Neerwaartse regulatie van Thrombospondin2 voorspelt een slechte prognose bij patiënten met maagkanker

Neerwaartse regulatie van Thrombospondin2 voorspelt een slechte prognose bij patiënten met maagkanker
Abstracte achtergrond
Thrombospondins (THBSs) zijn een familie van multidomein en uitgescheiden matricellulaire Ca 2 + bindende glycoproteïnen waarvan ten minste vijf leden telt gecodeerd door onafhankelijke genen. Als THBSs familielid heeft Thrombospondin2 (THBS2) gemeld om angiogenese te reguleren. Niettemin de functies en klinische betekenis van THBS2 blijft onduidelijk maagkanker.
Methods Ondernemingen De mRNA en eiwitexpressie niveaus van THBS2 werden 14 geëvalueerd gepaarde maagkanker monsters en overeenkomstige normale slijmvliezen met behulp van kwantitatieve real-time PCR en western blot analyse. Immunohistochemie van THBS2 en CD34 op populatie gebaseerde weefsel microarrays bestaande uit 129 maagkanker gevallen gebruikt om de prognostische betekenis van THBS2 en microvaatje dichtheid (MVD) van elk monster geëvalueerd. Survival analyses werden uitgevoerd door Kaplan-Meier-methode en Cox's proportionele hazards model.
kolonievorming assay endotheelcel buisvorming assay, celmigratie en apoptose assay analyse MKN-45 en SGC-7901 cellijnen werd uitgevoerd om de effecten van THBS2 op maagkanker in vitro
evalueren. Resultaten
85,71% (12 van 14) maagkanker weefsels uitgedrukt opmerkelijk lager THBS2 in zowel mRNA en eiwit niveaus dan de overeenkomstige normale controles. Consequent, tissue microarray (TMA) resultaten toonden THBS2 toxoid werden geremd bij maagkanker weefsels vergeleken met normale controles. Bovendien hebben we waargenomen dat patiënten met hogere THBS2 significant gecorreleerd met gunstigere prognose, terwijl verminderde THBS2 expressie geassocieerd met slechtere histologische soorten maagkanker. Bovendien, onze in vitro experimenten verder aangetoond dat overexpressie van THBS2 zowel de proliferatiesnelheid en buisvorming Menselijke navelstrengader endotheliale cellen (HUVEC) in MKN-45 en SGC-7901 cellijnen kan belemmeren.
Conclusie
Onze studie suggereert THBS2 is afwijkend uitgedrukt in maagkanker en speelt een cruciale rol in de progressie van kanker, die een potentieel prognose voorspeller van maagkanker kan zijn.
Sleutelwoorden
THBS2 maagkanker Angiogenese prognostische biomarker Inleiding
maagkanker is een zeer agressieve en dodelijke maligniteit. Een totaal van 952.000 nieuwe maagkanker gevallen en 723.000 sterfgevallen werden geschat te hebben plaatsgevonden in 2012, goed voor 6,8% van de totale gevallen en 8,8% van de totale sterfte. Bovendien Zowel nieuwe gevallen en sterfgevallen van maagkanker in China, op volgorde 1 wereldwijd, goed voor meer dan 40% van die in de wereld [1]. Daarom grote zorgen worden opgehaald voor de onderzoekingen van maagkanker.
Thrombospondins (THBSs) zijn een familie van multidomein en matricellulaire Ca 2 + bindende glycoproteïnen uitgescheiden door stromale fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen [2]. Ze ten minste vijf leden gecodeerd door onafhankelijke genen. Door binding met talloze doeleiwitten, zij deelnemen aan verschillende biologische processen zoals angiogenese, celbeweeglijkheid, apoptose, organisatie van het cytoskelet, en dienen als platforms voor interactie met de extracellulaire matrix (ECM) [3, 4]. Met name THBS1 en THBS2 zijn speciaal in deze familie voor hun type I herhalingen en beiden zijn voornamelijk weergegeven als remmers van angiogenese [5, 6], een belangrijk onderdeel van het onderzoek naar kanker [7-9]. Microvasculaire dichtheid (MVD) is een veel gebruikte parameter om de mate van angiogenese schatten tumoren met CD34 zijn de microvaatje aanwezig in maagkanker [10]. Gebaseerd op de eerdere bevindingen [2], we uit een hypothese gebracht in onze studie dat het ook kan beïnvloeden de angiogenese bij maagkanker.
