regulação para baixo dos Thrombospondin2 prediz mau prognóstico em pacientes com câncer gástrico

A regulação da Thrombospondin2 prediz mau prognóstico em pacientes com câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
Thrombospondins (THBSs) são uma família de múltiplos domínios e secretada Ca matricellular 2 + glicoproteínas liga�o ao que tem, pelo menos, cinco membros codificadas por genes independentes. Como um membro da família THBSs, Thrombospondin2 (THBS2) tem sido relatado para regular a angiogénese. No entanto, as funções e significado clínico THBS2 ainda permanece obscuro no câncer gástrico.
Métodos
Os níveis de mRNA e expressão de proteínas de THBS2 foram avaliadas em 14 emparelhado das amostras com câncer gástrico e mucosas normais correspondente utilizando quantitativa PCR em tempo real e análise de western blot. A imuno-histoquímica de THBS2 e CD34 em microarrays de tecido de base populacional que consistem de 129 casos de cancro gástrico foram utilizados para avaliar o significado prognóstico da THBS2 e densidade de microvasos (MVD) de cada amostra. análises de sobrevivência foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier e modelo de riscos proporcionais de Cox. ensaio de formação de colónia, ensaio de formação de tubo endotelial celular, migração celular e ensaio de apoptose em análise MKN-45 e linhas celulares SGC-7901 foram efectuados para avaliar os efeitos de THBS2 sobre o cancro gástrico in vitro
.
resultados
85,71% (12 de 14) tecidos de câncer gástrico expressas notavelmente inferior THBS2 em ambos os mRNA e os níveis de proteína do que os controles normais correspondentes. Consistentemente, tissue microarray (TMA) resultados mostraram THBS2 níveis também foram inibidas em tecidos com câncer gástrico em comparação com os controles normais. Além disso, observamos que os pacientes com níveis mais elevados de THBS2 foram significativamente correlacionados com prognóstico mais favorável, enquanto diminuiu THBS2 expressão foram associados com mais pobres graus histológicos de câncer gástrico. Além disso, nossos experimentos in vitro demonstraram ainda que a superexpressão de THBS2 poderia impedir tanto a taxa de proliferação e da formação do tubo de células endoteliais da veia umbilical humano (HUVECs) em MKN-45 e SGC-7901 linhas celulares.
Conclusão
Nossa estudo sugere THBS2 é expressão aberrante em câncer gástrico e desempenha um papel crítico na progressão do cancro, que pode ser um potencial preditor prognóstico do câncer gástrico.
Palavras-chave
THBS2 gástrica câncer Angiogenesis prognóstico biomarcador Introdução
O câncer gástrico é um altamente agressivo e malignidade letal. Um total de 952,000 novos casos de cancro do estômago e 723.000 mortes foram estimados para ter ocorrido em 2012, representando 6,8% do total de casos e 8,8% do total de mortes. Além disso, tanto novos casos e mortes de câncer gástrico na China, classificada em 1 a nível mundial, representando mais de 40% do que no mundo [1]. Portanto grandes preocupações são levantadas para as pesquisas de câncer gástrico.
Thrombospondins (THBSs) são uma família de Ca multidomain e matricellular 2 + liga�o ao glicoproteínas secretados pelos fibroblastos do estroma, células endoteliais e células do sistema imunológico [2]. Eles têm, pelo menos, cinco membros codificadas por genes independentes. Através da ligação com inúmeras proteínas-alvo, eles participam de diversos processos biológicos, como a angiogênese, motilidade celular, a apoptose, a organização do citoesqueleto, e servem como plataformas de interação na matriz extracelular (ECM) [3, 4]. Notavelmente, THBS1 e THBS2 são especiais nesta família para as suas repetições do tipo I e ambos são mostrados principalmente como inibidores da angiogénese [5, 6], uma parte fundamental da investigação sobre o cancro [7-9]. a densidade microvascular (MVD) é um parâmetro muito utilizado para estimar o grau de angiogénese em tumores com CD34 sendo a máquina de microvasos no cancro gástrico [10]. Com base nos resultados anteriores [2], apresentamos uma hipótese em nosso estudo que também poderia afetar a angiogênese no câncer gástrico.
