Nedregulering av Thrombospondin2 spår dårlig prognose hos pasienter med magekreft

Nedregulering av Thrombospondin2 spår dårlig prognose hos pasienter med magekreft
Abstract
Bakgrunn
Thrombospondins (THBSs) er en familie av multidomain og skilles matricellular Ca 2 + -binding glykoproteiner som har minst fem medlemmer kodet av uavhengige gener. Som et THBSs familiemedlem, har Thrombospondin2 (THBS2) blitt rapportert å regulere angiogenese. Likevel er de funksjoner og kliniske betydningen av THBS2 fortsatt uklart i magekreft.
Metoder
Den mRNA og protein uttrykk nivåer av THBS2 ble vurdert i 14 sammen med magekreft prøver og tilsvarende normale mucosas bruker kvantitativ real-time PCR og western blot analyse. Immunhistokjemi av THBS2 og CD34 på populasjonsbasert microarray som består av 129 magekrefttilfeller ble anvendt for å evaluere prognostisk betydning THBS2 og microvessel tetthet (MVD) for hver prøve. Overlevelsesanalyser ble utført av Kaplan-Meier metoden og Cox proporsjonal farer modell. Kolonidannelse assay, endotelial celle rør formasjonsanalyse, cellemigrering analyse og analyse apoptose i MKN-45 og SGC-7901 cellelinjer ble utført for å evaluere effektene av THBS2 for magekreft in vitro
.
Resultatene
85,71% (12 av 14) mage kreft vev uttrykt bemerkelsesverdig lavere THBS2 både mRNA og protein nivåer enn de tilsvarende normale kontroller. Konsekvent, vev microarray (TMA) Resultatene viste THBS2 nivåer ble også hemmet i mage kreft vev sammenlignet med normale kontroller. Videre observerte vi at pasienter med høyere nivåer av THBS2 var signifikant korrelert med mer gunstig prognose mens redusert THBS2 uttrykk var assosiert med dårligere histologiske graderinger av magekreft. I tillegg vår in vitro eksperimenter videre vist at overekspresjon av THBS2 kan hindre både spredning rente og røret dannelsen av menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVECs) i MKN-45 og SGC-7901 cellelinjer.
Konklusjon
Vår studien antyder THBS2 er abnormt uttrykt i magekreft og spiller en avgjørende rolle i kreft progresjon, noe som kan være en potensiell prognose prediktor for magekreft.
nøkkelord
THBS2 mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP Angiogenese Prognostic biomarkør Innledning
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en svært aggressiv og dødelig kreft. Totalt 952,000 nye magekrefttilfeller og 723,000 dødsfall ble anslått å ha skjedd i 2012, sto for 6,8% av det totale antallet tilfeller og 8,8% av totalt antall dødsfall. Videre Både nye tilfeller og dødsfall av magekreft i Kina, rangert første globalt, og står for over 40% av det i verden [1]. Derfor store bekymringer er hevet for studier av magekreft
. Thrombospondins (THBSs) er en familie av multidomain og matricellular Ca 2 + -binding glykoproteiner utskilles av stromale fibroblaster, endotelceller og immunceller [2]. De har minst fem medlemmer som er kodet av uavhengige gener. Ved å binde med mange target proteiner, deltar de i ulike biologiske prosesser som angiogenese, cellemotilitet, apoptose, cytoskeletal organisasjon, og tjene som interaksjonsplattformer i den ekstracellulære matriks (ECM) [3, 4]. Spesielt THBS1 og THBS2 er spesielle i denne familien for deres type I repetisjoner og begge er i hovedsak vist som hemmere av angiogenese [5, 6], en viktig del av kreftforskningen [7-9]. Microvessel tetthet (MVD) er en mye brukt parameter for å beregne graden av angiogenese i svulster med CD34 er den microvessel maker i magekreft [10]. Basert på tidligere funn [2], vi legger frem en hypotese i vår studie at det kan også påvirke angiogenese i magekreft.