Daarnaast angiogenese is THBS2 gemeld om met meerdere cellen, groeifactoren en ECM eiwitten en reguleren apoptose, celproliferatie en aanhechting [11]. Bij kanker onderzoek, zijn toenemende aandacht gericht op THBS2. Tokunaga et al. [12] vonden dat THBS2 expressie bij patiënten met colonkanker vertoonde een significant lager risico op levermetastasen en vasculariteit van de tumor in vergelijking met patiënten met tumoren waren THBS2 deficiëntie. Bovendien De Fraipont et al. [13] heeft aangetoond dat THBS2 was significant gecorreleerd met klinische status en het resultaat en de meeste tumoren, er een omgekeerde correlatie tussen de THBS2 expressieniveau en de mate van hun maligniteit. Daarnaast THBS2 speelde eveneens een belangrijke rol bij borstkanker [14], myeloma [15], maligne melanoom [16], prostaatkanker [17] en pulmonaire adenocarcinomen [18, 19]. Bij maagkanker kunnen andere leden van THBSs, THBS1 [20] en THBS4 [21] als een prognostische biomarker of een krachtige marker diffuse type gastrische adenocarcinomen. Echter, de gedetailleerde functie van THBS2 bij maagkanker en de gevolgen daarvan voor de klinische diagnose nog steeds somber. Zo hebben we geprobeerd om de klinische betekenis van THBS2 en het effect bij maagkanker te onthullen.
Om onze bovengenoemde hypothese te verifiëren, onderzochten we de THBS2 expressie niveaus in maagkanker weefsels en overeenkomstige normale weefsels en vervolgens onderzocht de mogelijke correlaties tussen de expressie van THBS2 en clinicopathologische features, klinische prognose en de MVD tellen bij patiënten met maagkanker. Daarnaast werden kolonievorming assay endotheelcel buisvorming assay, celmigratie en apoptose assay analyse in MKN-45 en SGC-7901 cellijnen om de in vitro effect van
THBS2 bij maagkanker cellen staand.
Resultaten
Patient kenmerken en klinische uitkomsten
In de huidige studie, we ingeschreven 129 in aanmerking komende patiënten, die bestond uit 101 mannen en 28 vrouwen. De leeftijd van de patiënten varieerde 29-80 jaar (y) met een mediane leeftijd van 61y. Alle klinisch-pathologische kenmerken zijn samengevat in tabel 1. De mediane totale overleving (OS) van de patiënten was 57 maanden, en de gemiddelde OS was 44,01 [95% betrouwbaarheidsinterval (CI) 39,78-49,24 maanden] .table 1 Association onder clinicopathologische variabelen en THBS2 meningsuiting en de algehele overleving van maagkankerpatiënten
Variabelen
Negatief
Positief
Totaal Aantal
P waardeA
Overall survival OS
Log-Rank Pb
HR (95% CI) verhuur No. (%) verhuur No. (%)
Age (y )
0.112
0,743 Restaurant < 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (referentie)
≥61
35 ( 53.0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67-1,77)
Gender
0,831
0,405
Man
47 (46,5)
54 ( 53.5)
101
1 (referentie)
Vrouw
12)
(42,9)
16 (57,1)
28
0,76 (0,40-1,45 histologische graad
0.005
0,011
Well en matige
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (referentie)
Poor en overig 35 (60.3 )
23 (39,7)
58
1,89 (1,16-3,09)
Tumor locatie
0,419
0,204
Upper
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (referentie)
Midden
15 (53,6)
13 (46,4)
28
1,66 (0,86-3,18)
Lower
17 (50,0)
17 (50,0)
34
1,90 (0,90-4,01)
Diepte van de invasie
0,271
0.001
T1-T2
9 ( 34.6)
17 (65,4)
26
1 (referentie)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11,60 (2,83 -47,45)
lymfekliermetastasen
0,454 Restaurant < 0,001
Afwezig
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (referentie)
Present
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5,16 (2,46-10,84)
TNM stadium
0,283 Restaurant < 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (referentie)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52-14,49)
Bold waarde is statistisch significant bij P Restaurant < 0,05, gevaar HR-ratio.
