Le szabályozása Thrombospondin2 jósolja rossz prognózisú betegeknél gyomorrák

Le szabályozása Thrombospondin2 jósolja rossz prognózisú betegeknél gyomorrákos katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa Thrombospondins (THBSs) egy család többtartományos és kiválasztódik matricellular Ca 2 + -kötő glikoproteinek, amely legalább öt tagja által kódolt független gének. Ennek THBSs családtag, Thrombospondin2 (THBS2) leírták, hogy szabályozzák az angiogenezis. Mindazonáltal a funkciók és a klinikai jelentősége THBS2 még tisztázatlan marad a gyomorrák.
Módszerek
A mRNS és fehérje expressziós szintjét THBS2 értékelték 14 párosított gyomorrák példányok és a megfelelő normál nyálkahártyák kvantitatív valós idejű PCR-rel és Western blot analízissel. Immunhisztokémiai THBS2 és CD34 populációs alapú szöveti microarray, 129 gyomorrákos esetek értékelésére használt prognosztikai jelentősége THBS2 és mikroerek sűrűség (MVD) minden egyes minta. Túlélési analíziseket Kaplan-Meier módszerrel és Cox-féle arányos kockázati modellt. Telepképző assay, belhámsejt-cső kialakulását vizsgálatban sejt migrációs vizsgálattal és az apoptózis elemzése MKN-45, SGC-7901 sejtvonalak végeztünk, hogy értékelje a hatását THBS2 a gyomorrák in vitro
.
Eredmények
85,71% (12 14) gyomorrák szövetek kifejezett lényegesen kisebb THBS2 mind mRNS, mind fehérje szinten, mint a megfelelő normál kontroll. Következetesen, szöveti microarray (TMA) eredményei azt mutatták, THBS2 szinteket is gátolta a gyomorrák szövetekben, mint a normál kontroll. Sőt, azt figyeltük meg, hogy a betegek a magasabb THBS2 szignifikánsan korrelált kedvezőbb prognózisú, míg csökkent THBS2 kifejezés arra járó szegényebb szövettani fokozatú gyomorrák. Továbbá, a mi az in vitro kísérletek bemutatták továbbá, hogy overexpressziója THBS2 gátolhatja mind a proliferációs sebesség és a cső kialakulását Humán köldökvéna endoteliális sejteket (HUVEC) a MKN-45, SGC-7901 sejtvonalak.
Következtetés
mi tanulmány azt sugallja, THBS2 van abnormálisan expresszált a gyomorrák és kritikus szerepet játszik a rák progressziójában, ami lehet egy potenciális prognózis előrejelzője gyomorrák.
kulcsszavak
THBS2 gyomorrák angiogenezis prognosztikai biomarker Bevezetés
gyomorrák egy nagyon agresszív és halálos rosszindulatú. Összesen 952.000 új gyomorrák esetek és 723.000 halálesetet becslések szerint történt 2012-ben, a számviteli 6,8% a teljes esetek 8,8% -a az összes halálozás. Továbbá mindkét új megbetegedések és halálesetek gyomorrák Kínában, rangsorolt ​​1. globálisan, számviteli több mint 40% -a, amely a világon. [1] Ezért nagy aggodalom merül fel a kutatások gyomorrák. Katalógusa Thrombospondins (THBSs) egy család többtartományos és matricellular Ca 2 + -kötő glikoproteinek kiválasztódik a stroma fibroblasztok, endothelialis sejtek és az immunsejtek [2]. Ők legalább öt tag által kódolt független gének. Azáltal kötő számos célfehérjék, részt vesznek különböző biológiai folyamatok, mint például az angiogenezis, a sejtek motilitását, az apoptózis, citoszkeletális szervezet, és szolgálhatnak interakciós platformok az extracelluláris mátrix (ECM) a [3, 4]. Nevezetesen, THBS1 és THBS2 különleges ebben a családban való típusú ismétlődik, és mindkettőt elsősorban mutatjuk angiogenézis- [5, 6], az egyik legfontosabb része a rákkutatás [7-9]. Mikroerek sűrűségét (MVD) egy széles körben használt paraméter becslésére fokú angiogenezis tumorok CD34 hogy a mikroerek készítő gyomorrákban [10]. Alapján az előző megállapítások [2], mi előadott feltevés Tanulmányunkban hogy kihathat angiogenezis gyomorrákban.
