Down sääntely Thrombospondin2 ennustaa huonon ennusteen potilailla mahalaukun cancer

säätelyä alaspäin Thrombospondin2 ennustaa huonon ennusteen potilailla mahalaukun syövän
tiivistelmä
tausta
Thrombospondins (THBSs) ovat perheen multidomain ja erittyvän Soluvälitilan Ca 2 +: aa sitova glykoproteiineja, joka on vähintään viisi jäsentä koodaavat itsenäiset geenit. Koska THBSs perheenjäsen, Thrombospondin2 (THBS2) on raportoitu säädellä angiogeneesiä. Kuitenkin toiminnot ja kliininen merkitys THBS2 edelleen epäselvä mahasyövässä. Tool Menetelmät
mRNA ja proteiini ekspressiotasot THBS2 arvioitiin 14 pariksi mahasyövän yksilöitä ja vastaavassa normaalissa mucosas käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR ja western blot-analyysi. Immunohistokemialla THBS2 ja CD34 on väestöpohjainen kudossiruina koostuu 129 mahasyövän tapaukset käytettiin arvioimaan ennustetekijöiden merkitystä THBS2 ja mikroverisuonitiheys (MVD) kunkin näytteen. Survival analyysit tehtiin Kaplan-Meier menetelmällä ja Coxin suhteellisten riskien mallia. Pesäkemuodostusta, endoteelisolujen putken muodostumiseen määrityksessä, solu migraatiokokeessa ja apoptoosin analyysi MKN-45 ja SGC-7901 solulinjoja suorittaa vaikutusten arvioimiseksi THBS2 mahalaukun syövän in vitro
.
Tulokset
85.71% (12 14) mahasyöpä kudoksiin ilmaistu huomattavasti alhaisempi THBS2 sekä mRNA ja proteiini tasoilla kuin vastaavassa normaalissa valvontaa. Johdonmukaisesti, kudos mikrosiru (TMA) tulokset osoittivat THBS2 tasot esti myös mahasyövän kudoksissa verrattuna normaaliin valvontaa. Lisäksi havaitsimme, että potilailla, joilla on korkeampi THBS2 olivat merkittävästi korreloivat edullisempia ennusteeseen kun taas laski THBS2 ilmentyminen oli yhteydessä heikompaan histologinen laadut mahasyövän. Lisäksi meidän in vitro kokeet osoittivat lisäksi, että yli-ilmentyminen THBS2 voi haitata sekä proliferaationopeus ja putken muodostumisen Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) in MKN-45 ja SGC-7901 solulinjoissa.
Päätelmät
Meidän tutkimuksen mukaan THBS2 on poikkeuksellisesti ilmaistaan ​​mahasyövän ja sillä on kriittinen merkitys syövän etenemiseen, mikä voi olla mahdollinen ennuste ennustaja mahasyövän.
avainsanat
THBS2 mahasyöpää Angiogeneesi Prognostiset biomarkkereiden Johdanto
mahalaukun syöpä on erittäin aggressiivinen ja tappava maligniteetti. Yhteensä 952000 uutta mahalaukun syöpätapausta ja 723000 kuolemantapausta arvioitiin tapahtuneen vuonna 2012, mikä vastaa 6,8% kaikista tapauksista ja 8,8% kaikista kuolemista. Lisäksi molemmat uutta tapausta ja kuolemat mahasyövän Kiinassa, sijoittui ensimmäinen maailmanlaajuisesti, osuus on yli 40%, joka maailmassa [1]. Siksi suuri huolenaiheet esitetty tutkijat mahasyövän.
Thrombospondins (THBSs) on perhe multidomain ja Soluvälitilan Ca 2 +: aa sitova glykoproteiineja erittämät strooman fibroblastit, endoteelisolut ja immuunisolujen [2]. Niillä on vähintään viisi jäsentä koodaavat itsenäiset geenit. Sitoutumalla lukuisia kohdeproteiinit, he osallistuvat erilaisiin biologisia prosesseja, kuten angiogeneesin, solun liikkuvuus, apoptoosin, solun tukirangan organisaatioon, ja toimivat vuorovaikutuksessa alustojen soluväliaineen (ECM) [3, 4]. Erityisesti THBS1 ja THBS2 ovat erityisiä tässä perheessä niiden tyypin I toistosta ja molemmat ovat pääasiassa esitetty angiogeneesin estäjiä [5, 6], yksi keskeinen osa syöpätutkimuksessa [7-9]. Mikroverisuonitiheys (MVD) on laajalti käytetty parametri arvioida aste angiogeneesin kasvaimissa CD34 ollessa pienten suonten päättäjä mahasyövässä [10]. Perustuen aiempia havaintoja [2], esitämme hypoteesin tutkimuksessamme, että se voi vaikuttaa myös angiogeneesiä mahasyövän.