, P
waarde van klinisch-pathologische variabelen en THBS2 meningsuiting.
B, P
waarde van de associatie tussen de klinisch-pathologische variabelen en de algehele overleving van maagkankerpatiënten.
THBS2 wordt down-gereguleerd bij maagkanker
om de expressieniveaus van THBS2 bij maagkanker kunnen bepalen werden eerst beoordeeld het mRNA expressieniveaus van THBS2
bij maagkanker door kwantitatieve real-time in het tweede cohort. Dit cohort van monsters, in Methods vermeld, inclusief 14 menselijke maagkanker en de overeenkomstige normale weefsels. Zoals getoond in figuur 1A, THBS2
niveaus waren beduidend lager in 85,7% (12 van 14) van de maagkanker weefsels dan de normale controles, terwijl de overblijvende twee paren van de monsters vertoonden het tegenovergestelde. Vervolgens gedetecteerd we het eiwit expressieniveaus van THBS2 via Western blot van dezelfde groep. Zoals getoond in Figure1B en C, observeerden we dat THBS2 eiwit expressieniveaus daalden in 85,7% (12 van 14) van de tumormonsters in vergelijking met de overeenkomstige controle, terwijl monster 5 en 11 invers weergegeven. Om deze bevinding te bevestigen we verder uitgevoerd een tissue microarray (TMA) en beoordeelde de eiwitexpressie niveaus van THBS2 volgens de immunoreactiviteit score (IRS) van elk monster. We vonden THBS2 eiwitten werden voornamelijk in het cytoplasma van gastrische cellen (Figuur 2A), en volgens de resultaten van western blot, de niveaus van THBS2 significant geremd bij maagkanker weefsels vergeleken met normale controles (figuur 2B, P <0,05). Samengevat, onze resultaten blijkt dat THBS2 neerwaarts gereguleerd bij maagkanker zowel mRNA en eiwitniveaus. Figuur 1 mRNA en eiwit expressieniveau van THBS2 in 14 maagkanker weefsels en de overeenkomstige normale weefsel. (A) Relatieve mRNA expressie van THBS2 werd gedetecteerd door kwantitatieve real-time PCR. Expressie van normale weefsels werden genormaliseerd tot 1,0 zoals aangegeven. (B) De densitometrie analyseresultaten van de THBS2 bands werden genormaliseerd op GAPDH middels Afbeelding J. Expressie van normale weefsels werden genormaliseerd tot 1,0 zoals aangegeven. (C) Relatieve eiwit expressie van THBS2 werd geschat door Western blot assay.
Figuur 2 Immunohistochemische analyse van THBS2, CD34. (A) Representatieve beelden van THBS2 en CD34 uitdrukking: N1, N2, N3, N4, normaal de maag weefsel (N); M1, M2, M3, M4, matig gedifferentieerd (M); P1, P2, P3, P4, slecht gedifferentieerde (P). Vergroting: 100 x (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) en 400 × (N2, M2, P2). (B) Vergelijking van THBS2 expressie van maagkanker (n = 129) en normale gastrische weefsels (n = 24) in TMA. De THBS2 expressie niveau gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. (C) Vergelijking van MVD in THBS2-positieve maagkanker groep (n = 70) en THBS2-negatieve maagkanker groep (n = 59). Dots vertegenwoordigen MVD van elke monsters. Waarden zijn gemiddelden ± SEM.