Mellett angiogenezis, THBS2 leírták, hogy kölcsönhatásba több sejt receptorok, növekedési faktorok és az ECM fehérjék valamint szabályozzák az apoptózist, a sejtproliferációt és a tapadás [11]. A daganatos betegségben kutatások növekvő figyelme összpontosítottak THBS2. Tokunaga et al. [12] megállapította, hogy THBS2 kifejezett vastagbélrákos betegek esetében szignifikánsan kisebb a kockázata a máj metasztázis és tumor erezettség képest a betegek, akiknek tumora THBS2 hiány. Továbbá, a De Fraipont et al. [13] kimutatták, hogy THBS2 szignifikánsan korrelált a klinikai állapot és eredmény, és a legtöbb daganat volt egy fordított korrelációt THBS2 expressziós szintjét és mértékét a rosszindulatú. Ezen túlmenően, THBS2 szintén kulcsfontosságú szerepet játszott az emlőrák [14], mieloma [15], a rosszindulatú melanoma [16], prosztatarák [17] és a tüdő adenocarcinoma [18, 19]. A gyomorrák, más tagjai THBSs, THBS1 [20] és THBS4 [21] lehet, mint egy prognosztikai biomarkerként vagy egy erős markert diffúz típusú gyomor adenocarcinoma. Azonban a részletes funkciója THBS2 gyomorrákban és annak következményei a klinikai diagnózis továbbra is lehangoló. Így próbálta leleplezni a klinikai jelentősége THBS2 és annak hatása a gyomorrák.
, Hogy ellenőrizze a fent említett hipotézis megvizsgáltuk a THBS2 expressziós szinteket humán gyomorrák szövetek és a megfelelő normál szövetekben, majd feltárni az esetleges összefüggéseit kifejezése THBS2 klinikopatológiai jellemzők, klinikai prognózis és a MVD számlálás gyomorrákos betegeknél. Ezen túlmenően, telepképző assay, belhámsejt-cső kialakulását vizsgálatban sejt migrációs vizsgálattal és az apoptózis analízis végeztük MKN-45, SGC-7901 sejtvonalak, hogy vizsgálja in vitro
hatása THBS2 a gyomor rákos sejtekben.
Eredmények katalógusa Betegjellemzők és klinikai eredmények
a jelen tanulmányban azt beiratkozott 129 beteg közül amely abból állt, 101 férfi és 28 nő. A betegek életkora között volt 29-80 év (y), a medián életkora 61y. Minden klinikopatológiai jellemzők 1. táblázatban foglaltuk össze A medián teljes túlélés (OS) a betegek 57 hónap, az átlagos OS 44.01 [95% -os konfidencia intervallum (CI) 39,78-49,24 hónap] .table 1 Szövetsége között klinikopatológiai változók és THBS2 kifejezés és teljes túlélése gyomorrákos betegek katalógusa változók
Negatív
Pozitív Matton Összesen No. Matton P értéka Matton A teljes túlélés OS Matton logrank Pb Matton HR (95% CI) Matton Nem. (%) hotelben nincs. (%) hotelben Age (y ) hotelben 0,112 katalógusa 0,743 katalógusa < 61 katalógusa 24 (38,1) hotelben 39 (61,9) hotelben 63 katalógusa 1 (referencia) hotelben ≥61 katalógusa 35 ( 53.0) hotelben 31 (47,0) hotelben 66 katalógusa 1,09 (0,67-1,77) hotelben nemek katalógusa 0.831 katalógusa 0,405 katalógusa Férfi katalógusa 47 (46,5) hotelben 54 ( 53.5) hotelben 101 Pg: 1 (referencia) fiatal női katalógusa 12 (42,9) hotelben 16 (57,1) hotelben 28 katalógusa 0,76 (0,40-1,45) hotelben szövettani grade
0,005 katalógusa 0.011 katalógusa Nos, mérsékelt katalógusa 24 (33,8) hotelben 47 (66,2) hotelben 71 katalógusa 1 (referencia) hotelben Gyenge és egyéb katalógusa 35 (60,3 ) hotelben 23 (39,7) hotelben 58 katalógusa 1,89 (1,16-3,09) hotelben tumor helyét katalógusa 0.419 katalógusa 0,204 katalógusa Felső katalógusa 27 (40,3) hotelben 40 ( 59,7) hotelben 67 katalógusa 1 (referencia) hotelben Közép