Tillegg angiogenese, har THBS2 blitt rapportert til å samhandle med flere cellereseptorer, vekstfaktorer og ECM proteiner samt regulere apoptose, celleproliferasjon og adhesjon [11]. Hos kreft forskere, har økende oppmerksomhet vært rettet mot THBS2. Tokunaga et al. [12] fant at THBS2 uttrykkes hos pasienter med tykktarmskreft, viste en betydelig lavere risiko for levermetastaser og tumor vaskulariteten sammenlignet med pasienter med tumorer var THBS2 mangel. Videre De FRAIPONT et al. [13] har vist at THBS2 ble signifikant korrelert med kliniske status og utfall, og for de fleste tumorer var det en invers korrelasjon mellom THBS2 ekspresjonsnivået og graden av deres malignitet. I tillegg THBS2 spilte også en sentral rolle i brystkreft [14], myelom [15], malignt melanom [16], prostata kreft [17] og lunge adenokarsinom [18, 19]. I magekreft, kan andre medlemmer av THBSs, THBS1 [20] og THBS4 [21] være som en prognostisk biomarkør eller en kraftig markør for diffus-type mage adenokarsinomer. Men den detaljerte funksjon THBS2 i magekreft og dens implikasjoner for klinisk diagnose fortsatt dystre. Dermed har vi forsøkt å avsløre den kliniske betydningen av THBS2 og dens effekt på magekreft.
For å bekrefte vår nevnte hypotese, vi undersøkte THBS2 uttrykk nivåer i menneskelige mage kreft vev og tilsvarende normale vev og deretter utforsket mulige sammenhenger mellom uttrykk for THBS2 og clinicopathological funksjoner, klinisk prognose og MVD telling hos pasienter med magekreft. I tillegg ble kolonidannelsesbestemmelsen, endotelial celle rør formasjonsanalyse, cellemigrering analysen og apoptose analyse utført i MKN-45 og SGC-7901 cellelinjer for å utforske den in vitro
virkning av THBS2 i magekreftceller.
Resultater
Pasient egenskaper og kliniske resultater
i denne studien, innrullert vi 129 kvalifiserte pasienter, som besto av 101 menn og 28 kvinner. Alderen på pasientene varierte fra 29 til 80 år (y) med en median alder på 61y. Alle clinicopathological egenskaper er oppsummert i tabell 1. Median total overlevelse (OS) av pasientene var 57 måneder, og mener OS var 44,01 [95% konfidensintervall (KI) 39.78-49.24 måneder] .table en forening blant clinicopathological variabler og THBS2 uttrykk og total overlevelse av magekreftpasienter
variabler Book Negativ
Positiv
Totalt ant
P valueA
Total overlevelse OS
Log-Rank Pb
HR (95% CI)
Nei. (%)
Nei. (%)
Age (y )
0,112
0,743
< 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (referanse)
≥61
35 ( 53,0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67 til 1,77)
Kjønn
0,831
0,405
Mann fra 47 (46,5)
54 ( 53.5)
101
1 (referanse)
Kvinne
12 (42,9)
16 (57,1)
28
0,76 (0,40 til 1,45)
Histologisk klasse
0,005
0,011
Vel og moderat
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (referanse)
Fattige og andre
35 (60,3 )
23 (39,7)
58
1.89 (01.16 til 03.09)
Tumor plassering
0,419
0,204
Øvre
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (referanse)
Middle
15 (53,6)
13 (46,4)
28
1,66 (0,86 til 3,18)
Nedre
17 (50,0)
17 (50,0)
34
1,90 (0,90 til 4,01)
Dybde invasjon
0.271
0,001
T1-T2
9 ( 34.6)
17 (65,4)
26
1 (referanse)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11,60 (2,83 -47,45)
lymfeknutemetastaser
0,454
< 0,001
Fraværende
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (referanse)
Presenter
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5,16 (2,46 til 10,84)
TNM stadium
0,283
< 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (referanse)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52 til 14,49)
Fet verdi er statistisk signifikant ved P
< 0.05, HR hazard ratio.
En P
verdi av clinicopathological variabler og THBS2 uttrykk.
B, P
verdien av tilknytning mellom clinicopathological variabler og total overlevelse av mage kreftpasienter.