THBS2 expressieniveaus zijn omgekeerd gecorreleerd met histologische soorten maagkanker Belgique Om het klinische belang van THBS2 verdere verduidelijking, analyseerden we de relatie tussen THBS2 eiwitexpressie en klinische kenmerken zoals leeftijd, geslacht, histologische rang, tumor locatie, de diepte van de invasie, lymfekliermetastasen en TNM stadium van maagkanker patiënten in THBS2-positieve en negatieve groepen. Zoals getoond in Tabel 1, vonden we een significante omgekeerde correlatie met de histologische soorten maagkanker (P
< 0,01). De histologische kwaliteiten van de patiënten in THBS2-positieve groep was het meer waarschijnlijk om goed en matig, terwijl patiënten in THBS2-negatieve groep verzorgde armen en andere te zijn. Maar we geen enkele betekenis statistisch ontdekken tussen de expressieniveaus van THBS2 en andere klinische parameters. Gezamenlijk, onze bevindingen suggereren dat THBS2 omgekeerd gecorreleerd is met histologische graad van maagkanker.
THBS2 expressie niveaus worden omgekeerd gecorreleerd met MVD bij maagkanker
Vorige rapporten impliciete THBS2 kon tumor angiogenese regelen [6], maar niemand werd gemeld bij maagkanker. Daarom vroegen we of er correlaties tussen MVD en THBS2 expressie niveaus alsmede andere klinische parameters in onze klinische monsters. MVD 129 in maagkanker monsters varieerde van 0 tot 120, waarbij de mediaan van 40 en het gemiddelde van 48,12 ± 28,99 (gemiddelde ± SD) volgens de immunoreactiviteit van CD34 in onze TMA. Zoals getoond in Figuur 2C, werd THBS2 significant gecorreleerd met MVD. De MVD in THBS2-negatieve groep was veel hoger dan die in THBS2-positieve groep (P Restaurant < 0,001). Echter, we konden geen statistische verschillen tussen de MVD en andere clinicopathologic functies, waaronder klinische prognose in onze monsters nemen (gegevens niet getoond). Concluderend Onze ontdekkingen tonen dat THBS2 omgekeerd gecorreleerd met MVD bij maagkanker.
THBS2 significant geassocieerd met klinische prognose voor patiënten met maagkanker Belgique Om de relatie tussen THBS2 expressie en klinische prognose maagkankerpatienten onderzoeken, voerden we survival analyses door univariate en multivariate Cox's proportionele gevaren regressiemodel. Zoals getoond in Tabel 1, vonden we histologische graad, invasiediepte, lymfeklier en TNM waren statistisch significant voor OS factoren in univariate analyse. Echter, aangezien TNM fase bevat ook de informatie van de diepte van de invasie en lymfeklieren metastase, we verder uitgevoerd multivariate survival analyses gecorrigeerd voor de histologische rang en TNM stadium. We hebben gemerkt dat TNM stadium (P Restaurant < 0,001) en THBS2 expressie (P Restaurant < 0,01) waren beide onafhankelijke prognostische factoren voor de beoordeling van de patient outcomes. Hogere TNM etappe was een risicofactor voor langere OS [P Restaurant < 0,001, HR (hazard ratio) = 7,23, 95% CI 3,55-14,69) en verhoogde expressie van THBS2 was nog een gunstige factor voor langere OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% CI 0,31-0,85). Bovendien, Kaplan-Meier survival analyse verder bevestigd dat THBS2 expressie was significant gecorreleerd met de klinische resultaten (figuur 3, P < 0,01, n = 129). Patiënten met een lagere THBS2 expressie vertoonde een aanzienlijk korter OS [mediaan 36 maanden, gemiddelde 40,07 ± 3,65 (gemiddelde ± SE) maanden], terwijl patiënten met een hogere THBS2 expressie toonde een gunstige prognose [mediaan 59 maanden, gemiddelde 53,70 ± 2,95 (gemiddelde ± SE ) maanden]. Samen tonen onze resultaten aan THBS2 significant geassocieerd met de klinische prognose maagkanker patiënten, die een prognostische marker voor maagkanker kunnen worden. Figuur 3 Kaplan-Meier survival analyses met log-rank test voor de totale overleving (OS). Kaplan-Meier-analyse van de correlaties tussen verschillende THBS2 expressieniveaus en OS in 129 maagkankerpatiënten.