15 (53,6) hotelben 13 (46,4) hotelben 28 katalógusa 1,66 (0,86-3,18) hotelben Alsó
17 (50,0) hotelben 17 (50,0) hotelben 34 katalógusa 1,90 (0,90-4,01) hotelben mélysége invázió
0,271 katalógusa 0,001 katalógusa T1-T2 katalógusa 9 ( 34.6) hotelben 17 (65,4) hotelben 26 katalógusa 1 (referencia) hotelben T3-T4 katalógusa 50 (48,5) hotelben 53 (51,5) hotelben 103 katalógusa 11,60 (2,83 -47,45) hotelben nyirokcsomó áttét katalógusa 0,454 katalógusa < 0,001 katalógusa Hiányzik katalógusa 17 (40,5) hotelben 25 (59,5) hotelben 42 katalógusa 1 (referencia)
Present katalógusa 42 (48,3) hotelben 45 (51,7) hotelben 87 katalógusa 5,16 (2,46-10,84) hotelben TNM katalógusa 0.283 katalógusa < 0,001 katalógusa I-II katalógusa 21 (39,6) hotelben 32 (60,4) hotelben 53 katalógusa 1 (referencia) hotelben III-IV
38 (50,0) hotelben 38 (50,0) hotelben 76
7,14 (3,52-14,49) hotelben Bold érték statisztikailag szignifikáns P katalógusa < 0,05, HR hazárd.
Egy P katalógusa értéke klinikopatológiai paramétereivel és THBS2 kifejezést. Katalógusa b, P katalógusa értéke közötti társulás klinikopatológiai paramétereivel és teljes túlélési gyomorrákos betegek. Katalógusa THBS2 le-szabályozott gyomorrák
Annak érdekében, hogy meghatározzuk a expressziós szintjét THBS2 a gyomorrák, először értékeltük az mRNS expressziós szintje THBS2
gyomorrák kvantitatív, valós idejű, a második kohorsz. Ez a csoport a minták, említett módszerek, benne 14 humán gyomorrák és a megfelelő normál szövetekben. Amint az 1A ábrán látható, THBS2
szintje jelentősen alacsonyabb 85,7% (12. 14), a gyomor rákos szövet, mint a normál kontrollok, míg a fennmaradó két pár a minták mutatott az ellenkezőjét. Ezután kimutattuk a fehérje expressziós szintjét THBS2 keresztül Western blot az ugyanabban a csoportban. Ahogy show Figure1B és C, megfigyeltük, hogy THBS2 fehérje expressziós szinteket csökkent 85,7% (12. 14) a tumor minták összehasonlítva a megfelelő kontroll, míg a minta 5 és 11 megjelenített fordítottan. Hogy erősítse meg ezt a megállapítást, akkor a további végeztünk szöveti microarray (TMA), valamint értékelte a fehérje expressziós szintjét THBS2 szerint immunreaktivitására pontszám (IRS) minden egyes minta. Találtunk THBS2 fehérjéket főleg kifejezett cytoplasms a gyomor-sejtek (2A ábra), és összhangban az eredménnyel a Western blot, a szintek THBS2 szignifikánsan gátolta a gyomorrák szövetekben összehasonlítva a normál kontroll (2B, P <0,05). Mindent összevetve, a vizsgálati eredmények azt bizonyítják, hogy a THBS2 van lefelé szabályozni a gyomorrák mind mRNS, mind fehérje szinten. Ábra 1 mRNS és fehérje expressziós szintjének THBS2 14 gyomorrák szövetek és a megfelelő normál szövetben. (A) relatív mRNS expresszióját THBS2 detektáltuk kvantitatív, valós idejű PCR-rel. Expressziója normális szövetek normalizáltuk 1,0 jelzett. (B) Az denzitometriás elemzés eredményeit THBS2 sávok normalizáltuk GAPDH az Image J. expressziója normális szövetek normalizáltuk 1,0 jelzett. (C) Relatív fehérje expresszióját THBS2 becsülték Western blot assay.