Além angiogênese, THBS2 foi relatado para interagir com vários receptores celulares, fatores de crescimento e proteínas de ECM bem como regular a apoptose, proliferação celular e adesão [11]. Em pesquisas de câncer, as atenções crescentes têm sido focados na THBS2. Tokunaga et al. [12] descobriu que THBS2 expressos em pacientes com câncer de cólon apresentaram um risco significativamente menor de metástases hepáticas e vascularização do tumor em comparação com os pacientes cujos tumores eram deficiência THBS2. Além disso, de Fraipont et ai. [13] demonstraram que THBS2 foi significativamente correlacionada com o estado clínico e os resultados, e para a maioria dos tumores, houve uma correlação inversa entre o nível de expressão THBS2 e o seu grau de malignidade. Além disso, THBS2 também desempenhou um papel chave no cancro da mama [14], mieloma [15], melanoma maligno [16], o câncer de próstata [17] e adenocarcinoma pulmonar [18, 19]. No cancro gástrico, outros membros da THBSs, THBS1 [20] e THBS4 [21] pode ser como um biomarcador de prognóstico ou um potente marcador para adenocarcinomas gástricos de tipo difuso. No entanto, a função detalhada de THBS2 no câncer gástrico e suas implicações para diagnóstico clínico ainda permanecem sombrio. Assim, buscou-se desvendar o significado clínico da THBS2 e seu efeito no câncer gástrico.
Para verificar nossa hipótese acima mencionada, foram examinados os níveis de expressão THBS2 em tecidos de câncer gástrico humano e tecidos normais correspondentes e, em seguida, explorou as possíveis correlações entre o expressão de THBS2 e características clínico-patológicas, prognóstico clínico ea contagem MVD em pacientes com câncer gástrico. Além disso, o ensaio de formação de colónia, ensaio de formação de tubo endotelial celular, migração celular e ensaio de análise de apoptose foram efectuados em MKN-45 e linhas celulares SGC-7901 para explorar o efeito in vitro no
de THBS2 em células de cancro gástrico.
resultados
características do paciente e os resultados clínicos
no presente estudo, nós matriculados 129 pacientes elegíveis, que consistia de 101 homens e 28 mulheres. A idade dos pacientes variou de 29 a 80 anos (y) com uma idade média de 61y. Todas as características clínico-patológicas estão resumidos na Tabela 1. A mediana de sobrevida global (OS) dos pacientes foi de 57 meses, ea média OS foi 44,01 [95% intervalo de confiança (IC) 39.78-49.24 meses] .table 1 Associação entre as variáveis ​​clínicas e THBS2 expressão e sobrevida global dos pacientes com câncer gástrico
Variáveis ​​
negativo
positiva
total nº
P valorA
sobrevida global OS
Log-Rank Pb
HR (IC 95%)
Não. (%)
Não. (%)
Idade (y )
0,112
0,743 Art < 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (referência)
≥61
35 ( 53,0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67-1,77)
Sexo
0,831
0,405
Masculino
47 (46,5)
54 ( 53,5)
101
1 (referência)
Feminino
grau histológico 12 (42,9)
16 (57,1)
28
0,76 (0,40-1,45)

0,005
0,011
Bem e moderada
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (referência)
pobres e outros
35 (60,3 )
23 (39,7)
58
1,89 (1,16-3,09)
localização do tumor
0,419
0,204
superior
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (referência)
meio
15 (53,6)
13 (46,4)
28
1,66 (0,86-3,18)
Lower
17 (50,0)
17 (50,0)
34
1,90 (0,90-4,01)
profundidade de invasão
0,271
0,001
T1-T2
9 ( 34,6)
17 (65,4)
26
1 (referência)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11,60 (2,83 -47,45)
metástases linfonodais
0,454 Art < 0,001
Ausente
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (referência)
Present
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5,16 (2,46-10,84)
estágio TNM
0,283 Art < 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (referência)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52-14,49)
valor negrito é estatisticamente significativo no P Art < 0,05, relação HR perigo.