THBS2 er nedregulert i magekreft
for å bestemme uttrykket nivåer av THBS2 i magekreft, må vi først evaluert mRNA uttrykk nivåer av THBS2
i magekreft av kvantitativ real-time i det andre kullet. Denne kohorten av prøver, som er nevnt i metoder, inkludert 14 human magekreft og de tilsvarende normale vev. Som vist i figur 1A, THBS2
nivåer var merkbart lavere 85,7% (12 av 14) av de magekreft vev enn de normale kontroller, mens de gjenværende to par av prøvene viste det motsatte. Så, vi har oppdaget at protein uttrykk nivåer av THBS2 via western blot i samme årsklasse. Som vist i Figure1B og C, observerte vi at THBS2 protein ekspresjonsnivåer ble redusert i 85,7% (12 av 14) av tumorprøvene sammenlignet med den tilsvarende kontroll, mens prøve 5 og 11 vises omvendt. For å bekrefte dette funnet, vi videre utført en vev microarray (TMA) og vurdert de protein uttrykk nivåer av THBS2 henhold til immunoreaktivitets score (IRS) for hver prøve. Vi har funnet THBS2 proteiner ble hovedsakelig uttrykt i cytoplasms om gastriske celler (figur 2A), og i overensstemmelse med resultatene av Western blot nivåene av THBS2 var signifikant hemmet i magekreft vev sammenlignet med normale kontroller (figur 2B, P <0,05). våre resultater Til sammen viser at THBS2 er nedregulert i magekreft i både mRNA og proteinnivåer. Figur 1 mRNA og protein ekspresjon nivå av THBS2 i 14 magekreft vev og den tilsvarende normale vev. (A) Relative mRNA-ekspresjon av THBS2 ble påvist ved kvantitativ real-time PCR. Ekspresjon av normale vev ble normalisert til 1,0 som angitt. (B) Den densitometri analyseresultatene av THBS2 båndene ble normalisert til GAPDH ved hjelp av Image J. Ekspresjon av normale vev ble normalisert til 1,0 som angitt. (C) Relativ protein ekspresjon av THBS2 ble anslått ved Western blot-analyse.
Figur 2 Immunhistokjemisk analyse av THBS2, CD34. (A) Representative bilder av THBS2 og CD34 uttrykk: N1, N2, N3, N4, normal mage vev (N); M1, M2, M3, M4, moderat differensierte (M); P1, P2, P3, P4, dårlig differensiert (P). Forstørrelse: 100 × (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) og 400 × (N2, M2, P2). (B) Sammenligning av THBS2 uttrykk for magekreft (n = 129) og normal mage vev (n = 24) i TMA. Den THBS2 Ekspresjonsnivået presentert som gjennomsnitt ± SEM. (C) Sammenligning av MVD i THBS2-positive magekreft gruppe (n = 70) og THBS2-negative magekreft gruppe (n = 59). Dots representerer MVD av hver prøver. Verdier er gjennomsnitt ± SEM.
THBS2 uttrykk nivåer er inverse korrelert med histologiske graderinger av magekreft
For ytterligere å klargjøre den kliniske betydningen av THBS2, analyserte vi forholdet mellom THBS2 protein uttrykk og kliniske funksjoner, inkludert alder, kjønn, histologisk grad, tumor plassering, dybde av invasjon, lymfeknutemetastase og TNM stadium av magekreftpasienter i THBS2-positive og negative grupper. Som vist i tabell 1, fant vi en signifikant invers korrelasjon med de histologiske graderinger av magekreft (P
< 0,01). De histologiske graderinger av pasienter i THBS2-positive gruppen var mer sannsynlig å være godt og moderat, mens pasienter i THBS2-negative gruppe tendens til å være fattig og andre. Men vi klarte ikke å finne noen betydning statistisk mellom uttrykket nivåer av THBS2 og andre kliniske parametre. Samlet våre funn tyder på at THBS2 er inverse korrelert med histologisk grad av magekreft.
THBS2 uttrykk nivåer er inverse korrelert med MVD i magekreft
Tidligere rapporter forstått THBS2 kunne regulere tumor angiogenese [6], men ingen ble rapportert i magekreft. Derfor spurte vi om det var noen sammenheng mellom MVD og THBS2 uttrykk nivåer samt andre kliniske parametre i våre kliniske prøver. MVD i 129 magekreft prøvene gikk fra 0 til 120, med en median på 40 og bety fra 48,12 ± 28,99 (gjennomsnitt ± SD) i henhold til immunoreaktiviteten av CD34 i vår TMA. Som vist i figur 2C, ble THBS2 signifikant korrelert med MVD. MVD i THBS2-negative gruppe var mye høyere enn i THBS2-positive gruppe (P
< 0,001). Men vi kunne ikke observere noen statistiske forskjeller mellom MVD og andre clinicopathologic funksjoner, inkludert klinisk prognose i våre prøver (data ikke vist). I konklusjonen, våre funn viser at THBS2 er inverse korrelert med MVD i magekreft.