2. ábra immunhisztokémiai vizsgálatát THBS2, CD34. (A) reprezentatív képei THBS2 és CD34 expresszió: N1, N2, N3, N4, normál gyomor szöveti (N); M1, M2, M3, M4, közepesen differenciált (M); P1, P2, P3, P4, gyengén differenciált (P). Nagyítás: 100 × (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) és 400 × (N2, M2, P2). (B) összehasonlítása THBS2 expressziójának gyomorrák (n = 129) és a normál gyomor szövetekben (n = 24) a TMA. A THBS2 expressziós szint átlag ± SEM. (C) összehasonlítása MVD THBS2-pozitív gyomorrák csoport (n = 70) és THBS2-negatív gyomorrák csoport (n = 59). Pontok jelentik MVD az egyes mintákban. Az értékek átlag ± SEM. Katalógusa THBS2 expressziós szintjét inverz korrelációt a szövettani fokozat gyomorrák katalógusa további tisztázása klinikai jelentőségét THBS2 elemeztük a kapcsolatát THBS2 fehérje expresszió és a klinikai jellemzők, beleértve a kor, a nem, a szövettani grade tumor helye, mélysége invázió, nyirokcsomó-metasztázis és TNM gyomorrák betegek THBS2-pozitív, illetve negatív csoportok. Amint az 1. táblázatban látható, azt találtuk, egy szignifikáns fordított összefüggést a szövettani fokozat gyomorrák (p
< 0,01). A szövettani fokozat betegek THBS2-pozitív csoportban nagyobb valószínűséggel, hogy jól és a mérsékelt, míg a betegek THBS2-negatív tendenciózusan szegények és más. Mi azonban nem sikerült felfedezni bármilyen jelentősége statisztikailag közötti expressziós szintjét THBS2 és egyéb klinikai paramétereket. Együttesen, eredményeink arra utalnak, hogy THBS2 van inverz korrelációt a szövettani grade gyomorrák. Katalógusa THBS2 expressziós szintjét inverz korrelációban MVD gyomorrákban katalógusa korábbi jelentés hallgatólagos THBS2 lehetne szabályozni tumorangiogenezist [6], de egyik sem számoltak a gyomorrák. Ezért kértük, van-e korrelációt MVD és THBS2 expressziós szintje, valamint egyéb klinikai paraméter a klinikai mintákban. A MVD 129 gyomorrák példányok mozgott 0-120, a medián a 40 és jelenti a 48.12 ± 28.99 (átlag ± SD) szerint immunreaktivitást CD34 mi TMA. Amint a 2c ábrán látható, THBS2 szignifikáns korrelációt mutatott a MVD. Az MVD THBS2-negatív volt, sokkal nagyobb, mint a THBS2-pozitív csoportban (P katalógusa < 0,001). Azonban nem tudtuk megfigyelni semmilyen statisztika közötti különbségek MVD és más klinikai és patológiai jellemzői, beleértve a klinikai prognózisa a mi mintákat (az adatokat nem mutatjuk be). Összefoglalva, a felfedezések azt mutatják, hogy THBS2 van inverz korrelációban MVD gyomorrákban.
THBS2 szignifikánsan összefügg a klinikai gyomorrák prognózisa betegek katalógusa vizsgálata közötti kapcsolat THBS2 expresszió és a klinikai gyomorrák prognózisa betegek, végeztünk túlélési elemzések egyváltozós és többváltozós Cox-féle arányos kockázati regressziós modell. Amint az 1. táblázatban látható, azt találtuk, szövettani fokozatú, mélysége invázió, nyirokcsomó-metasztázis és TNM-beosztása statisztikailag szignifikáns volt tényezők OS egyváltozós elemzést. Azonban, mivel a TNM információkat is tartalmazza a mélységi invázió és a nyirokcsomó metasztázis, akkor a további elvégzett többváltozós túlélési elemzéseket kiigazítás a szövettani grade és TNM. Észrevettük, hogy TNM (P katalógusa < 0,001) és THBS2 kifejezés (P katalógusa < 0,01) egyaránt független prognosztikai tényezőinek értékelése a betegség lefolyása. Magasabb TNM volt a kockázati tényező a hosszabb OS [P katalógusa < 0,001, HR (relatív hazárd) = 7,23, 95% CI 3,55-14,69) és az emelkedett expressziója THBS2 volt még egy kedvező tényező hosszabb túléléssel (p
< 0,01, HR = 0,51, 95% CI 0,31-0,85). Sőt, Kaplan-Meier túlélési analízis továbbá megerősítette, hogy THBS2 expresszió szignifikánsan korrelált a klinikai eredmények (3. ábra, P < 0,01, n = 129). Betegek alacsonyabb THBS2 expressziós megjelenik egy lényegesen rövidebb OS [medián 36 hónap, azt jelenti, 40.07 ± 3,65 (átlag ± SE) hónap], mivel betegeknél, akiknek magasabb THBS2 expressziós mutatott kedvező prognózist [medián 59 hónap, azt jelenti, 53,70 ± 2,95 (átlag ± SE ) hónap]. Együtt, eredményeink bizonyítják THBS2 szignifikánsan összefügg a klinikai gyomorrák prognózisa betegek, ami válhat prognosztikai gyomorrák. 3. ábra Kaplan-Meier túlélési elemzések Log-rank próba a teljes túlélés (OS). Kaplan-Meier elemzést a korrelációk különböző THBS2 expressziós szintek és az OS 129 gyomor rákos betegeknél.