Lisäksi angiogeneesi, THBS2 on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa useiden solu reseptorien, kasvutekijät ja ECM proteiinit sekä säätelevät apoptoosia, solujen lisääntymisen ja tarttuvuus [11]. Syövän tutkii, kasvava huomio on keskittynyt THBS2. Tokunaga et al. [12] mukaan THBS2 ilmaistu potilailla, joilla on paksusuolen syövän osoitti merkittävän pienempi riski maksametastaaseja ja kasvaimen verisuonitus verrattuna potilailla, joiden kasvaimet olivat THBS2 puute. Lisäksi De Fraipont et al. [13] osoitti, että THBS2 korreloi merkitsevästi kliinisen asema ja tulos, ja useimmat kasvaimia, oli käänteinen korrelaatio THBS2 ekspressiotason ja ulkopuolelle niiden maligniteetti. Lisäksi THBS2 myös ollut keskeinen rooli rintasyövän [14], myelooma [15], pahanlaatuinen melanooma [16], eturauhassyöpä [17] ja keuhkojen adenokarsinooma [18, 19]. Mahasyövän, muiden jäsenten THBSs, THBS1 [20] ja THBS4 [21] voi olla ennustetyövälineenä biomarkkeri tai voimakas merkkiaine diffuusi-tyypin mahalaukun adenokarsinoomat. Kuitenkin yksityiskohtainen toiminta THBS2 mahasyövän ja sen vaikutuksista kliinisen diagnoosin edelleen synkkä. Niinpä yritimme paljastaa kliinistä merkitystä THBS2 ja sen vaikutus mahasyövässä.
Voit tarkistaa meidän edellä mainitun hypoteesin, selvitimme THBS2 ekspressiotasot ihmisen mahasyövän kudosten ja vastaavat normaalit kudokset ja sitten tutkitaan mahdollisia korrelaatioita ilmaus THBS2 ja kliinis-, kliininen ennuste ja MVD laskenta potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. Lisäksi, pesäkemuodostusta, endoteelisolujen putken muodostumiseen määrityksessä, solujen migraatiomääritys ja apoptoosin analyysi tehtiin MKN-45 ja SGC-7901-solulinjat tutkia in vitro
vaikutus THBS2 mahalaukun syöpäsoluja.
tulokset
Potilaan ominaisuuksista ja kliinisiin tuloksiin
Tässä tutkimuksessa olemme osallistui 129 soveltuvaa potilasta, joka koostui 101 urosta ja 28 naarasta. Ikä potilaiden vaihteli 29-80 vuotta (y), jossa mediaani-ikä oli 61y. Kaikki kliinis ominaisuudet on koottu taulukkoon 1. Keskimääräinen eloonjäämisaika (OS) potilaista oli 57 kuukautta, ja keskimääräinen OS oli 44.01 [95%: n luottamusväli (CI) +39,78-+49,24kuukautta] .table 1 Association keskuudessa kliinis muuttujat ja THBS2 ilmaisun ja eloonjäämisaste mahasyöpäpotilaista
muuttujat
Negative
Positiivinen
Yhteensä nro
P arvoA
Kokonaiselossaoloaika OS
Log-Rank Pb
HR (95% CI)
o. (%) B o. (%) B Age (y )
0,112
0,743
< 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (viite) B ≥61
35 ( 53,0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67-1,77)
Sukupuoli
0,831
0,405
Mies
47 (46,5)
54 ( 53,5) B 101
1 (viite) B Nainen
12 (42,9)
16 (57,1)
28
0,76 (0,40-1,45) B Histologinen laatu
0,005
0,011
Well ja kohtalainen
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (viite) B Huono ja muut
35 (60.3 )
23 (39,7)
58
1,89 (1,16-3,09) B kasvain sijainti
0,419
0,204
Ylä
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (viite) B Middle
15 (53,6)
13 (46,4)
28
1,66 (0,86-3,18) B Ala
17 (50,0)
17 (50,0)
34
1,90 (0,90-4,01) B syvyys invaasion
0,271
0,001
T1-T2
9 ( 34,6)
17 (65,4)
26
1 (viite) B T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11,60 (2,83 -47,45) B Imusolmuke etäpesäke
0,454
< 0,001
Absent
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (viite)
Present
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5,16 (2,46-10,84)
TNM
0,283
< 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (viite) B III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52-14,49)
Bold arvo on tilastollisesti merkitsevä P
< 0,05, HR riskisuhde.