Um, P
valor das variáveis ​​clínicas e THBS2 expressão.
B, P
valor da associação entre as variáveis ​​clínicas e sobrevida global dos pacientes com câncer gástrico.
THBS2 é sub-regulada no cancro gástrico
a fim de determinar os níveis de expressão de THBS2 em cancro gástrico, que numa primeira fase, os níveis de expressão de mRNA THBS2
no cancro gástrico por quantitativo em tempo real na segunda coorte. Este grupo de amostras, mencionados em Methods, 14 incluído cancro gástrico humano e os tecidos normais correspondentes. Como mostrado na Figura 1A, THBS2
níveis eram marcadamente inferior em 85,7% (12 de 14) dos tecidos de cancro gástrico do que os seus controlos normais, enquanto que os restantes dois pares de as amostras exibiram o oposto. Em seguida, foram detectados os níveis de THBS2 expressão de proteínas através de western blot no mesmo grupo. Como mostra a Figura 1B e C, observamos que THBS2 níveis de expressão de proteína foram reduzidas em 85,7% (12 de 14) das amostras de tumor em comparação com o seu controle correspondente, enquanto que a amostra 5 e 11 exibido inversamente. Para confirmar esse achado, foi realizada ainda uma tissue microarray (TMA) e avaliou os níveis de THBS2 expressão de proteínas de acordo com a pontuação imunorreatividade (IRS) de cada amostra. Encontrámos THBS2 proteínas foram expressas principalmente no citoplasma das células gástricas (Figura 2A), e em conformidade com os resultados de western blot, os níveis de THBS2 foram significativamente inibidos em tecidos de cancro gástrico em comparação com os controlos normais (Figura 2B, P < 0,05). Tomados em conjunto, os nossos resultados demonstram que THBS2 é regulada no cancro gástrico em ambos os níveis de proteína mRNA e. A Figura 1 mRNA e nível de expressão da proteína de THBS2 em 14 tecidos de cancro gástrico e o tecido normal correspondente. (A), a expressão de ARNm relativa de THBS2 foi detectada por quantitativa PCR em tempo real. Expressão de tecidos normais foram normalizados a 1,0, tal como indicado. os resultados da análise (B) A densitometria das bandas THBS2 foram normalizadas para GAPDH usando o Image J. A expressão de tecidos normais foram normalizados a 1,0, tal como indicado. (C) a expressão da proteína Relativa de THBS2 foi estimada pelo ensaio de mancha de Western.