Túlexpressziója THBS2 gátolja a gyomorrák-sejtek in vitro Matton Mivel THBS2 szignifikánsan down-szabályozott gyomor- rák, mi következik, hogy THBS2 esetleg gátolja a növekedést, elősegíti az apoptózist és fokozza a migrációs képességét gyomorrák sejtek. Annak ellenőrzésére, Hipotézisünk első épített egy lentivirális vektor stabil kifejezett THBS2 átiratok gyomor rákos sejtvonalak. Megváltozott expressziója THBS2 293 T-sejtek is megerősítette a Western blot analízis (4a ábra). Ezután választottuk MKN-45, SGC-7901 sejtvonalakat in vitro
tanulmány, mert az mRNS expressziós szintje THBS2 alacsonyabb volt, mint mások (az adatokat nem mutatjuk be). Ezután végre a telepképző assay, hogy értékelje a hatását THBS2 a növekedés MKN-45, SGC-7901 sejtek. Ahogyan a 4b ábrán látható, azt találtuk, sejteket THBS2 overexpressziója képződött lényegesen kevesebb telepeket lágy agar összehasonlítottuk a kontroll vektor-fertőzött sejtek (p
< 0,01 MKN-45 sejtek és a p
< 0,001 SGC-7901 sejtek esetében). Emellett megvizsgáltuk a apoptózis szintje a két csoport között mindkét sejtvonal és felfedezte, hogy THBS2 támogatni apoptózist SGC-7901 sejtek (4F), de nem MKN-45 sejtek (Plusz fájl 1: Ábra S1A). És nem volt szignifikáns különbség a két csoport között az SGC-7901 és MKN-45 sejtvonalak sejt migráció szerint transzwell vizsgálatokban (további fájl 1: Ábra S1B és C). Összefoglalva, adataink alátámasztják, hogy THBS2 akadályozza a növekedést a gyomorrák sejtek in vitro esetleg keresztül apoptózis szabályozásában. 4. ábra túltermelése THBS2 gátolta elterjedése gyomorrák sejtek, elnyomta a angiogenezis gyomorrák, és támogatni apoptózist SGC-7901 sejtvonal in vitro. (A) Western-blot analízis a Flag 293 T-sejtek THBS2 overexpressziója. (B) Colony szám analízis MKN-45, SGC-7901 sejtek THBS2 túltermelése és a negatív kontroll. Az értékek átlag ± SD három független kísérlet során. (C) Képek telepképződése vizsgálatban. (D) AngiogenicIndexCh1 elemzése endotélsejt csőképződést vizsgálatban. Az értékek átlag ± SD. (E) Képek az endoteliális sejt csőképződést vizsgálatban. (F) Az apoptózis elemzése in MKN-45 sejtvonal. Az értékek átlag ± SD.
THBS2 elnyomja gyomorrák angiogenesis in vitro Matton THBS2 ismert inhibitora az angiogenezis [2]. Ahhoz, hogy a bizonyítékait THBS2 szabályozza angiogén fenotípusa gyomorrák, belhámsejt-cső kialakulását vizsgálatokat végeztünk. Ábrán látható módon a 4E és D, mindkét MKN-45, SGC-7901 sejtvonal humán köldökvéna endoteliális sejteket (HUVEC) tenyésztettünk a közeg THBS2-overexpresszió gyomorrák-sejtek szignifikánsan alacsonyabb AngiogenicIndexCh1, mint a negatív kontroll (P
< 0,05 MKN-45 sejtek és a P katalógusa < 0,001 SGC-7901 sejtek esetében). Együttesen, eredményeink arra utalnak, hogy THBS2 elnyomja az angiogenezis gyomorrák-sejtek in vitro
.
