules CGS-7901, mais pas dans les cellules MKN-45. Recherches antérieures ont montré qu'un fragment recombinant N-terminale de THBS2 peut activer l'apoptose endothéliale CD36 cellulaire [14], et la combinaison de CD36 et THBS2 pourrait activer la voie de signalisation des caspases [25]. Ainsi, nous avons supposé que l'hétérogénéité des deux lignées cellulaires utilisées dans notre étude, comme des expressions de CD36 différenciés, pourrait être en partie la raison de différents niveaux de l'apoptose induite par THBS2, qui a appelé à de nouvelles enquêtes.
Troisièmement, nos résultats ont montré que THBS2 pourrait supprimer l'angiogenèse du cancer gastrique. Il est connu que la prolifération tumorale, l'invasion ou la métastase sont dépendantes de l'angiogenèse [26]. Et les preuves fondées soutiennent notre découverte et soulignent que les mécanismes possibles qui THBS2 inhibe l'angiogenèse: 1) un mode d'apoptose indépendante en induisant l'apoptose des cellules endothéliales, cycle cellulaire arrestation et la diminution de la migration des cellules endothéliales [27], 2) en fonction de la signalisation caspase activé par voie CD36 [28]. 3) fonctionnant en tant que co-récepteurs pour le récepteur de lipoprotéine de basse densité related protein (LRP1), ce qui pourrait éliminer les complexes de THBS2 avec la matrice de métalloprotéinases-2, -9 ou le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) de l'environnement péricellulaire de cellules mésenchymateuses [ ,,,0],29-32].
Enfin, MVD est l'un des paramètres les plus couramment utilisés pour évaluer le degré de l'angiogenèse tumorale et des études antérieures ont trouvé MVD pourrait être un facteur pronostique indépendant dans le cancer gastrique et d'autres tumeurs [33-35]. Dans notre étude, nous avons trouvé MVD était significativement corrélée avec l'expression des protéines THBS2 (P
< 0,001) dans le cancer gastrique, mais pas avec les caractéristiques cliniques et le pronostic clinique. Ces résultats ont démontré que THBS2 pourrait affecter l'angiogenèse dans le cancer gastrique, cependant, en raison d'absence de corrélation entre la MVD et le pronostic dans nos échantillons, nous soupçonnions que plus l'expression de THBS2 indiquant une survie plus longue était non seulement grâce à l'inhibition de l'angiogenèse du cancer gastrique, d'autres mécanismes tels que la régulation ECM remoulage [23] et la prolifération taux de cellules de cancer gastrique pourrait également être les raisons qui ont besoin de nouvelles recherches à explorer.
Collectivement, nos résultats ont souligné les rôles importants de THBS2 en significations pronostiques ainsi que la prolifération tumorale et l'angiogénèse dans l'estomac cancer. Ces données suggèrent THBS2 pourrait être un marqueur pronostique important pour les patients atteints de cancer gastrique. En outre, sur la base des effets de THBS2 sur le développement de la tumeur et l'angiogenèse, nos recherches fournissent des indices précieux pour les pratiques cliniques pour développer des thérapeutiques inhibiteurs moléculaires utilisant des cibles déduites de la connaissance biologique fournie par la signature THBS2.
Conclusion
Nos cadeaux d'étude la première ligne de preuves que l'expression THBS2 est régulée à la baisse à la fois des niveaux de protéine et l'ARNm et une diminution de THBS2 expression est associée à la mauvaise note histologique du cancer gastrique. Fondamentalement, la surexpression de THBS2 présente une corrélation significative avec le pronostic des patients atteints d'un cancer gastrique. D'autre part, THBS2 affecté le pronostic dans le cancer gastrique peut non seulement par la régulation de l'angiogénèse, mais dans d'autres manières telles que la régulation de l'ECM remoulage et d'inhiber la prolifération des cellules cancéreuses gastriques. Ces résultats suggèrent que THBS2 pourrait être potentiellement un rôle critique dans la pathogenèse et la progression du cancer de l'estomac. Nous confirmons que, avec les études approfondies progressives de THBS2, il peut être un biomarqueur utile et simple prometteuse pour prédire les résultats cliniques pour les patients atteints de cancer gastrique.
Méthodes
Patients et échantillons de tissus
à la présente étude, nous constituée de deux cohortes de spécimens. La première cohorte contenait 129 fixés à la formaline, le cancer gastrique humain inclus dans la paraffine et 24 tissus gastriques normaux choisis au hasard. Ils ont été recrutés consécutivement entre Décembre 2006 et mai 2008, Département de chirurgie générale, Le Premier hôpital affilié de l'Université médicale de l'Anhui, Hefei, en Chine. Ces spécimens ont été incorporés dans TMA pour la coloration immunohistochimique. Les caractéristiques histologiques de ces spécimens ont été confirmés par des pathologistes. Pathologique staging TNM a été évaluée selon les critères 2010 de l'American Joint Committee on Cancer (AJCC). La deuxième cohorte était composée de 14 patients atteints de cancer gastrique qui suivi une thérapie de résection de la tumeur au Département huitième de chirurgie générale, Le Premier hôpital affilié de l'Université médicale de l'Anhui. Le tissu de cancer de l'estomac frais et de la muqueuse normale correspondant (au moins 5 cm de distance depuis le bord de la tumeur) ont été immédiatement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à l'utilisation pour quantitative PCR en temps réel et analyse par transfert de Western. Les patients dans les deux cohortes ne pas avoir reçu une chimiothérapie et /ou radiothérapie pré-opératoire. Le consentement éclairé écrit a été fourni par tous les participants. Tous les échantillons ont été traités de façon anonyme selon les normes éthiques. Cette étude a été réalisée avec l'approbation du comité d'éthique de l'hôpital.