THBS2 er signifikant assosiert med klinisk prognose av mage kreftpasienter
å undersøke forholdet mellom THBS2 uttrykk og klinisk prognose av magekreftpasienter, vi gjennomførte overlevelse analyser av univariat og multivariat Cox proporsjonal farer regresjonsmodell. Som vist i tabell 1, fant vi histologiske grad, dybden av invasjon, lymfeknutemetastase og TNM stadium var statistisk signifikante faktorer i OS i univariat analyse. Men siden TNM stadium inneholder også informasjon om dybden av invasjonen og lymfeknutemetastase, vi videre utført multivariate overlevelsesanalyser med justering for histologisk grad og TNM stadium. Vi la merke til at TNM stadium (P
< 0,001) og THBS2 uttrykk (P
< 0,01) var begge uavhengige prognostiske faktorer for vurdering av pasientens utfall. Høyere TNM stadium var en risikofaktor for lengre OS [P
< 0,001, HR (hazard ratio) = 7,23, 95% KI 3,55 til 14,69) og forhøyet uttrykk for THBS2 ble enda en gunstig faktor for lengre OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% KI 0,31 til 0,85). Videre Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ytterligere bekreftet at THBS2 uttrykk var signifikant korrelert med kliniske utfall (figur 3, P < 0,01, n = 129). Pasienter med lavere THBS2 uttrykk vises en vesentlig kortere OS [median 36 måneder, mener 40,07 ± 3,65 (gjennomsnitt ± SE) måneder], mens pasienter med høyere THBS2 uttrykk viste en gunstig prognose [median 59 måneder, mener 53,70 ± 2,95 (gjennomsnitt ± SE ) måneder]. Sammen våre resultater viser THBS2 er signifikant assosiert med klinisk prognose av magekreftpasienter, som kan bli en prognostisk markør for magekreft. Figur 3 Kaplan-Meier overlevelsesanalyser med log-rank test for total overlevelse (OS). Kaplan-Meier analyse av sammenhenger mellom ulike THBS2 uttrykk nivåer og OS i 129 mage kreftpasienter.
Overuttrykte av THBS2 hemmer veksten av magekreftceller in vitro
Fordi THBS2 var signifikant nedregulert i mage kreft, inferred vi at THBS2 kan hemme vekst, fremme apoptose og forbedre migrasjon evne mage kreftceller. For å bekrefte vår hypotese, vi først bygget en lentiviral vektor til stabile ekspress THBS2 transkripsjoner i mage kreft cellelinjer. Endret ekspresjon av THBS2 i 293 T-celler ble bekreftet ved western blot-analyse (figur 4A). Så, vi valgte MKN-45 og SGC-7901 cellelinjer for vår in vitro
studien fordi mRNA uttrykk nivåer av THBS2 var lavere enn andre (data ikke vist). Vi utførte kolonidannelse analyse for å evaluere effekten av THBS2 på veksten av MKN-45 og SGC-7901 celler. Som vist i figur 4B, har vi funnet celler med overekspresjon THBS2 dannet signifikant færre kolonier på bløt agar sammenlignet med de fra kontrollvektorinfiserte celler (P
< 0,01 for MKN-45-celler og P
< 0,001 for SGC-7901 celler, henholdsvis). Videre undersøkte vi de apoptose nivåer mellom de to gruppene i begge cellelinjer og oppdaget at THBS2 fremmet apoptose i SGC-7901 celler (Figur 4F), men ikke i MKN-45 celler (tilleggsfiler 1: Figur S1 A). Og det var ingen signifikante forskjeller mellom de to gruppene i SGC-7901 og MKN-45 cellelinjer i cellevandring i henhold til transwell analyser (tilleggsfiler 1: Figur S1B og C). Oppsummert våre data støtter at THBS2 hindrer vekst av magekreftceller in vitro muligens via regulering av apoptose. Figur 4 Overuttrykte av THBS2 hemmet spredning av magekreftceller, undertrykte angiogenese av magekreft, og fremmet apoptose i SGC-7901 cellelinje in vitro. (A) Western blot-analyse av flagg i 293 T-celler med overekspresjon THBS2. (B) Colony nummer analyse for MKN-45 og SGC-7901 celler med THBS2 overekspresjon og negativ kontroll. Verdier er gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige forsøk. (C) bilder fra kolonidannelsesbestemmelsen. (D) AngiogenicIndexCh1 analyse av endotelial celle rør formasjonsanalyse. Verdier er gjennomsnitt ± SD. (E) bilder fra endotelceller rør formasjonsanalyse. (F) Analyse av apoptose i MKN-45-cellelinje. Verdier er gjennomsnitt ± SD.