A, P
arvo kliinis muuttujien ja THBS2 ilme.
B, P
arvo välistä yhteyttä kliinis muuttujien ja eloonjäämisaste mahasyöpäpotilaista.
THBS2 säätyy alas mahasyövän
sen määrittämiseksi ilmentymisen tasot THBS2 mahasyövän, ensin arvioidaan mRNA ekspressiotasot THBS2
mahasyövän kvantitatiivisen reaaliaikaisen toisessa kohortissa. Tämä kohortti näytteiden mainittu Methods, mukana 14 ihmisen mahasyövän ja vastaavat normaalit kudokset. Kuten kuviossa 1A on esitetty, THBS2
tasot olivat selvästi vähemmän 85,7% (12 14) mahasyövän kudoksiin kuin normaaleihin kontrolleihin, kun taas loput kaksi paria näytteet omasivat päinvastainen. Sitten me havainneet proteiinin ekspressiotasot THBS2 kautta western blot samassa kohortin. Kuten näyttelyssä Figure1B ja C, havaitsimme, että THBS2 proteiinin ekspressiotasoja määrä väheni 85,7% (12 14) kasvain näytteissä verrattuna sen vastaavaan ohjaus, kun taas näyte 5 ja 11 näytetään käänteisesti. Voit vahvistaa havainto, me suoritetaan edelleen kudoksen mikrosirulla (TMA) ja arvioidaan proteiinin ekspressiotasot THBS2 mukaan immunoreaktiivisuus pisteet (IRS) kunkin näytteen. Olemme löytäneet THBS2 proteiinit olivat pääasiassa ilmaistu cytoplasms mahalaukun solujen (kuvio 2A), ja tulosten mukaisesti on Western blot, tasot THBS2 olivat merkittävästi estivät mahalaukun syövän kudoksissa verrattuna normaaliin kontrolleihin (kuvio 2B, P <0,05). Yhdessä tuloksemme osoittaa, että THBS2 säätyy alas mahasyövän sekä mRNA ja proteiini tasoilla. Kuvio 1 mRNA ja proteiinin ekspression taso THBS2 14 mahasyövän kudosten ja vastaavassa normaalissa kudoksessa. (A) Suhteellinen mRNA ilmentymistä THBS2 havaittiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä. Ilmentyminen normaaleissa kudoksissa normalisoitiin 1.0 esitetyllä tavalla. (B) toinen densitometria analyysitulokset THBS2 bändejä normalisoitiin GAPDH Image J. Expression of normaaleissa kudoksissa normalisoitiin 1.0 esitetyllä tavalla. (C) Suhteellinen proteiinin ilmentymistä THBS2 arvioitiin Western blot -määritys.
Kuvioon 2 immunohistokemiallinen analyysi THBS2, CD34. (A) edustavat kuvat THBS2 ja CD34 ilme: N1, N2, N3, N4, normaali mahalaukun kudoksesta (N); M1, M2, M3, M4, kohtuullisesti erilaistunut (M); P1, P2, P3, P4, huonosti eriytetty (P). Suurennus: 100 x (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 x (N4, M4, P4) ja 400 × (N2, M2, P2). (B) vertailu THBS2 ilmentymisen mahasyövän (n = 129) ja normaali mahan kudoksissa (n = 24) TMA. THBS2 ekspressiotaso esitetään keskiarvona ± SEM. (C) vertailu MVD THBS2-positiivisten mahasyövän ryhmä (n = 70) ja THBS2-negatiivinen mahasyövän ryhmä (n = 59). Dots edustavat MVD kunkin näytteen. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM.