Overexpressie van THBS2 remt de groei van maagkanker cellen in vitro
Omdat THBS2 significant was downgereguleerd in gastrische kanker, we afleiden dat THBS2 groei kunnen remmen, apoptose bevorderen en versterken het migratievermogen van maagkanker cellen. Om onze hypothese te controleren, we eerst gebouwd een lentivirale vector stabiel express THBS2 transcripten in maagkanker cellijnen. Veranderde expressie van THBS2 in 293 T-cellen werd bevestigd door Western blot analyse (figuur 4A). Vervolgens kozen we MKN-45 en SGC-7901 cellijnen voor onze in vitro
onderzoek omdat de mRNA-expressieniveaus van THBS2 lager waren dan anderen (gegevens niet getoond). Vervolgens verricht de kolonievorming test om het effect van THBS2 op de groei van MKN-45 en SGC-7901 cellen geëvalueerd. Zoals getoond in Figuur 4B, hebben we cellen met overexpressie THBS2 gevormd significant minder kolonies op zachte agar vergeleken met die van controle-vector geïnfecteerde cellen (P
< 0,01 voor MKN-45 cellen en P
< 0,001 voor SGC-7901 cellen, respectievelijk). Daarnaast werd gekeken apoptose niveaus tussen de twee groepen in beide cellijnen en ontdekten dat THBS2 bevorderde apoptose in SGC-7901-cellen (Figuur 4F), maar niet in MKN-45 cellen (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1A). En er waren geen significante verschillen tussen de twee groepen SGC-7901 en MKN-45 cellijnen celmigratie volgens de transwell assays (aanvullende bestandsinformatie 1: Figuur S1B en C). Samengevat ondersteunen onze gegevens dat THBS2 belemmert de groei van maagkanker cellen in vitro eventueel via de regulering van apoptose. Figuur 4 Overexpressie van THBS2 remde de proliferatie van maagkanker cellen, onderdrukt de angiogenese van maagkanker, en promoveerde apoptose in SGC-7901-cellijn in vitro. (A) Western blot analyse van Vlag in 293 T-cellen met overexpressie THBS2. (B) Colony aantal analyse voor MKN-45 en SGC-7901-cellen met THBS2 overexpressie en negatieve controle. Waarden zijn gemiddelden ± SD van drie onafhankelijke experimenten. (C) Foto's van kolonievorming assay. (D) AngiogenicIndexCh1 analyse van endotheelcellen vaatvorming assay. Waarden zijn gemiddelden ± SD. (E) Beelden van endotheelcellen buis formatie assay. (F) Analyse van apoptose in MKN-45 cellijn. Waarden zijn gemiddelden ± SD.
THBS2 onderdrukt maagkanker angiogenese in vitro
THBS2 staat bekend als een remmer van angiogenese [2]. Om te bewijzen leveren van THBS2 regelt de angiogene fenotype van maagkanker, werden endotheelcellen buis vorming assays uitgevoerd. Zoals getoond in figuur 4E en D, zowel MKN-45 en SGC-7901 cellijnen, humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) gekweekt met het medium THBS2-overexpressie maagkanker cellen vertoonden significant lager AngiogenicIndexCh1 dan de negatieve controle (P
< 0,05 voor MKN-45 cellen en P Restaurant < 0,001 voor SGC-7901 cellen, respectievelijk). Gezamenlijk onze resultaten impliceren dat THBS2 onderdrukt de angiogenese van maagkanker cellen in vitro
.
Discussie
THBS2 een zogenaamde natuurlijke krachtige remmer van angiogenese en een modulator van het vernieuwingsproces [22, 23]. Geen van de vroegere onderzoeken de rol van THBS2 en de klinische relevantie bij maagkanker besproken.