THBS2 undertrykker magekreft angiogenese in vitro
THBS2 er kjent som en hemmer av angiogenese [2]. Å gi bevis av THBS2 regulerer angiogene fenotype av magekreft, ble endotelceller tube formasjons analyser utført. Som vist i figur 4E og D, i begge MKN-45 og SGC-7901 cellelinjer, humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) dyrket med mediet fra THBS2-overekspresjon magecancerceller viste signifikant lavere AngiogenicIndexCh1 enn den negative kontroll (P
< 0,05 for MKN-45 celler og P
< 0,001 for SGC-7901 celler, henholdsvis). Kollektivt, våre resultater antyder at THBS2 undertrykker angiogenese av magekreftceller in vitro
.
Diskusjon
THBS2 er kjent som en naturlig potent hemmer av angiogenese, og en modulator av remodelleringsprosessen [22, 23]. Men ingen av de tidligere undersøkelsene drøftes roller THBS2 og klinisk betydning i magekreft.
Først fant vi ut at mRNA og protein uttrykk nivåer av THBS2 ble nedregulert i de fleste prøvene. Men en tidligere forskning rapportert THBS2 mRNA uttrykk nivåer i magekreft var høyere enn normalt kontroll [24]. Tatt i betraktning den begrensede prøvestørrelsen i denne studien, som innlemmes bare 6 vevsprøver, er det mulig for denne forskjellen skyldes tumor heterogenitet for to par av våre andre kohort har også viser de samme mønstre. Likevel vår påfølgende resultat av TMA, større i utvalgsstørrelsen, var i samsvar med resultatet fra den andre kohort. Til sammen har vi antatt at THBS2 var mer sannsynlig å bli nedregulert i magekreft celle versus normal slimhinne.
Videre har vi også lagt merke til at den relative uttrykk av prøvene viste forskjellig i mRNA og protein nivå. Mangler tilstrekkelige bevis, antyde vi at funksjonen av THBS2 innen mage kreftceller kan være regulert av noen intracellulære oppstrøms signal faktorer, protein ubiquitinering, og andre mulige måter, som kan påvirke proteinnivåer THBS2 og fenotyper i mage kreftceller. Og videre vekt kan bli satt på dette interessante fenomenet. Ikke desto mindre viste de fleste av prøvene fra våre andre kohort de samme uttrykk mønstre mellom mRNA og proteinnivåene.
Det andre våre data viste at THBS2 kunne fremme apoptose bare i SGC-7901-celler, men ikke i MKN-45-celler. Tidligere undersøkelser har vist at et N-terminalt fragment av rekombinant THBS2 kunne aktivere CD36-mediert endotel celle apoptose [14], og kombinasjonen av CD36 og THBS2 kunne aktivere caspase signalveien [25]. Dermed antok vi at heterogenitet av de to cellelinjene som brukes i vår studie, som differensiert CD36 uttrykk, kan delvis være årsaken til ulike nivåer av apoptose indusert av THBS2, som kalles for nærmere undersøkelser.
Tredje våre resultater viste at THBS2 kunne undertrykke angiogenese av magekreft. Det er kjent at tumor proliferasjon, invasjon eller metastase er avhengig av angiogenese [26]. Og basert bevisene støtter våre funn og peker på at de mulige mekanismer som THBS2 hemmer angiogenese: 1) en apoptose-uavhengig måte ved å indusere endotelceller apoptose, cellesyklus arrestere og mink av endotelceller migrasjon [27], 2) avhengig av caspase signale veien aktiveres med CD36 [28]. 3) som virker som ko-reseptorer for LDL-reseptor-relatert protein (LRP1), som kan fjerne komplekser av THBS2 med matriks-metalloproteinaser-2, -9 eller vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) fra den pericellulær miljø av mesenchymale celler [ ,,,0],29-32].