THBS2 ekspressiotasot ovat käänteinen korreloivat histologinen laadut mahasyövän
edelleen selkeyttää kliinistä merkitystä THBS2, analysoimme suhde THBS2 proteiinin ilmentymisen ja kliinisiä ominaisuuksia, kuten ikä, sukupuoli, histologisia grade, kasvain sijainti, syvyys invaasio, imusolmuke etäpesäke ja TNM mahalaukun syöpäpotilaiden THBS2-positiiviset ja negatiiviset ryhmät. Kuten on esitetty taulukossa 1, löydettiin merkittävä käänteinen korrelaatio histologinen laadut mahasyövän (P
< 0,01). Histologinen laadut potilaita THBS2-positiivisten ryhmässä olivat todennäköisemmin hyvin ja kohtalainen, kun taas potilaat THBS2-negatiivinen ryhmä oli taipumus olla heikko ja muut. Emme kuitenkaan ole löydä mitään merkitystä tilastollisesti välillä ekspressiotasot THBS2 ja muut kliiniset parametrit. Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että THBS2 on käänteinen korreloi histologinen arvosana mahasyövän.
THBS2 ekspressiotasot ovat käänteinen korreloivat MVD mahasyövän
Aiemmat raportit hiljaista THBS2 voisi säädellä tuumoriangiogeneesissa [6], mutta mikään ei ollut raportoitu mahasyövän. Siksi kysyimme, oliko korrelaatioita MVD ja THBS2 ekspressiotasoja sekä muita kliinisiä parametrejä meidän kliinisissä näytteissä. MVD 129 mahasyövän yksilöitä vaihteli 0-120, jossa mediaani 40 ja keskiarvo 48,12 ± 28,99 (keskiarvo ± SD) mukaan immunoreaktiivisuus CD34 meidän TMA. Kuten kuviossa 2C, THBS2 korreloi merkitsevästi MVD. MVD in THBS2-negatiivisten ryhmässä oli paljon korkeampi kuin THBS2-positiivisten ryhmässä (P
< 0,001). Emme kuitenkaan voi havaita mitään tilastotieto eroja MVD ja muita viittaavia tekijöitä mukaan luettuna kliininen ennusteen meidän näytteitä (tuloksia ei ole esitetty). Lopuksi todettakoon, että löydöt osoittavat, että THBS2 on käänteinen korreloi MVD mahasyövän.
THBS2 liittyy merkittävästi kliinistä ennustetta mahasyöpäpotilaista
Tutkia suhdetta THBS2 ilmaisun ja kliininen ennuste mahalaukun syövän potilaiden, teimme selviytyminen analyyseja yhden ja usean Coxin suhteellisten riskien regressiomallia. Kuten taulukosta 1, löysimme histologinen luokka, syvyys invaasio, imusolmuke etäpesäke ja TNM olivat tilastollisesti merkitseviä tekijöitä OS univariate analyysiin. Koska TNM myös sisältää tiedot syvyyttä hyökkäyksen ja imusolmuke etäpesäke, me suoritetaan edelleen monimuuttuja selviytymisen analyysit korjattuna histologinen arvosana ja TNM-luokitus. Huomasimme, että TNM (P
< 0,001) ja THBS2 lauseke (P
< 0,01) olivat molemmat riippumattomia ennustetekijöitä arvioimiseksi hoitotuloksia. Korkeampi TNM oli riskitekijä pidempään OS [P
< 0,001, HR (riskisuhde) = 7,23, 95%: n luottamusväli 3,55-14,69) ja kohonnut ilmentyminen THBS2 oli vielä suotuisa tekijä pidempään OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% CI ,31-,85). Lisäksi Kaplan-Meier selviytymisen analyysi vahvistivat lisäksi, että THBS2 ekspressio korreloi merkitsevästi kliinisten tulosten (kuvio 3, P < 0,01, n = 129). Potilaat, joilla on alhaisempi THBS2 ilme näkyy huomattavasti lyhyempi OS [mediaani 36 kuukauden keskiarvo 40,07 ± 3,65 (keskiarvo ± SE) kuukautta], kun taas potilailla, joilla on korkeampi THBS2 ilme suotuisasti ennusteeseen [mediaani 59 kuukautta, keskimääräinen 53,70 ± 2,95 (keskiarvo ± SE ) kuukaudet]. Yhdessä tuloksemme osoittavat THBS2 liittyy merkittävästi kliinisen ennusteen mahalaukun syövän potilaiden, jotka saattavat tulla prognostinen markkeri mahasyövän. Kuva 3 Kaplan-Meier selviytymisen analyyseja, Log-Rank -testi koko (OS). Kaplan-Meier analyysi väliset korrelaatiot eri THBS2 ekspressiotasot ja OS 129 mahasyöpäpotilaista.
