regulación a la baja de Thrombospondin2 predice un mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico

La regulación por disminución de Thrombospondin2 predice un mal pronóstico en pacientes con cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

thrombospondins (THBSs) son una familia de multidominio y secretada Ca matricellular 2 + unión a las glicoproteínas que tiene al menos cinco miembros codificada por genes independientes. Como miembro de la familia THBSs, Thrombospondin2 (THBS2) ha sido reportado para regular la angiogénesis. Sin embargo, las funciones y la importancia clínica de THBS2 aún sigue siendo poco clara en el cáncer gástrico.
Métodos
Los niveles de mRNA y de expresión proteica de THBS2 se evaluaron en 14 emparejada de especímenes de cáncer gástrico y de las mucosas normales correspondientes utilizando cuantitativa en tiempo real PCR y análisis de transferencia Western. La inmunohistoquímica de THBS2 y CD34 en microarrays de tejidos basados ​​en la población que consiste en 129 casos de cáncer gástrico se utilizaron para evaluar la importancia pronóstica de THBS2 y microvasos densidad (MVD) de cada muestra. Los análisis de supervivencia se realizaron por el método de Kaplan-Meier y el modelo de riesgos proporcionales de Cox. ensayo de colonias de formación, ensayo de formación de tubo celular endotelial, ensayo de migración celular y el análisis de la apoptosis en líneas celulares de SGC-7901 MKN-45 y se llevaron a cabo para evaluar los efectos de THBS2 sobre el cáncer gástrico in vitro
.
Resultados
85,71% (12 de 14) tejidos de cáncer gástrico expresadas THBS2 notablemente más baja en ambos niveles de ARNm y proteínas que los controles normales correspondientes. Consistentemente, los resultados de microarrays (TMA) de tejido mostraron niveles THBS2 también se inhibieron en tejidos de cáncer gástrico en comparación con los controles normales. Por otra parte, se observó que los pacientes con niveles más altos de THBS2 se correlacionaron significativamente con el pronóstico más favorable, mientras que disminuyó la expresión THBS2 se asociaron con grados histológicos de cáncer gástrico más pobres. Además, nuestros experimentos in vitro han demostrado, además, que la sobreexpresión de THBS2 podría impedir tanto la tasa de proliferación y la formación de tubos de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en MKN-45 y SGC-7901 líneas celulares.
Conclusión Nuestro
estudio sugiere THBS2 se expresa de forma aberrante en el cáncer gástrico y juega un papel crítico en la progresión del cáncer, que puede ser un potencial predictor pronóstico del cáncer gástrico.
Palabras clave
cáncer gástrico THBS2 angiogénesis pronóstico biomarcador Introducción
el cáncer gástrico es una altamente agresivo y letal enfermedad maligna. se estima un total de 952.000 nuevos casos de cáncer de estómago y 723.000 muertes que se han producido en el año 2012, lo que representa el 6,8% del total de casos y el 8,8% del total de muertes. Por otra parte, dos nuevos casos y muertes de cáncer gástrico en China, la 1 a nivel mundial, lo que representa más del 40% de los que en el mundo [1]. Por lo tanto grandes preocupaciones son criados para las investigaciones de cáncer gástrico.
Thrombospondins (THBSs) son una familia de Ca multidominio y matricellular 2 + -vinculante glicoproteínas secretadas por los fibroblastos del estroma, células endoteliales y células inmunes [2]. Tienen al menos cinco miembros codificados por genes independientes. Mediante la unión con numerosas proteínas objetivo, participan en diversos procesos biológicos tales como la angiogénesis, la motilidad celular, la apoptosis, la organización del citoesqueleto, y sirven como plataformas de interacción en la matriz extracelular (ECM) [3, 4]. En particular, THBS1 y THBS2 son especiales en esta familia por sus repeticiones de tipo I y dos de ellos se muestran principalmente como inhibidores de la angiogénesis [5, 6], una parte clave de la investigación del cáncer [7-9]. densidad de los microvasos (MVD) es un parámetro ampliamente utilizado para estimar el grado de la angiogénesis en los tumores con CD34 es el fabricante de los microvasos en el cáncer gástrico [10]. Con base en los resultados anteriores [2], hemos presentado una hipótesis en nuestro estudio que también podría afectar a la angiogénesis en el cáncer gástrico.
Además de la angiogénesis, THBS2 ha informado de interactuar con los receptores de las células múltiples, factores de crecimiento y proteínas ECM así como regular la apoptosis, la proliferación celular y la adhesión [11]. En investigaciones de cáncer, atenciones crecientes se han centrado en THBS2. Tokunaga et al. [12] encontró que THBS2 expresa en pacientes con cáncer de colon mostró un menor riesgo significativo de metástasis hepáticas y la vascularización del tumor en comparación con los pacientes cuyos tumores eran deficiencia THBS2. Además, De Fraipont et al. [13] demostraron que THBS2 se correlacionó significativamente con el estado clínico y los resultados, y para la mayoría de los tumores, hubo una correlación inversa entre el nivel de expresión THBS2 y su grado de malignidad. Además, THBS2 también jugó un papel clave en el cáncer de mama [14], mieloma [15], el melanoma maligno [16], el cáncer de próstata [17] y adenocarcinoma pulmonar [18, 19]. En el cáncer gástrico, otros miembros de THBSs, THBS1 [20] y THBS4 [21] podría ser como un biomarcador de pronóstico o un potente marcador de tipo difuso adenocarcinomas gástricos. Sin embargo, la función detallada de THBS2 en el cáncer gástrico y sus implicaciones para diagnóstico clínico sigue siendo pésimo. Por lo tanto, hemos intentado dar a conocer la importancia clínica de THBS2 y su efecto en el cáncer gástrico.
Para comprobar nuestra hipótesis antes mencionada, se examinaron los niveles de expresión THBS2 en tejidos de cáncer gástrico humano y los tejidos normales correspondientes y luego exploramos las posibles correlaciones entre la expresión de THBS2 y características clinicopatológicas, pronóstico clínico y el recuento MVD en pacientes con cáncer gástrico. Además, el ensayo de formación de colonias, ensayo de formación de tubo celular endotelial, ensayo de migración celular y análisis de apoptosis se llevaron a cabo en líneas celulares de SGC-7901 MKN-45 y para explorar la vitro
vigor en de THBS2 en las células de cáncer gástrico.
resultados
características de los pacientes y los resultados clínicos
En el presente estudio, que incluyó a 129 pacientes elegibles, que consistía en 101 hombres y 28 mujeres. La edad de los pacientes osciló entre 29 a 80 años (y) con una edad media de 61y. Todas las características clinicopatológicas se resumen en la Tabla 1. La mediana de supervivencia global (OS) de los pacientes fue de 57 meses, y la media de la SG fue 44,01 [95% intervalo de confianza (IC) 39.78-49.24 meses] .Tabla 1 Asociación entre las variables clinicopatológicas y THBS2 expresión y la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico
variables
negativo positivo
La
total Nº
P valorA
En general la supervivencia OS de prueba gratis de log-rank Pb
HR (IC del 95%)
n. (%)
n. (%)
Edad (a ): perfil del 0,112 0,743
Hotel < 61
24 (38,1) guía 39 (61,9) 63