Figura 2 A análise imuno-histoquímica de THBS2, CD34. (A) Imagens representativas de THBS2 e expressão CD34: N1, N2, N3, N4, tecido gástrico normal (N); M1, M2, M3, M4, moderadamente diferenciado (M); P1, P2, P3, P4, pouco diferenciado (P). Ampliação: 100 × (N1, M1, P1, N3, M3, P3), a 200 × (N4, M4, P4) e 400 × (N2, M2, P2). (B) Comparação da expressão THBS2 do cancro gástrico (n = 129) e nos tecidos gástricos normais (n = 24) em TMA. O nível de expressão THBS2 apresentados como média ± SEM. (C) Comparação de MVD no grupo câncer gástrico THBS2-positivos grupo com câncer gástrico (n = 70) e THBS2-negativo (n = 59). Os pontos representam MVD de cada amostra. Os valores são médias ± SEM. Níveis de expressão
THBS2 são inversa correlacionados com graus histológicos de câncer gástrico
Para esclarecer melhor a importância clínica da THBS2, foi analisada a relação entre a expressão da proteína THBS2 e características clínicas, incluindo idade, sexo, histológica grau, localização do tumor, profundidade de invasão, metástase de linfonodos e estadiamento TNM de doentes com cancro gástrico em grupos THBS2-positivos e negativos. Como mostrado na Tabela 1, verificou-se uma significativa correlação inversa com os graus histológicos de câncer gástrico (P Art < 0,01). Os graus histológicos de pacientes do grupo THBS2-positivas eram mais propensos a ser bem e moderada, enquanto que os pacientes do grupo THBS2-negativos tendem a ser pobres e outros. No entanto, não conseguimos descobrir qualquer diferença estatística significativa entre os níveis de expressão de THBS2 e outros parâmetros clínicos. Coletivamente, nossas descobertas sugerem que THBS2 é inversa correlação com grau histológico de câncer gástrico. Níveis de expressão
THBS2 são inversa correlacionada com MVD no câncer gástrico
Relatórios anteriores THBS2 implícita poderia regular a angiogénese tumoral [6], mas nenhum foi relatado no câncer gástrico. Assim, foi perguntado se havia alguma correlação entre MVD e os níveis de expressão THBS2, bem como outros parâmetros clínicos em nossas amostras clínicas. O MVD em 129 espécimes de cancro gástrico variou de 0 a 120, com a mediana de 40 e a média de 48,12 ± 28,99 (média ± SD) de acordo com a imuno-reactividade de células CD34 no nosso TMA. Tal como mostrado na Figura 2C, THBS2 foi significativamente correlacionado com MVD. O MVD no grupo THBS2-negativo foi muito maior do que no grupo THBS2-positiva (P
< 0,001). No entanto, não foi possível observar qualquer diferença estatística entre MVD e outras características clínico-patológicas, incluindo prognóstico clínico em nossas amostras (dados não mostrados). Em conclusão, nossas descobertas demonstram que THBS2 é inversa correlacionada com MVD no câncer gástrico.
THBS2 é significativamente associada com o prognóstico clínico de pacientes com câncer gástrico
Para examinar a relação entre a expressão THBS2 eo prognóstico clínico de pacientes com câncer gástrico, realizamos análises de sobrevida pelo modelo de riscos de regressão proporcional uni e multivariada de Cox. Como mostrado na Tabela 1, encontramos grau histológico, profundidade de invasão, metástase de linfonodos e estadiamento TNM foram fatores estatisticamente significantes para OS na análise univariada. sobrevida multivariada No entanto, desde estágio TNM também contém a informação de profundidade de invasão e metástases em linfonodos, nós ainda realizadas análises com ajuste para o grau histológico e estádio TNM. Percebemos que estágio TNM (P Art < 0,001) e expressão THBS2 (P Art < 0,01) foram fatores prognósticos independentes para a avaliação dos resultados dos pacientes. Superior estágio TNM foi um fator de risco para mais OS [P Art < 0,001, HR (taxa de risco) = 7,23, 95% CI 3,55-14,69) e expressão elevada de THBS2 foi ainda um fator favorável para mais OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% CI ,31-,85). Além disso, a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier ainda confirmado que a expressão THBS2 foi significativamente correlacionado com os resultados clínicos (Figura 3, P < 0,01, n = 129). Os pacientes com menor expressão THBS2 exibido um sistema operacional significativamente menor [mediana de 36 meses, com média de 40,07 ± 3,65 (média ± SE) meses], enquanto os pacientes com maior expressão THBS2 mostraram um prognóstico favorável [mediana de 59 meses, com média de 53,70 ± 2,95 (média ± SE ) meses]. Juntos, nossos resultados demonstram THBS2 é significativamente associada com o prognóstico clínico de pacientes com câncer gástrico, o que pode tornar-se um marcador de prognóstico para câncer gástrico. Figura 3 sobrevida de Kaplan-Meier com teste log-rank para a sobrevida global (OS). A análise de Kaplan-Meier das correlações entre diferentes níveis de expressão THBS2 e OS em 129 pacientes com câncer gástrico.