Yli-ilmentäminen THBS2 estää niiden kasvun mahasyövän solujen in vitro
Koska THBS2 oli merkitsevästi alassäädetty mahalaukun syöpä, me päätellä, että THBS2 voisivat jarruttaa kasvua, edistää apoptoosia ja parantaa muuttoliike kykyä mahalaukun syöpäsoluja. Voit tarkistaa hypoteesia, ensin rakennetaan yksi lentivirusvektorilla vakaiksi ilmaista THBS2 transkriptien mahasyövässä solulinjoissa. Muuttunut ilmentyminen THBS2 293 T-soluissa varmistettiin western blot -analyysillä (kuvio 4A). Sitten, päätimme MKN-45 ja SGC-7901-solulinjat meidän in vitro
tutkimukseen, koska mRNA: n ekspressiotasot THBS2 olivat alhaisemmat kuin toiset (tuloksia ei ole esitetty). Sitten suoritettiin pesäkkeiden muodostumista määrityksessä arvioimaan vaikutuksia THBS2 kasvuun MKN-45 ja SGC-7901-soluja. Kuten kuviossa 4B, löysimme solut THBS2 yliekspressio muodostivat merkittävästi vähemmän pesäkkeitä pehmeässä agarissa verrattiin kontrolli vektori-tartunnan saaneiden solujen (P
< 0,01 MKN-45-solut ja P
< 0,001 SGC-7901-soluissa, vastaavasti). Lisäksi selvitimme apoptoosin tasot ryhmien välillä sekä solulinjoissa ja havaitsivat, että THBS2 edistetään apoptoosin SGC-7901-soluissa (kuvio 4F), mutta ei MKN-45-solut (Additional tiedosto 1: Kuva S1A). Ja ei ollut merkittäviä eroja kahden ryhmän SGC-7901 ja MKN-45 solulinjojen solujen vaeltaminen mukaan Transvvell- määritykset (Additional tiedosto 1: Kuva S1B ja C). Yhteenvetona tietomme tukevat tätä THBS2 estää kasvun mahasyövän solujen in vitro mahdollisesti kautta apoptoosin säätelyyn. Kuvio 4: n yliekspressio THBS2 inhiboivat mahalaukun syövän solujen, tukahdutti angiogeneesi mahalaukun syövän, ja edistää apoptoosia SGC-7901 solulinja in vitro. (A) Western blot-analyysi Lippu 293 T-solujen THBS2 yli-ilmentymisen. (B) Colony numero analyysi MKN-45 ja SGC-7901-solujen THBS2 yli-ilmentymisen ja negatiivisen kontrollin. Arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) Kuvia pesäkemuodostusta. (D) AngiogenicIndexCh1 analyysi endoteelisolujen putken muodostumista määrityksessä. Arvot ovat keskiarvoja ± SD. (E) Kuvia endoteelisolujen putken muodostumista määrityksessä. (F) analyysi apoptoosin MKN-45 solulinjaa. Arvot ovat keskiarvoja ± SD.
THBS2 estää mahalaukun syövän angiogeneesi in vitro
THBS2 tunnetaan angiogeneesin inhibiittori [2]. Tarjota todisteita THBS2 säätelee angiogeeninen fenotyyppi mahalaukun syövän, endoteelisolujen putken muodostumiseen määritykset suoritettiin. Kuten kuviossa 4E ja D, sekä MKN-45 ja SGC-7901-solulinjat, ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) viljeltiin elatusaineessa THBS2-yli-ilmentymisen mahasyövän solut osoittivat merkitsevästi pienempi AngiogenicIndexCh1 kuin negatiivisen kontrollin (P
< 0,05 MKN-45-solut ja P
< 0,001 SGC-7901-soluissa, vastaavasti). Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että THBS2 estää angiogeneesiä mahalaukun syövän solujen in vitro
.
Keskustelu
THBS2 tunnetaan luonnollisen angiogeneesin estäjä ja modulaattorin uudelleenmuodostus [22, 23]. Kuitenkaan yksikään entinen tutkijat keskustelivat roolit THBS2 ja sen kliinistä merkitystä mahasyövän.
Ensinnäkin huomasimme, että mRNA ja proteiini ekspressiotasot THBS2 olivat alassäädetty useimmissa näytteissä. Kuitenkin yksi aiempi tutkimus raportoitu THBS2 mRNA ekspressiotasot mahasyövän olivat normaalia suuremmat ohjaus [24]. Ottaen huomioon rajoitetun otoskoko tässä tutkimuksessa, johon sisältyi vain 6 kudosnäytteet, on mahdollista, että tämä ero johtuu kasvaimen heterogeenisuus kaksi paria meidän toinen kohortin osoittavat myös samoja kuvioita. Silti meidän myöhemmin seurauksena TMA, suurempi otoskoko, oli yhdenmukainen tulos toisesta kohortissa. Yhdessä uskoimme THBS2 oli todennäköisemmin alaspäin säänneltävä mahasyövässä solussa ja normaalissa limakalvo.