Ten eerste bleek dat mRNA en eiwitexpressie niveaus THBS2 werden neerwaarts gereguleerd in de meeste monsters. Echter, een eerder onderzoek gerapporteerd THBS2 mRNA expressieniveaus in maagkanker hoger dan normale controle [24] was. Gezien de beperkte monstergrootte in deze studie, die op 6 weefselmonsters verwerkt, is het mogelijk dat dit verschil door tumor heterogeniteit twee paren onze tweede cohort had ook dezelfde patronen vertonen. Maar onze verdere gevolg van TMA, groter steekproefomvang, was in overeenstemming met het resultaat van de tweede cohort. Bij elkaar genomen, we geloofden dat THBS2 was meer kans om te worden geregeld bij maagkanker cel versus normale slijmvlies.
Bovendien hebben we ook gemerkt dat de relatieve expressie van de monsters verschillend tentoongesteld in mRNA en eiwit niveau. Over onvoldoende bewijzen, concluderen we dat de functie van THBS2 binnen maagkanker cellen worden gereguleerd door een aantal intracellulaire signalering upstream factoren, eiwit ubiquitinatie en andere mogelijke manieren, die van invloed kunnen de eiwitniveaus van THBS2 en fenotypes bij maagkanker cellen. En meer nadruk kunnen op deze interessant fenomeen worden. Toch is de meerderheid van de monsters van de tweede cohort getoonde dezelfde expressiepatronen tussen mRNA en eiwitniveaus.
Tweede onze gegevens bleek dat THBS2 apoptose alleen SGC-7901-cellen maar niet in MKN-45 cellen kunnen bevorderen. Vroegere onderzoek toonde dat een N-terminaal fragment van recombinant THBS2-CD36 gemedieerde endotheliale cellen apoptose [14], en de combinatie van CD36 en THBS2 kunnen de caspase signaleringsroute [25] te activeren kan activeren. Zo hebben we aangenomen dat de heterogeniteit van de twee cellijnen in onze studie, zoals gedifferentieerde CD36 uitdrukkingen kan mede de oorzaak van verschillende niveaus van apoptose geïnduceerd door THBS2, die opriep tot verder onderzoek zijn.
Derde, onze resultaten toonden dat THBS2 kon angiogenese van maagkanker te onderdrukken. Het is bekend dat de tumor proliferatie, invasie of metastase afhankelijk zijn van angiogenese [26]. En op basis van bewijzen ondersteunen onze ontdekking en wijzen erop dat de mogelijke mechanismen die THBS2 remt angiogenese: 1) een apoptose-onafhankelijke manier door het induceren van endotheelcellen apoptose, celcyclus arresteren en het verminderen van endotheliale celmigratie [27], 2) afhankelijk van caspase-signalering pathway geactiveerd door CD36 [28]. 3) functioneren als co-receptoren voor de LDL-receptor gerelateerde eiwit (LRP1), waarbij de complexen van THBS2 kon duidelijk met matrix metalloproteïnasen-2, -9 of vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) vanaf het pericellulaire omgeving van mesenchymale cellen [ ,,,0],29-32].
Tenslotte MVD is een van de meest gebruikte parameters om de mate van tumor angiogenese en eerdere studies hebben aangetoond MVD kan een onafhankelijke prognostische factor bij maagkanker en andere tumoren [33-35] te beoordelen. In onze studie vonden we MVD was significant gecorreleerd met THBS2 eiwitexpressie (P
< 0,001) in maagkanker, maar niet met klinische kenmerken en klinische prognose. Deze resultaten toonden dat THBS2 kunnen beïnvloeden angiogenese bij maagkanker, niettemin, omdat er geen correlatie tussen MVD en prognose bij onze monsters, we vermoeden dat hogere THBS2 term waaruit langere overleving niet louter tot het remmen van angiogenese van maagkanker, andere mechanismen zoals regulering ECM omvormen [23] en proliferatiesnelheid van maagkanker cellen kan ook de redenen dat verder onderzoek nodig om te ontdekken.
Tezamen onze bevindingen voorstelling op de belangrijke rol van THBS2 prognostische betekenissen en tumor proliferatie en angiogenese in maag kanker. Deze gegevens suggereren THBS2 een belangrijke prognostische marker voor maagkanker patiënten. Bovendien is uit de effecten van THBS2 op tumorontwikkeling en angiogenese, onze onderzoeken waardevolle aanwijzingen voor klinische praktijk moleculaire remmen therapeutische doelen gebruikt afgeleid uit de biologische kennis door de THBS2 handtekening.