superexpressão do THBS2 inibe o crescimento de células cancerosas gástricas in vitro
Porque THBS2 foi significativamente regulada em gástrica câncer, que se inferir que THBS2 pode inibir o crescimento, promover a apoptose e aumentar a capacidade de migração das células cancerosas gástricas. Para verificar nossa hipótese, primeiro construído um vector lentiviral às transcrições THBS2 expressas estáveis ​​em linhas celulares de cancro gástrico. expressão alterada de THBS2 em 293 células T foi confirmada por análise de Western blot (Figura 4A). Em seguida, nós escolhemos MKN-45 e SGC-7901 linhas celulares para o nosso estudo in vitro
porque os níveis de expressão de mRNA THBS2 foram menores do que os outros (dados não mostrados). Em seguida, realizado o ensaio de formação de colónias para avaliar os efeitos de THBS2 sobre o crescimento de MKN-45 e células SGC-7901. Como mostrado na Figura 4B, que encontramos células com sobre-expressão THBS2 formadas significativamente menos colónias em agar mole em comparação com os de células infectadas com o vector de controlo (P
< 0,01 para células MKN-45 e P
< 0,001 para células SGC-7901, respectivamente). Além disso, foram examinados os níveis de apoptose entre os dois grupos em ambas as linhas celulares e descobriu que THBS2 promoveu a apoptose em células SGC-7901 (Figura 4F), mas não em células MKN-45 (arquivo adicionais 1: Figura S1A). E não houve diferenças significativas entre os dois grupos no SGC-7901 e linhas celulares MKN-45 na migração de células de acordo com os ensaios transpo� (arquivo adicionais 1: Figura s1b e C). Em resumo, os nossos dados demonstram que THBS2 impede o crescimento de células de cancro gástrico in vitro, possivelmente através da regulação da apoptose. Figura 4 A sobre-expressão de THBS2 inibiu a proliferação de células de cancro gástrico, suprimiu a angiogénese do cancro gástrico, e promoveu a apoptose em linhas celulares SGC-7901 in vitro. (A) Análise Western blot da bandeira em 293 T células com superexpressão THBS2. (B) análise do número de Colônia para MKN-45 e células SGC-7901 com THBS2 superexpressão e controle negativo. Os valores são médias ± DP de três experiências independentes. (C) Imagens do ensaio de formação de colónia. (D) Análise AngiogenicIndexCh1 de ensaio de formação de tubo de células endoteliais. Os valores são médias ± DP. (E) Imagens do ensaio de formação de tubos de células endoteliais. (F) Análise da apoptose na linha celular MKN-45. Os valores são médias ± DP.
THBS2 suprime cancro gástrico angiogénese in vitro
THBS2 é conhecida como um inibidor de angiogénese [2]. Para proporcionar evidências de THBS2 regula o fenótipo angiogénico do cancro gástrico, ensaios de formação de tubos de células endoteliais foram realizadas. Tal como mostrado na Figura 4E e D, em ambas as linhas celulares MKN-45 e SGC-7901, as células humanas endoteliais da veia umbilical (HUVEC) cultivadas com o meio a partir de células de cancro gástrico THBS2-superexpressão mostrou AngiogenicIndexCh1 significativamente mais baixos do que o controlo negativo (P
< 0,05 para células MKN-45 e P
< 0,001 para células SGC-7901, respectivamente). Colectivamente, os nossos resultados sugerem que THBS2 suprime a angiogénese de células de cancro gástrico in vitro
.
Discussão
THBS2 é conhecida como um potente inibidor natural da angiogénese e um modulador do processo de remodelação [22, 23]. No entanto, nenhum dos antigos pesquisas discutidos os papéis dos THBS2 e sua relevância clínica em câncer gástrico.