Lisäksi olemme myös huomanneet, että suhteellinen ilmentyminen näytteiden näytteillä eri tavalla mRNA ja proteiini tasolla. Ei ole riittävää todisteita, voimme päätellä, että funktio THBS2 sisällä mahalaukun syövän solut voidaan säädellä jonkin solunsisäisen ylävirtaan signalointi tekijät, proteiinia ubikitinaation ja muita mahdollisia tapoja, jotka voivat vaikuttaa proteiinin tasot THBS2 ja fenotyyppien mahalaukun syöpäsoluja. Ja aiempaa enemmän voidaan laittaa tähän mielenkiintoinen ilmiö. Kuitenkin, suurin osa näytteitä meidän toinen kohortin näytetään sama ilmentymiskuviot välillä mRNA: n ja proteiinin tasot.
Toiseksi, meidän tiedot osoittivat, että THBS2 voitaisiin edistää apoptoosia vain SGC-7901-soluissa, mutta ei MKN-45-soluissa. Entinen tutkimukset osoittivat, että N-terminaalisen rekombinantti fragmentti THBS2 voisi aktivoida CD36-välitteistä endoteelisolujen apoptoosia [14], ja yhdistelmä CD36 ja THBS2 voi aktivoida kaspaasi signalointireitin [25]. Niinpä oletetaan, että epäyhtenäisyyttä kahden solulinjan käytetty Tutkimuksessamme kuten eriytetty CD36 ilmaisuja, saattaa osittain olla syynä eri indusoiman apoptoosin THBS2, jossa vaadittiin lisätutkimuksiin.
Kolmanneksi meidän tulokset osoittivat että THBS2 voisi tukahduttaa angiogeneesiä mahasyövän. On tunnettua, että kasvaimen proliferaatiota, invaasio tai etäpesäke ovat riippuvaisia ​​angiogeneesistä [26]. Ja perustuvat todisteet tukevat löytö ja huomauttaa, että mahdolliset mekanismit, jotka THBS2 estää angiogeneesin: 1) apoptoosia riippumaton muoti indusoimalla endoteelisolujen apoptoosia, solusyklin pysäytettyä ja vähentyneestä endoteelisolujen migraatiota [27], 2) riippuvainen kaspaasi signalointi polku aktivoituu CD36 [28]. 3) toimivat yhteistyössä reseptorit low density lipoprotein-reseptorin kaltainen proteiini (LRP1), joka voisi poistaa kompleksit THBS2 kanssa metalloproteinaaseja-2, -9 tai verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) päässä perisellulaarinen ympäristön mesenkyymisolujen [ ,,,0],29-32].
Lopuksi MVD on yksi yleisimmin käytettyjä parametreja asteen arvioimiseksi kasvaimen angiogeneesiä ja aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet MVD voisi olla itsenäinen ennustetekijä mahasyövän ja muissa elimissä [33-35]. Tutkimuksessamme havaitsimme MVD korreloi merkitsevästi THBS2 proteiinin ilmentymisen (P
< 0,001) mahasyövän, mutta ei kliinisiä piirteitä ja kliinisen ennusteen. Nämä tulokset osoittivat, että THBS2 voivat vaikuttaa angiogeneesiin mahasyövän kuitenkin, koska mitään korrelaatiota MVD ja ennusteeseen meidän näytteitä, me epäillään, että korkeammat THBS2 ilmaisu osoittaa enää eloonjääminen ei ollut pelkästään estämällä angiogeneesiä mahalaukun syövän, muut mekanismit, kuten säännellä ECM työstää uudelleen [23] ja leviämisen nopeus mahalaukun syöpäsolujen voi olla syy siihen, että niitä on vielä tutkijat tutkia.
Yhdessä havaintomme korostanut tärkeät roolit THBS2 vuonna prognostisten merkitykset sekä kasvaimen leviämisen ja angiogeneesiä mahalaukun syöpä. Nämä tiedot viittaavat siihen THBS2 voi olla merkittävä prognostinen markkeri mahasyövän potilaille. Lisäksi perustuu vaikutuksiin THBS2 kasvainten kehitystä ja angiogeneesissä, meidän tutkimukset antavat arvokasta johtolankoja kliinisten käytäntöjen kehittämiseksi molekyyli- estämällä hoitomuotoja käyttäen tavoitteet päätellä biologista tietämystä tarjoamia THBS2 allekirjoituksella.