Megbeszélés
THBS2 ismert, mint egy természetes hatásos inhibitora az angiogenezis és a modulátor a remodelling folyamat [22, 23]. Azonban sem a korábbi kutatások tárgyalt szerepét THBS2 és a klinikai jelentősége a gyomorrák.
Először is, azt találtuk, hogy mRNS és fehérje expressziós szintjét THBS2 arra alulszabályozott legtöbb mintákban. Azonban az egyik korábbi kutatás számolt THBS2 mRNS expressziós szintek a gyomorrák magasabbak voltak, mint a normális kontroll [24]. Figyelembe véve a korlátozott mintaméret Ebben a vizsgálatban, amely beépített csak 6 szövetmintákban, lehetőség van ennek a különbségnek köszönhető tumor heterogenitás két pár a második kohorsz nem is mutatják, az azonos mintákat. Mégis a későbbi eredményeként TMA, nagyobb mintaméret, összhangban volt az eredménye a második kohorsz. Mindent összevetve, azt hitték, hogy THBS2 valószínűbb volt, hogy le van szabályozva a gyomorrák sejt versus normál nyálkahártya.
Sőt, azt is észrevette, hogy a relatív expresszióját a mintákat mutatott másként mRNS és fehérje szinten. Hiányzik elegendő bizonyíték, arra következtetünk, hogy a funkció a THBS2 belül gyomorrák sejtek lehet szabályozni bizonyos sejten belüli jelátviteli upstream tényezők, fehérje ubikvitináció, és más lehetséges modor, amely hatással lehet a fehérje szint THBS2 és a fenotípusok gyomorrák sejtek. És nagyobb hangsúlyt lehet helyezni ezt az érdekes jelenséget. Mindazonáltal, a többség a mintát a második kohorsz mutatja ugyanazt a kifejezést minták között mRNS és fehérje szinten.
Másodszor, adataink szerint THBS2 elősegítheti az apoptózist csak SGC-7901 sejtekben azonban nem MKN-45 sejtekben. Korábbi kutatások azt mutatták, hogy egy N-terminális rekombináns fragmensét THBS2 képes aktiválni a CD36-közvetített endothelsejtek apoptózisának [14], és a kombináció a CD36 és THBS2 lehetett aktiválja a kaszpáz jelátviteli [25]. Így feltételezhető, hogy a heterogenitás a két sejtvonal a tanulmányban, mint differenciált CD36 kifejezést, talán részben az lehet az oka a különböző szintű által indukált apoptózis THBS2, amely felhívta a további vizsgálatokra.
Harmadszor, eredményeink azt mutatják, hogy THBS2 tudott elnyomni angiogenezis gyomorrák. Ismeretes, hogy a tumor proliferációját, invázió, vagy metasztázis függenek angiogenezis [26]. És alapú bizonyítékok alátámasztják a felfedezés és rámutatnak arra, hogy a lehető mechanizmusok THBS2 gátolja az angiogenezis: 1) apoptózist-független módon indukálva endothel sejt apoptózis, sejtciklus letartóztatta és csökkenő az endothel sejtek migrációját [27], 2) függő kaszpáz jelátviteli útvonal által aktivált CD36 [28]. 3) működik, mint társ-receptorok az alacsony sűrűségű lipoprotein-receptor-related protein (LRP1), amely tiszta a komplexek THBS2 a mátrix metalloproteinázok-2, -9, vagy a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) a pericelluláris környezet a mesenchymális sejtek [ ,,,0],29-32].
Végül MVD az egyik leggyakrabban használt paraméterek az a mértéke a tumor angiogenezis és a korábbi vizsgálatok azt találták, MVD lehet egy független prognosztikai tényező a gyomorrák és más tumor [33-35]. Tanulmányunkban azt találtuk, MVD szignifikáns korrelációt THBS2 fehérje expresszió (P katalógusa < 0,001) a gyomorrák, de nem klinikai és klinikai prognózist. Az eredmények azt mutatták, hogy a THBS2 érintheti angiogenezis gyomorrákban, mégis, mert nincs összefüggés MVD és a prognózis a minták, azt feltételeztük, hogy a magasabb THBS2 kifejezésben hosszabb túlélést nem csupán a angiogenezis gátlására gyomorrák, más mechanizmusok, mint például szabályozó ECM remoulding [23] és a szaporodási sebessége gyomorrák sejtek is lehet az oka annak, hogy szükség van további kutatások felfedezni.