Ontwikkelen Conclusie
Onze studie presenteert de eerste lijn van bewijs dat THBS2 expressie neerwaarts gereguleerd zowel mRNA en eiwitniveaus en verlaagde THBS2 expressie is geassocieerd met de armen histologische graad van maagkanker. Cruciaal is overexpressie van THBS2 heeft een significante correlatie met gunstige prognose van maagkanker patiënten. Anderzijds, THBS2 beïnvloed prognose bij maagkanker mogen alleen door regeling van de angiogenese, maar op andere manieren zoals regulering ECM omvorming en het remmen van de proliferatie van maagkanker cellen. Deze bevindingen suggereren dat THBS2 een potentieel kritieke rol in de pathogenese en progressie van maagkanker kan zijn. Wij bevestigen dat, met de geleidelijke diepgaande studies van THBS2, kan het een veelbelovende nuttige en eenvoudige biomarker voor het voorspellen van de klinische uitkomst voor maagkanker patiënten.
Methoden
Patiënten en weefselmonsters
In de huidige studie, we is voorzien van twee cohorten specimens. De eerste cohort bevatte 129 formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde menselijke maagkanker en 24 willekeurig geselecteerde normale gastrische weefsels. Zij werden achtereenvolgens aangeworven tussen december 2006 en mei 2008 van de afdeling Algemene Heelkunde, The First Affiliated Hospital van Anhui Medical University, Hefei, China. Deze monsters werden verwerkt in TMA voor immunohistochemische kleuring. Histologische kenmerken van deze monsters werden bevestigd door pathologen. Pathologische TNM staging werd geëvalueerd op basis van de criteria van de Amerikaanse Joint Committee on Cancer (AJCC) 2010. De tweede cohort bestond uit 14 maagkanker patiënten die resectie van de tumor therapie ondergaan bij de Achtste afdeling Algemene Heelkunde, The First Affiliated Hospital van Anhui Medical University. De verse maagkanker weefsel en overeenkomstige normale mucosa (minimaal 5 cm afstand van de tumor rand) werden onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot gebruik van kwantitatieve real-time PCR en Western blotanalyse. Patiënten in beide cohorten leverde preoperatieve chemotherapie en /of bestraling niet ontvangen. Schriftelijke informed consent werd verstrekt door alle deelnemers. Alle monsters werden anoniem verwerkt volgens de ethische normen. Deze studie werd uitgevoerd met de goedkeuring van de Ethische Toetsingscommissie van het ziekenhuis.
RNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit de tweede cohort behulp Trizol reagens (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant. cDNA werd gesynthetiseerd door willekeurige primers en Superscript II reverse transcriptase (Toyobo, Osaka, Japan). De primers die voor amplificatie voor THBS2: voorwaartse primer 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'en reverse primer 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) werd geamplificeerd in dezelfde Q-PCR als een interne controle gebruikt primers: voorwaartse primer 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'en reverse primer 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. De reactie ontving de ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA) in de aanwezigheid van SYBR-groene kleurstof (Toyobo, Osaka, Japan). De reactieomstandigheden een programma denaturatie (95 ° C gedurende 5 min), en een amplificatie en kwantificatie programma 40 cycli (95 ° C gedurende 15 s en 60 ° C gedurende 45 s). Elk monster werd in triplo getest en een smeltcurve analyse van elk monster werd gebruikt om de specificiteit van amplificatie controleren. Het expressieniveau werd bepaald als een verhouding tussen THBS2 en de interne controle GAPDH van de hoeveelheid mRNA berekend vergelijkende CT methode.