Päätelmä
Tutkimuksemme esittelee ensimmäinen rivi todisteita, jotka THBS2 ilmentyminen säätyy alas sekä mRNA ja proteiini tasoilla ja laskivat THBS2 ilmentyminen liittyy huono histologinen arvosana mahasyövän. Ratkaisevaa on se, yliekspressio THBS2 on merkittävä korrelaatio suotuisa ennusteeseen mahasyövän potilaille. Toisaalta, THBS2 vaikuttaa ennusteen mahasyövässä saa ainoastaan ​​säännellä angiogeneesiä, mutta joissakin muissa tavoilla, kuten säätelemällä ECM pinnoittamista ja estämällä leviämisen mahalaukun syöpäsoluja. Nämä havainnot viittaavat siihen, että THBS2 voisi olla potentiaalisesti kriittinen rooli patogeneesissä ja etenemistä mahasyövän. Vahvistamme, että asteittainen perusteellisia tutkimuksia THBS2, se voi olla lupaava hyödyllinen ja yksinkertainen biologisten merkkiaineiden ennustamiseen kliininen tulos mahasyövän potilaille. Tool Menetelmät
Potilaat ja kudosnäytteiden
Tässä tutkimuksessa olemme sisällytetty kaksi ikäluokat yksilöiden. Ensimmäinen kohortti sisälsi 129 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut ihmisen mahasyövän ja 24 satunnaisesti valittua normaaleissa mahan kudoksissa. He olivat peräkkäin palvelukseen joulukuun 2006 ja toukokuuta 2008 Department of General Surgery, The First Affiliated sairaala Anhui Medical University, Hefei, Kiina. Nämä yksilöt sisällytettiin TMA immunohistokemiallista värjäystä. Histologisia piirteitä näistä näytteistä varmistettiin patologia. Patologinen TNM lavastus oli arvioitu vuoden 2010 kriteerit American sekakomitean Cancer (AJCC). Toinen kohortti koostui 14 mahasyövän potilailla, joille tehty kasvaimen resektion hoito kahdeksannessa osasto General Surgery, The First Affiliated sairaala Anhui Medical University. Tuoretta mahasyöpä kudoksesta ja vastaavat normaali limakalvo (vähintään 5 cm: n etäisyydellä kasvain reuna) jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes käyttäen Quantitative real-time PCR ja Western blot-analyysi. Potilaat molemmissa ikäluokat eivät saaneet leikkausta edeltävän kemoterapiaa ja /tai sädehoitoa. Kirjallinen suostumus saatiin kaikki osallistujat. Kaikki näytteet käsiteltiin anonyymisti mukaan eettisiä standardeja. Tutkimus suoritettiin hyväksyntää eettisen arvioinnin komitean sairaalassa.
RNA ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR
Yhteensä RNA eristettiin toisesta kohortin käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan protokollaa. cDNA syntetisoitiin satunnaisia ​​alukkeita ja Superscript II käänteistranskriptaasia (Toyobo, Osaka, Japani). Käytetyt alukkeet monistusta varten THBS2: forward-aluke 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'ja reverse-aluke 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) monistettiin samassa q-PCR sisäisenä kontrollina käyttämällä alukkeita: forward-aluketta 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'ja reverse-aluke 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. Reaktio sai pitkän ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA) läsnä ollessa SYBR-Green väriaine (Toyobo, Osaka, Japani). Reaktio ehto oli denaturaatio ohjelman (95 ° C 5 min), ja vahvistus ja kvantifiointi ohjelma 40 sykliä (95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 45 s). Jokainen näyte testattiin kolmena rinnakkaisena, ja sulamiskäyräanalyysi kutakin näytettä käytettiin tarkistaa spesifisyys vahvistusta. Ilmentymistaso määritettiin suhteena THBS2 ja sisäisen valvonnan GAPDH määriä mRNA: laskettu vertailevaa CT-menetelmällä.