Összességében, eredményeink hangsúlyozzák a fontos szerepét THBS2 prognosztikai significances valamint tumor proliferáció és angiogenezis a gyomor rák. Ezek az adatok azt sugallják, THBS2 lehetne fontos prognosztikus markereként gyomor rákos betegeknél. Sőt, hatása alapján a THBS2 a tumor fejlődését és az angiogenezis, a kutatások értékes nyomokat klinikai gyakorlat fejlesztésére molekuláris gátlása terápiás pontos célokat levezethető biológiai ismeretek által nyújtott THBS2 aláírását. Katalógusa Következtetés
Tanulmányunk bemutatja az első sorban a bizonyítékokat, amelyek THBS2 kifejezést leszabályozott mind mRNS, mind fehérje szinten csökkent THBS2 kifejezés társul a rossz szövettani grade gyomorrák. Döntően túltermelése THBS2 jelentős összefüggést kedvező prognózist a gyomorrákos betegek. Másrészt, THBS2 érintett prognózis a gyomorrák nemcsak keresztül szabályozó angiogenezis, hanem valamilyen más módon, mint a szabályozó ECM remoulding és szaporodásának gátlására gyomor rákos sejteket. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy THBS2 lehet egy esetleges kritikus szerepe patogenezisében és progressziójában gyomorrák. Megerősítjük, hogy a fokozatos mélyreható tanulmányokat a THBS2, lehet, hogy egy ígéretes egyszerű és hasznos biomarker előrejelzésére klinikai kimenetelt gyomorrákos betegek. Katalógusa Módszerek katalógusa Betegek és szövetminták
A jelen tanulmányban építeni két csoport egyedeinek. Az első kohorsz tartalmazott 129 formalin-fixált, paraffinba ágyazott humán gyomorrák és 24 véletlenszerűen kiválasztott normál gyomor szövetekben. Ők egymás között felvett 2006 decemberében és 2008. május Általános Sebészeti Osztály, Az Első Kapcsolt Kórház Anhui Orvostudományi Egyetem, Hefei, Kína. Ezeket a mintákat építeni TMA immunhisztokémiai festéssel. A szövettani jellemzői e példányok is megerősítette a patológusok. Patológiai TNM stádium szerint értékeltük a 2010-es kritériumai Az American Joint Committee on Cancer (AJCC). A második kohorsz tagjai 14 gyomorrákos betegek alávetették tumorreszekcióra terápiát a nyolcadik Általános Sebészeti Osztály, az első Affiliated Kórház Anhui Orvostudományi Egyetem. A friss gyomorrák szövet és a megfelelő normál nyálkahártya (legalább 5 cm távolságra a daganat széle) azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és -80 ° C-on, amíg a kvantitatív valós idejű PCR és Western blot analízissel. A betegek mindkét kohorsz nem kapott preoperatív kemoterápia és /vagy sugárkezelés. Írásos beleegyezést adtak minden résztvevő számára. Minden mintát kezelték anonim szerint az etikai normákat. Ezt a vizsgálatot végeztek jóváhagyásával az etikai felülvizsgálati bizottság a kórház.
RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR katalógusa teljes RNS-t vontunk ki a második kohorsz Trizol reagens (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. cDNS-t szintetizálunk random primerek és Superscript II reverz transzkriptáz (Toyobo, Osaka, Japán). A használt primerek amplifikációs számára THBS2: előre láncindító 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'és reverz láncindító 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) amplifikáltuk ugyanabban a Q-PCR, mint belső kontroll primereket használva: forward primer 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'és reverz láncindító 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. A reakció futott a ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA) jelenlétében SYBR-zöld festék (Toyobo, Osaka, Japán). A reakciókörülmények az egy denaturációs programot (95 ° C, 5 perc), és egy amplifikációs és mennyiségi meghatározási program 40 cikluson keresztül (95 ° C-on 15 s és 60 ° C-on 45 s). Minden mintát vizsgáltuk háromszori ismétlésben, és az olvadási görbe analízisen egyes minták ellenőrzésére használt specifitását erősítés. Az expressziós szintet határoztuk közötti arány THBS2, és a belső kontroll GAPDH a mennyiségű mRNS-t által kiszámított összehasonlító CT módszer.