Eiwitextractie en Western blot
Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit 14 bevroren maagkanker en de overeenkomstige normale slijmvlies weefsel door het ijs in de radio-immunoprecipitatie assay Lysis Buffer (RIPA; Beyotime instituut voor Biotechnologie, Jiangsu, China), en wordt gemeten met behulp van een BCA proteïne testkit (Beyotime instituut voor Biotechnologie, Jiangsu, China). Het lysaat werd gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 5 minuten en het supernatant werd gedurende 5 minuten verhit bij 100 ° C. Dan equivalente eiwitten van elk paar monsters werden gescheiden op 8% natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese en electroforese polyvinylideenfluoride membranen (Millipore, Billerica, MA). Na het blokkeren met TBST met 5% magere melk bij kamertemperatuur gedurende één uur, werden de membranen geblot met anti-THBS2 antilichaam (1: 1500, Novus) en anti-Flag (1: 3000; Sigma). Gevolgd membranen incubatie met mierikswortelperoxidase-gemerkte anti-konijn en anti-muizen-IgG als secundair antilichaam (Beyotime Instituut voor Biotechnologie). Anti-GAPDH antilichaam (1: 4000; Aogma) werd gebruikt als een lading controle antilichaam. De gebonden antilichamen werden gedetecteerd met de versterkte chemiluminescentie methode.
Immunohistochemie en TMA analyse
Maagkanker en normale maagslijmvlies monsters werden formaline-gefixeerde, in paraffine ingebed en werden gebruikt om een ​​weefsel TMA construeren. H &E-gekleurde coupes werden gescreend op optimale intratumorale weefsel te identificeren voor analyse. 4-pm dikke secties werden gebakken bij 60 ° C gedurende 1 uur, deparaffinised met xylenen en gerehydrateerd in gegradeerde ethanol gedestilleerd water. Antigen herstel werd bereikt door het plaatsen van de secties met citraatbuffer in een stomer rijst gedurende 30 minuten. De endogene peroxidase-activiteit te blussen, werden de coupes behandeld met 3% H 2O 2 in methanol. Vervolgens gebruikten we 1% runderserumalbumine aan de niet-specifieke binding te blokkeren. Anti-THBS2 antilichaam (Novus, 1: 2000) en anti-CD34 (Abcam, 1: 250) werden geïncubeerd met de secties 37 ° C gedurende de nacht, daarna geïncubeerd met mierikswortel peroxidase-gelabeld anti-konijn IgG als secundair antilichaam (Life Technologies). Op het einde, werden dia's op een Autostainer koppeling instrument geplaatst en ga verder met vlekken. Voor negatieve controles werden de primaire antilichamen vervangen normaal konijnenserum. De uiteindelijke effectieve immunohistochemische kleuring werd beoordeeld door twee onafhankelijke pathologen zonder de gegevens van de patiënten volgens de kleurintensiteit en de mate van kleuring. Weefselsectie werd gescoord als het percentage gekleurde cytoplasma in maagkanker kliercellen en normale kliercellen (0 punten voor geen cellen bevlekt, 1 voor < 25%, 2 punten voor 25-75% en 3 punten > 75 % van de cellen gekleurd) en de kleurintensiteit van immunoreactiviteit werd beoordeeld op een schaal van 0 tot 3. de immunoreactiviteit score (IRS) is het resultaat van de vermenigvuldiging van beide parameters. Monsters werden als volgt gescoord: negatief (IRS = 0 ~ 2), positieve (IRS = 3 ~ 9)
MVD tellen
Immunohistochemische kleuring van CD34 en algemeen aanvaarde criteria uitgevoerd door Weidner et al.. [36] werden gebruikt voor MVD tellen. Elke gekleurde endotheelcellen en endotheliale cellen werden gescheiden clusters van aangrenzende microvaatjes en de dikte van elke vaatwand dan 2,75 pm worden uitgesloten. Drie afzonderlijke gedeelten met hot-spots (waarbij het hoogste aantal discrete microvaten werd gekleurd) in elk monster van TMA werden gekozen in lage vergroting (100 x) onder een lichtmicroscoop (Leica, Duitsland). Vervolgens werden microvaatjes geteld in elke sectie in een sterke vergroting (200 x).

• Lnc RNA hetelucht functioneert als een concurrerend endogeen RNA naar HER2 expressie reguleren door sponzen miR-331-3p in de maag cancer
• Proteomics verandering in gastic adenocarcinomen van de Japanse patiënten