Extraction d'ARN et quantitative en temps réel L'ARN total de PCR a été extrait de la deuxième cohorte en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. L'ADNc a été synthétisé par des amorces aléatoires et la transcriptase inverse Superscript II (Toyobo, Osaka, Japon). Les amorces utilisées pour l'amplification par THBS2: amorce sens 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'et l'amorce inverse 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été amplifié dans la même q-PCR comme témoin interne en utilisant des amorces: amorce sens 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'et l'amorce 5'-3 GCCCAATACGACCAAATCC-inverse. La réaction a couru sur le système ABI 7900HT Sequence Detection (Applied Biosystems, CA, USA) en présence du colorant SYBR-Green (Toyobo, Osaka, Japon). La condition de la réaction est un programme de dénaturation (95 ° C pendant 5 min), et un programme d'amplification et de quantification pour 40 cycles (95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 45 s). Chaque échantillon a été testé en triple, et une analyse de la courbe de fusion de chaque échantillon a été utilisé pour vérifier la spécificité de l'amplification. Le niveau d'expression a été déterminée comme un rapport entre THBS2 et GAPDH de contrôle interne dans les quantités d'ARNm calculées par la méthode de CT comparative. Extraction
Protein et Western blot de protéines totales ont été extraites de 14 cancer de l'estomac congelé et son correspondant normale le tissu de la muqueuse par la glace dans l'essai d'immunoprécipitation radio Lysis Buffer (RIPA; Beyotime institut de biotechnologie, Jiangsu, Chine) et mesurée à l'aide d'un kit de dosage de protéines BCA (Beyotime institut de biotechnologie, Jiangsu, Chine). Le lysat a été centrifugé à 12 000 tours par minute pendant 5 minutes, et le surnageant a été chauffé à 100 ° C pendant 5 minutes. Ensuite, des protéines équivalentes de chaque paire des échantillons ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium à 8% et électrotransférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (Millipore, Billerica, MA). Après le blocage avec du TBST contenant 5% de lait écrémé en à la température ambiante pendant une heure, les membranes ont été transférées avec l'anticorps anti-THBS2 (1: 1500; Novus) et anti-Flag (1: 3000; Sigma). Puis une incubation avec des membranes anti-lapin marqué à la peroxydase de raifort et d'IgG anti-souris comme anticorps secondaire (Beyotime Institut de Biotechnologie). un anticorps anti-GAPDH (1: 4000; Aogma) a été utilisé comme anticorps de contrôle du chargement. Les anticorps liés ont été détectés avec la méthode de chimioluminescence amplifiée.
Immunohistochimie et TMA analyse
cancer gastrique et des échantillons de muqueuse gastrique normale ont été fixés à la formaline, enrobés de paraffine et ont été utilisés pour construire un tissu TMA. H & E diapositives colorées ont été criblés pour identifier un tissu intratumorale optimale pour l'analyse. 4 um sections épaisses ont été cuites à 60 ° C pendant 1 heure, déparaffinées avec des xylenes et réhydratés dans de l'éthanol gradué à l'eau distillée. La récupération d'antigène a été réalisée avec mise en place des sections avec du tampon citrate dans un vaporiseur de riz pendant 30 minutes. Pour étancher l'activité de peroxydase endogène, les sections ont été traitées avec 3% de H 2 O 2 dans le méthanol. Ensuite, nous avons utilisé 1% de sérum albumine bovine pour bloquer la liaison non spécifique. un anticorps anti-THBS2 (Novus, 1: 2000) et anti-CD34 (Abcam, 1: 250) ont été incubées avec les sections à 37 ° C pendant une nuit, puis mis en incubation avec la peroxydase de raifort marquée anti-IgG de lapin comme anticorps secondaire (Vie Les technologies). En fin de compte, les lames ont été placées sur un instrument de liaison Autostainer et procéder à la coloration. Pour les contrôles négatifs, les anticorps primaires ont été remplacés par du sérum de lapin normal. La coloration immunohistochimique efficace finale a été évaluée par deux pathologistes indépendants sans connaître les informations de patients en fonction de l'intensité de la coloration et l'étendue de la coloration. section de tissu a été marqué comme étant le pourcentage de cytoplasme teinté dans les cellules de la glande du cancer gastrique et les cellules des glandes normales (0 points pour pas de cellules colorées, 1 point pour < 25%, 2 points pour 25-75%, et 3 points pour > 75 % de cellules colorées) et l'intensité de la coloration de l'immunoréactivité a été notée sur une échelle de 0 à 3. le score moyen immunoréactivité (IRS) a résulté de la multiplication des deux paramètres. Les échantillons ont été notés comme suit: négatif (IRS = 0 ~ 2), positif (IRS = 3 ~ 9)
MVD comptant
coloration immunohistochimique de CD34 et les critères généralement reconnus effectués par Weidner et al.. [36] ont été utilisées pour MVD comptage. Toutes les cellules endothéliales colorées ou des agrégats de cellules endothéliales ont été séparés des microcellules adjacentes, et l'épaisseur de chaque paroi de la cuve au-dessus de 2,75 um seraient exclus. Trois sections distinctes contenant les points chauds (où le plus grand nombre de microvaisseaux discrets était tachée) dans chaque échantillon de TMA ont été choisis faibles grossissements (100 ×) sous un microscope optique (Leica, Allemagne). Par la suite, les microvaisseaux ont été comptés dans chaque section dans un fort grossissement (200 ×). P
< Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit.

• fonctions Lnc ARN Hotair comme un ARN endogène en compétition pour réguler l'expression de HER2 par épongeant miR-331-3p dans le cancer gastrique
• altération protéomique dans les adénocarcinomes gastic de patients japonais