Fehérjeextrakció és Western-blot
Az összes fehérjét extraháljuk 14 fagyasztott gyomorrák és a megfelelő normális nyálkahártya szöveteit jég rádió immunprecipitációs vizsgálattal lízispufferben (RIPA; Beyotime intézet Biotechnology, Jiangsu, Kína), és mértük a BCA protein assay kit (Beyotime intézet Biotechnology, Jiangsu, Kína). A lizátumot centrifugáltuk 12000 rpm-mel 5 percig, és a felülúszót 100 ° C-on 5 percig. Ezután ekvivalens proteineket mindegyik pár mintákat elválasztottuk 8% -os nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél elektroforézis és elektroforetizáltuk polivinilidén fluorid membrán (Millipore, Billerica, MA). Miután A blokkoltuk TBST 5% lefölözött tejet szobahőmérsékleten egy órán át, a membránokat blotoltuk anti-THBS2 antitestet (1: 1500; Novus) és anti-Flag (1: 3000; Sigma). Majd membránok inkubálás torma-peroxidázzal jelzett anti-nyúl és anti-egér IgG-t, mint a másodlagos antitesttel (Beyotime Intézet Biotechnology). Anti-GAPDH antitestet (1: 4000; Aogma) használtunk terhelési kontrollként antitest. A megkötött antitesteket a kemilumineszcenciás módszer. Katalógusa immunhisztokémia és TMA elemzés katalógusa Gyomorrák és normál gyomornyálkahártya mintákat formalinban fixált, paraffinba ágyazott és arra használtuk fel szövet TMA. H &E-festett tárgylemezeket átvizsgáljuk, hogy azonosítsuk az optimális intratumoural szövet elemzésre. 4-um vastag metszeteket sütött 60 ° C-on 1 órán át, deparaffinised a xilolok, és rehidratált a fokozatos etanol desztillált vízzel. Antigén-visszanyerés értük el helyezve a szakaszok citrát pufferben egy rizs gőzölő 30 percig. Oltja az endogén peroxidáz aktivitás, a metszeteket kezeltük 3% H 2 O 2 metanolban. Aztán használt 1% szarvasmarha szérum albumint, hogy blokkolja a nem specifikus kötődés. Anti-THBS2 antitesttel (Novus, 1: 2000) és anti-CD34 (ABCAM, 1: 250) inkubáltuk a szakaszok 37 ° C hőmérsékleten egy éjszakán, majd inkubáljuk torma-peroxidázzal jelzett anti-nyúl IgG-vel, mint a másodlagos antitesttel (Life Technologies). A végén, tárgylemezeket egy autostainer linkre eszköz, és folytassa a festést. A negatív kontrollok, a primer antitestekkel váltották normál nyúl szérummal. A végleges hatékony immunhisztokémiai festéssel értékelték két független patológusok ismerete nélkül az információ a betegek szerint a festés intenzitása és mértéke festés. Tissue szakasz pontoztuk, mint a százalékos festett citoplazma a gyomorrák mirigy sejtek és a normális mirigy sejtek (0 pont nélkül festett sejtek, 1 pont a < 25%, 2 pont 25-75%, és a 3. pont a > 75 % festett sejtek), és a festődés intenzitása immunreaktivitás osztályoztuk skálán 0 3. az immunreaktivitást pontszám (IRS) eredményezte a szorzás mindkét paraméter. A mintákat szerzett az alábbiak szerint: negatív (IRS = 0 ~ 2), pozitív (IRS = 3 ~ 9). Katalógusa MVD számítva katalógusa immunhisztokémiai CD34 és általánosan elfogadott kritériumok által végzett Weidner et al. [36] használtuk MVD számolás. Bármilyen festett endoteliális sejteket vagy endoteliális sejt klaszterek elválasztjuk a szomszédos mikroerek, és a vastagsága minden érfal felett 2,75 jim lenne zárva. Három szakaszban tartalmazó forró pontok (ahol a legmagasabb számú diszkrét mikroerek festettük) minden egyes minta TMA választottunk alacsony nagyítás (100 ×) fénymikroszkóp alatt (Leica, Germany). Ezt követően, az erek megszámoltuk az egyes részekben az erős nagyítású (200 ×). P katalógusa <

• LNC RNS Hotair funkcionál versengő endogén RNS szabályozni HER2 által sponging miR-331-3p a gyomor cancer
• Proteomikai módosulása Gyomor adenocarcinoma japán beteg