Em primeiro lugar, verificou-se que os níveis de mRNA e expressão de proteínas de THBS2 foram regulados negativamente na maioria das amostras. No entanto, uma pesquisa anterior relataram níveis de expressão de mRNA THBS2 em câncer gástrico foram superiores de controlo normal [24]. Considerando-se o tamanho da amostra limitada neste estudo, que incorporou apenas 6 amostras de tecido, é possível que esta diferença devido à heterogeneidade do tumor por dois pares de nossa segunda coorte também mostrou os mesmos padrões. No entanto, o nosso resultado subsequente de TMA, maior em tamanho da amostra, foi consistente com o resultado da segunda coorte. Tomados em conjunto, acreditamos que THBS2 era mais provável de ser regulada negativamente na célula cancerosa gástrica contra mucosa normal.
Além disso, também notamos que a expressão relativa das amostras exibiram de forma diferente em mRNA e nível de proteína. Na falta de evidências suficientes, podemos inferir que a função do THBS2 dentro de células cancerosas gástricas pode ser regulamentada por alguns fatores intracelulares de sinalização upstream, ubiquitinação de proteínas, e outras maneiras possíveis, que podem afetar os níveis de proteína de THBS2 e os fenótipos em células cancerosas gástricas. E mais ênfase pode ser colocada sobre este fenómeno interessante. No entanto, a maioria das amostras de a segunda coorte exibidos os mesmos padrões de expressão entre o ARNm e os níveis de proteína.
Em segundo lugar, os nossos dados mostraram que THBS2 poderia promover a apoptose apenas em células SGC-7901, mas não em células MKN-45. Ex pesquisas mostraram que um fragmento recombinante do terminal N da THBS2 poderia activar a apoptose mediada por CD36 das células endoteliais [14], e a combinação de CD36 e THBS2 pode activar a via de sinalização da caspase [25]. Assim, assumimos que a heterogeneidade das duas linhas de células utilizadas em nosso estudo, como expressões CD36 diferenciadas, pode em parte ser a razão de diferentes níveis de apoptose induzida por THBS2, que solicitou mais investigações.
Em terceiro lugar, nossos resultados mostraram que THBS2 poderia suprimir a angiogênese do câncer gástrico. Sabe-se que a proliferação do tumor, invasão ou metástase são dependentes de angiogénese [26]. E evidências baseadas apoiar nossa descoberta e apontam que os possíveis mecanismos que THBS2 inibe a angiogênese: 1) de forma independente de apoptose através da indução de apoptose de células endoteliais, ciclo celular prender e diminuição da migração de células endoteliais [27], 2) dependente de sinalização de caspase activado por via CD36 [28]. 3) a funcionar como co-receptores para a proteína relacionada com receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP1), que pode limpar os complexos de THBS2 com metaloproteinases de matriz-2, -9 ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) a partir do ambiente pericelular de células mesenquimais [ ,,,0],29-32].
por último, MVD é um dos parâmetros mais utilizados para avaliar o grau de angiogênese tumoral e estudos anteriores já haviam mostrado MVD pode ser um fator independente de prognóstico no câncer gástrico e outro tumor [33-35]. Em nosso estudo, encontramos MVD foi significativamente correlacionada com a expressão da proteína THBS2 (P Art < 0,001) no câncer gástrico, mas não com as características clínicas e prognóstico clínico. Estes resultados demonstraram que THBS2 poderia afetar a angiogênese no câncer gástrico, no entanto, por causa de nenhuma correlação entre MVD e prognóstico em nossas amostras, nós suspeitamos que a maior expressão THBS2 indicando maior sobrevida não foi apenas através da inibição da angiogénese de câncer gástrico, outros mecanismos, como a regulação ECM remodelar [23] e proliferação taxa de células de câncer gástrico também pode ser as razões que necessitam de mais pesquisas para explorar.
Coletivamente, nossas descobertas enfatizou o importante papel de THBS2 em significados de prognóstico, bem como a proliferação do tumor e angiogênese em gástrica Câncer. Estes dados sugerem THBS2 poderia ser um marcador de prognóstico importante para pacientes com câncer gástrico. Além disso, com base nos efeitos da THBS2 sobre o desenvolvimento do tumor e angiogese, as nossas pesquisas fornecer pistas valiosas para práticas clínicas para desenvolver terapêuticas que inibem alvos moleculares utilizando deduzidas a partir do conhecimento biológico fornecida pela assinatura THBS2.