Protein uutto ja Western blot
Yhteensä proteiini uutettiin 14 jäädytettyä mahalaukun syövän ja sen vastaavassa normaalissa limakalvon kudoksen jään radioimmunosaostuskoe Lysis Buffer (RIPA; Beyotime Biotekniikan instituutti, Jiangsu, Kiina), ja mitattiin käyttäen BCA proteiinia iinianalyysikitissä (Beyotime Biotekniikan instituutti, Jiangsu, Kiina). Lysaattia sentrifugoitiin 12000 rpm: ssä 5 minuutin ajan, ja supernatantti kuumennettiin 100 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Sitten vastaavia proteiineja kunkin parin näytteet erotettiin 8% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja sähköllä polyvinylideenifluoridia kalvoja (Millipore, Billerica, MA). Jälkeen blokattiin TBST, joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa huoneen lämpötilassa yhden tunnin ajan, kalvot blotattiin anti-THBS2-vasta-ainetta (1: 1500, Novus) ja anti-Flag (1: 3000; Sigma). Minkä jälkeen kalvot inkubointi piparjuuriperoksidaasi-leimattua anti-kanin ja anti-hiiri-IgG, kun sekundaarisen vasta-aineen (Beyotime Institute of Biotechnology). Anti-GAPDH-vasta-ainetta (1: 4000; Aogma) käytettiin latauskontrollina vasta-aine. Sitoutuneet vasta-aineet havaittiin parannetun kemiluminesenssi-menetelmällä.
Immunohistokemia ja TMA-analyysi
Mahasyöpää ja normaalin mahan limakalvon näytteet formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut ja oli käytetty kudoksen TMA. H &E-värjättyjen liukuu seulottiin niiden tunnistamiseksi, optimaalinen intratumoraalisesti kudoksen analyysiin. 4 um: n paksuisia leikkeitä paistettiin 60 ° C: ssa 1 tunnin ajan, deparaffinised kanssa ksyleenit, ja niihin lisätään lajitellut etanolia tislattua vettä. Antigeeni haku saavutettiin sijoittamalla kohdat sitraattipuskurilla riisi höyrystimen 30 minuuttia. Sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin, leikkeet käsiteltiin 3% H 2O 2 metanolissa. Sitten käytimme 1% naudan seerumin albumiinia estää epäspesifisen sitoutumisen. Anti-THBS2-vasta-aine (Novus, 1: 2000) ja anti-CD34 (Abcam, 1: 250) inkuboitiin osien 37 ° C: ssa yön yli, sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-leimattua anti-kani-lgG kuin sekundaarisen vasta-aineen (Life Technologies). Lopulta levyt sijoitettiin koskevasta Autostaineriin linkkiä väline ja jatka värjäys. Negatiivisia kontrolleja, primaaristen vasta-aineiden korvattiin normaalilla kanin seerumilla. Lopullinen tehokas immunohistokemiallisella värjäyksellä arvioitiin kaksi riippumatonta patologia tietämättä tiedot potilaiden mukaan värjäytymisen voimakkuus ja laajuus värjäystä. Tissue kohta pisteytettiin prosenttiosuutena värjättyä solulimassa mahasyövän rauhasen soluihin ja normaalit rauhanen solut (0 pistettä ei soluja värjätään, 1 piste < 25%, 2 pistettä 25-75%, ja 3 pistettä > 75 % värjättyjen solujen), ja värjäytymisintensiteettiä immunoreaktiivisuus luokiteltiin asteikolla 0 3. immunoreaktiivisuus pisteet (IRS) on tuloksena, kun kerrotaan molemmat parametrit. Näytteet pisteytettiin seuraavasti: negatiivinen (IRS = 0 ~ 2), positiivinen (IRS = 3 ~ 9).
MVD laskenta
immunohistokemiallinen värjäys CD34 ja yleisesti hyväksytyt kriteerit suoritetaan Weidner et ai. [36] käytettiin MVD laskentaa. Mikä tahansa värjättyä endoteelisolujen tai endoteelisolujen klustereita erotettiin viereisistä mikro- suonten ja paksuus jokaisen suonen seinämän yli 2,75 pm jäisivät. Kolme erillistä osaa, jotka sisältävät hot-spots (jossa eniten erillisiä mikroverisuonten värjättiin) kussakin näytteessä TMA valittiin matalan suurennoksilla (100 x) valomikroskoopilla (Leica, Saksa). Myöhemmin mikroverisuonten laskettiin kussakin jaksossa korkean suurennuksen (200 x). P
<

• Pvm RNA hotair toimii kilpailevan endogeeninen RNA säätelemään HER2 ilmentymistä pyyhkimällä miR-331-3p mahasyövän
• Proteomic muutos gastic adenokarsinooman välillä Japani potilaista