Endelig MVD er en av de mest brukte parametere for å vurdere graden av tumorangiogenese og tidligere studier har funnet MVD kan være en uavhengig prognostisk faktor i magekreft og andre tumor [33-35]. I vår studie fant vi MVD var signifikant korrelert med THBS2 protein uttrykk (P
< 0,001) i magekreft, men ikke med kliniske og kliniske prognose. Resultatene viste at THBS2 kan påvirke angiogenese i magekreft, likevel, på grunn av ingen sammenheng mellom MVD og prognose i våre prøver, vi mistanke om at høyere THBS2 uttrykk som indikerer lengre overlevelse var ikke bare gjennom å hemme angiogenese av magekreft, andre mekanismer som regulerer ECM omskolere [23] og spredning rate av mage kreft celler kan også være grunner som trenger ytterligere forskning for å utforske.
Samlet våre funn understreket på de viktige rollene THBS2 i prognostiske betydninger samt tumor spredning og angiogenese i mage kreft. Disse dataene antyder THBS2 kan være en viktig prognostisk markør for mage kreftpasienter. Videre basert på effekter av THBS2 på tumorutvikling og angiogenese, våre undersøkelser gir verdifulle ledetråder for klinisk praksis for å utvikle molekylære hemmer legemiddel bruker mål utledet fra biologisk kunnskap gitt av THBS2 signatur.
Konklusjon
Vår studie presenterer den første linjen i bevisene for at THBS2 uttrykk er nedregulert både mRNA og proteinnivåer og redusert THBS2 uttrykk er assosiert med dårlig histologisk grad av magekreft. Avgjørende, har overekspresjon av THBS2 en signifikant sammenheng med gunstig prognose av mage kreftpasienter. På den annen side, THBS2 påvirkes prognose i magekreft kan ikke bare gjennom regulering av angiogenese, men i noen andre måter som regulerer ECM omskolere og inhibere proliferasjonen av magekreftceller. Disse funnene tyder på at THBS2 kan være et potensielt viktig rolle i patogenesen og progresjon av magekreft. Vi bekrefter at, med den gradvise dybdestudier av THBS2, kan det være en lovende nyttig og enkel biomarkør for å forutsi klinisk utfall for mage kreftpasienter.
Metoder
Pasienter og prøver vev
I denne studien har vi innlemmet to årskull av prøver. Det første kullet inneholdt 129 formalinfiksert, parafin forankret menneskelig magekreft og 24 tilfeldig utvalgte normale mage vev. De ble fortløpende rekruttert mellom desember 2006 og mai 2008 fra Institutt for generell kirurgi, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei, Kina. Disse prøvene ble inkorporert i TMA for immunhistokjemisk farging. Histologiske trekk ved disse prøvene ble bekreftet av patologer. Patologisk TNM staging ble evaluert i henhold til 2010-kriteriene fra det amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC). Den andre kohort var sammensatt av 14 mage kreftpasienter som har gjennomgått tumorreseksjon terapi på den åttende Institutt for generell kirurgi, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University. Den friske magekreft vev og tilsvarende normal slimhinne (minst 5 cm fjernt fra tumor kant) ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C frem til ved hjelp av for Kvantitativ real-time PCR og Western blot-analyse. Pasienter i begge kullene mottok ikke preoperativ kjemoterapi og /eller strålebehandling. Skriftlig informert samtykke ble gitt av alle deltakerne. Alle prøvene ble håndtert anonymt i henhold til de etiske standarder. Denne studien ble gjennomført med godkjenning av Etisk komitéen av sykehuset.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra den andre kohort hjelp Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. cDNA ble syntetisert av tilfeldige primere og Hevet II revers transkriptase (Toyobo, Osaka, Japan). Primerne anvendt for amplifikasjon for THBS2: forover primer 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'og revers primer 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble amplifisert i det samme q-PCR ved anvendelse av primere som en intern kontroll: forover primer 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'og revers primer 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. Reaksjonen kjørte på ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA) i nærvær av SYBR-grønn fargestoff (Toyobo, Osaka, Japan). Reaksjonsbetingelsene var en denaturering program (95 ° C i 5 minutter), og en forsterkning og kvantifisering program for 40 sykluser (95 ° C i 15 s og 60 ° C i 45 s). Hver prøve ble testet i triplikater, og et smeltekurve analyse av hver prøve ble benyttet for å undersøke spesifisiteten av forsterkning. Ekspresjonsnivået ble bestemt som et forhold mellom THBS2 og internkontrollen GAPDH i mengder av mRNA beregnet ved å sammen CT metode.