Conclusão Os nossos
estudo apresenta a primeira linha de evidências de que a expressão THBS2 é regulada para baixo em ambos os níveis de proteína mRNA e e diminuição THBS2 expressão está associada com os pobres grau histológico de câncer gástrico. Crucialmente, superexpressão de THBS2 tem uma correlação significativa com o prognóstico favorável dos pacientes com câncer gástrico. Por outro lado, THBS2 afectada prognóstico no cancro gástrico pode não só através da regulação da angiogénese, mas em alguns outros modos como a regulação ECM remoldagem e inibindo a proliferação de células de cancro gástrico. Estes achados sugerem que THBS2 poderia ser um papel potencialmente crítico de na patogênese e progressão do câncer gástrico. Confirmamos que, com os estudos de profundidade graduais de THBS2, pode ser um biomarcador útil e simples promissora para prever o resultado clínico em pacientes com câncer gástrico.
Métodos
Pacientes e amostras de tecido
No presente estudo, incorporou duas coortes de espécimes. O primeiro grupo continha 129, câncer humano embebido em parafina fixado em formalina gástrica e 24 tecidos gástricos normais selecionados aleatoriamente. Eles foram consecutivamente recrutados entre Dezembro de 2006 e Maio de 2008, do Departamento de Cirurgia Geral, o primeiro hospital Affiliated da Universidade de Medicina de Anhui, Hefei, China. Estas amostras foram incorporados TMA para coloração imuno-histoquímica. características histológicas destes espécimes foram confirmados por patologistas. Patológica estadiamento TNM foi avaliada de acordo com os critérios de 2010 do Comité Misto Americana do Câncer (AJCC). O segundo grupo foi composto por 14 pacientes com câncer gástrico que submeteram a terapia de ressecção do tumor na Oitava Departamento de Cirurgia Geral, o Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Anhui. O tecido de cancro gástrico e mucosa normal fresco correspondentes (pelo menos, 5 cm de distância a partir do bordo do tumor) foram imediatamente congeladas em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até utilização para quantitativa PCR em tempo real e análise de Western blot. Os pacientes em ambos os grupos não receberam quimioterapia e /ou radioterapia pré-operatória. consentimento informado por escrito foi fornecido por todos os participantes. Todas as amostras foram tratadas de forma anônima de acordo com os padrões éticos. Este estudo foi realizado com a aprovação do Comitê de Ética Revisão do hospital.
Extração de RNA e quantitativa PCR em tempo real
RNA total foi extraído a partir da segunda coorte utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. O ADNc foi sintetizado por iniciadores aleatórios e transcriptase inversa Superscript II (Toyobo, Osaka, Japão). Os iniciadores utilizados para amplificação para THBS2: iniciador directo 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'e o iniciador inverso 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi amplificado no mesmo Q-PCR como um controlo interno, utilizando iniciadores: iniciador de sentido directo 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'e iniciador 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3 inverter'. A reacção correu na 7900HT Sistema de Detecção de Sequência ABI (Applied Biosystems, CA, EUA) na presença de corante SYBR-Green (Toyobo, Osaka, Japão). A condição de reacção foi de um programa de desnaturação (95 ° C durante 5 min), e um programa de amplificação e quantificação por 40 ciclos (95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 45 s). Cada amostra foi testada em triplicado, e uma análise de curvas de fusão de cada amostra foi utilizada para verificar a especificidade da amplificação. O nível de expressão foi determinada como uma relação entre THBS2 ea GAPDH controle interno nos montantes de mRNA calculados pelo método CT comparativo. Extração
Proteína e Western blot
proteína total foram extraídos de 14 cancro gástrico congelado e seus correspondentes normais tecido da mucosa pelo gelo no ensaio de rádio imunoprecipitação Tampão de lise (RIPA; Beyotime Instituto de Biotecnologia, Jiangsu, China), e medidos usando um kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime Instituto de Biotecnologia, Jiangsu, China). O lisado foi centrifugado a 12000 rpm durante 5 minutos, e o sobrenadante foi aquecida a 100 ° C durante 5 minutos. Em seguida, as proteínas equivalentes de cada par espécimes foram separados em sulfato de dodecilo e electroforese em gel de poliacrilamida a 8% de sódio e electrotransferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA). Após O bloqueados com TBST contendo 5% de leite desnatado em à temperatura ambiente durante uma hora, as membranas foram transferidas com o anticorpo anti-THBS2 (1: 1500; Novus) e anti-Flag (1: 3000; Sigma). Seguido de incubação das membranas com peroxidase de rábano-anticorpos marcados anti-coelho e anti-IgG de rato como anticorpo secundário (Beyotime Instituto de Biotecnologia). O anticorpo anti-GAPDH (1: 4000; Aogma) foi utilizado como um anticorpo de controlo de carga. Os anticorpos ligados foram detectados com o método de quimiluminescência reforçada.
Análise imuno-histoquímica e TMA
O câncer gástrico e amostras de mucosa gástrica normais foram fixadas em formalina, embebidos em parafina e foram utilizados para construir um tecido TMA. H & E-lâminas coradas foram rastreados para identificar tecido intratumoral adequados para a análise. 4-mm de espessura foram cozidas a 60 ° C durante 1 hora, deparaffinised com xilenos, e re-hidratadas em etanol graduado de água destilada. A recuperação de antígenos foi atingida com a colocação das secções com tampão de citrato num arroz vapor durante 30 minutos. Para extinguir a actividade da peroxidase endógena, as secções foram tratadas com 3% H 2O 2 em metanol. Em seguida, utilizou-se 1% de albumina de soro de bovino para bloquear a ligação não específica. O anticorpo anti-THBS2 (Novus, 1: 2000) e anti-CD34 (Abcam, 1: 250) foram incubadas com as secções, a 37 ° C durante a noite, em seguida, incubadas com peroxidase de rábano IgG anti-coelho como anticorpo secundário (Vida Technologies). No final, as lâminas foram colocadas num instrumento de ligação Autostainer e prosseguir com a coloração. Para controlos negativos, os anticorpos primários foram substituídos com soro de coelho normal. A coloração imuno-histoquímica eficaz final foi avaliada por dois patologistas independentes sem saber as informações dos pacientes de acordo com a intensidade de coloração e extensão da coloração. Secção de tecido foi marcado como a percentagem de citoplasma coradas em células da glândula cancro gástrico e as células de glândulas normais (0 pontos para nenhuma das células coradas, 1 ponto para < 25%, 2 pontos para 25-75%, e 3 pontos para > 75 % de células coradas), e a intensidade de coloração de imuno-reactividade foi graduada numa escala de 0 a 3. a pontuação imunorreactividade (IRS) foi resultado da multiplicação de ambos os parâmetros. Os espécimes foram marcados como segue: negativo (IRS = 0 ~ 2), positivo (IRS = 3 ~ 9)
MVD contando coloração imuno-histoquímica
de CD34 e os critérios geralmente aceitos realizados por Weidner et al.. [36] foram utilizados para contagem de MVD. Quaisquer células endoteliais coradas ou grupos de células endoteliais foram separadas de microvasos adjacentes, ea espessura de cada parede do vaso ao longo 2.75 mm seriam excluídos. Três secções separadas contendo hot-spots (onde o maior número de microvasos discretas foi corado) em cada amostra de TMA foram escolhidos em ampliações baixas (100 ×) sob um microscópio de luz (Leica, Alemanha). Posteriormente, microvasos foram contados em cada seção em alta ampliação (200 ×). P Art < Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito.

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