Protein ekstraksjon og Western blot
Totalt protein ble ekstrahert fra 14 frosset magekreft og den tilsvarende normale mucosavev av is i radio immunoprecipitation analysen Lysis Buffer (RIPA, Beyotime institutt for bioteknologi, Jiangsu, Kina), og målt ved hjelp av en BCA protein assay kit (Beyotime institutt for bioteknologi, Jiangsu, Kina). Lysatet ble sentrifugert ved 12000 rpm i 5 minutter, og supernatanten ble oppvarmet ved 100 ° C i 5 minutter. Deretter ekvivalente proteiner av hvert par prøver ble separert på 8% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel-elektroforese og elektrooverført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, Massachusetts). Etter Den blokkerte med TBST inneholdende 5% skummet melk i ved romtemperatur i en time, ble membranene blottet med anti-THBS2-antistoff (1: 1500; Novus) og anti-Flag (1: 3000; Sigma). Fulgt membraner inkubasjon med pepperrot peroksidase-merket anti-kanin og anti-mus IgG som det sekundære antistoff (Beyotime Institute of Biotechnology). Anti-GAPDH-antistoff (1: 4000; Aogma) ble anvendt som en lasting kontrollantistoff. De bundne antistoffer ble detektert med den forbedrede chemiluminescence metoden.
Immunohistochemistry og TMA analyse
Magekreft og normal mageslimhinnen prøver ble formalinfiksert, parafininnebygd, og ble brukt til å konstruere en vev TMA. H & E-fargede objektglass ble screenet for å identifisere optimal intratumoural vev for analyse. 4-mikrometer tykke seksjoner ble bakt ved 60 ° C i 1 time, deparaffinised med xylener, og rehydrert i gradert etanol for å destillert vann. Antigen gjenfinning ble oppnådd med å plassere seksjonene med citratbuffer i et ris damper i 30 minutter. Å slukke den endogen peroksidase-aktivitet, ble delene behandlet med 3% H 2o 2 i metanol. Deretter anvendte vi 1% bovint serumalbumin for å blokkere ikke-spesifikk binding. Anti-THBS2 antistoff (Novus, 1: 2000) og anti-CD34 (Abcam, 1: 250) ble inkubert med seksjonene ved 37 ° C over natten og deretter inkubert med pepperrot peroksidase-merket anti-kanin IgG som det sekundære antistoff (Liv Technologies). Til slutt ble lysbilder plassert på en Autostainer lenke instrument og fortsette med farging. For negative kontroller ble de primære antistoffer erstattet med normalt kaninserum. Den endelige effektive immunhistokjemisk farging ble vurdert av to uavhengige patologer uten å kjenne den informasjon av pasienter i henhold til fargeintensitet og graden av farging. Tissue delen ble scoret som prosentandelen av farget cytoplasma i magekreft kjertel celler og normale kjertelceller (0 poeng for ingen celler farget, 1 poeng for < 25%, 2 poeng for 25-75%, og 3 poeng for > 75 % av cellene farget), og den fargeintensitet av immunoreaktivitet ble gradert på en skala fra 0 til 3. immunoreaktivitet stillingen (IRS) ble ført fra multiplikasjon av begge parametrene. Prøvene ble scoret som følger: negativ (IRS = 0 ~ 2), positive (IRS = 3 ~ 9)
MVD telle
Immunhistokjemisk farging av CD34 og allment aksepterte kriterier som utføres av Weidner et al.. [36] ble anvendt for MVD telling. Eventuelle fargede endotelceller eller endotele cellegrupper ble skilt fra tilstøtende mikrokar, og tykkelsen av hvert kar veggen over 2,75 um ville være utelukket. Tre separate seksjoner som inneholder hot-spots (der det høyeste antall diskrete microvessels ble farget) i hver prøve av TMA ble valgt i lave forstørrelser (100 ×) under et lysmikroskop (Leica, Tyskland). Deretter microvessels ble talt i hver seksjon i høy forstørrelse (200 ×). P
<

• Lnc RNA hotair fungerer som en konkurrerende endogen RNA til å regulere HER2 uttrykk ved snyltende MIR-331-3p i mage cancer
• Proteomikk endring i gastic adenokarsinomer fra japansk patients