1 (referencia)
≥61
35 ( 53,0)
31 (47,0) 66

1,09 (0,67-1,77)
Género
0,831 0,405

Hombre
47 (46,5)
54 ( 53.5)
101
1 (referencia)
Mujer página 12 (42,9)
16 (57,1) 28

0,76 (0,40-1,45)
El grado histológico
0,005 0,011

Bueno y moderada
24 (33,8)
47 (66,2) 71

1 (referencia)
pobres y otros
35 (60,3 )
23 (39,7) 58

1.89 (01.16 a 03.09)
Localización del tumor
0,419 0,204

superior
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (referencia)
centro
15 (53,6) página 13 (46,4) 28

1,66 (0,86-3,18)
Baja
17 (50,0)
17 (50,0) 34

1,90 (0,90-4,01)
profundidad de la invasión
0,271 0,001

T1-T2 página 9 ( 34.6)
17 (65,4) 26

1 (referencia)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5) 103

11,60 (2,83 -47,45)
metástasis de ganglios linfáticos
0,454 Hotel < 0,001
Ausente
17 (40,5)
25 (59,5) 42

1 (referencia)
actual
42 (48.3)
45 (51,7) 87

5,16 (2,46-10,84)
estadio TNM
0,283 Hotel < 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4) 53

1 (referencia)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52-14,49)
valor negrita es estadísticamente significativas a P Hotel < 0,05, índice de riesgo de recursos humanos.
Una, P
valor de las variables clinicopatológicas y THBS2 expresión. Francia B, P
valor de asociación entre las variables clinicopatológicas y supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico.
THBS2 es el regulado en el cáncer gástrico
con el fin de determinar los niveles de expresión de THBS2 en el cáncer gástrico, primero se evaluaron los niveles de expresión de ARNm de THBS2
en el cáncer gástrico por cuantitativa en tiempo real en la segunda cohorte. Esta cohorte de muestras, que se menciona en los métodos, incluido 14 cáncer gástrico humano y los tejidos normales correspondientes. Como se muestra en la Figura 1A, THBS2
niveles fueron marcadamente menor en 85,7% (12 de 14) de los tejidos de cáncer gástrico que sus controles normales, mientras que los dos pares restantes de las muestras exhibieron lo contrario. Entonces, detectamos los niveles de expresión de proteínas de THBS2 a través de Western blot en la misma cohorte. Como demostración en Figure1B y C, se observó que la proteína THBS2 niveles de expresión se redujeron en 85,7% (12 de 14) de las muestras tumorales en comparación con su control correspondiente, mientras que la muestra 5 y 11 muestran inversamente. Para confirmar este hallazgo, se realizó además un microarray tisular (TMA) y se evaluaron los niveles de expresión de proteínas de THBS2 acuerdo con la puntuación inmunoreactividad (IRS) de cada muestra. Encontramos THBS2 proteínas se expresan principalmente en los citoplasmas de las células gástricas (Figura 2a), y de acuerdo con los resultados de transferencia de Western, los niveles de THBS2 fueron significativamente inhibido en tejidos de cáncer gástrico en comparación con los controles normales (Figura 2B, P < 0,05). Tomados en conjunto, nuestros resultados demuestran que THBS2 es el regulado en el cáncer gástrico, tanto en los niveles de proteína y ARNm. Figura 1 mRNA y el nivel de expresión de la proteína de THBS2 en 14 tejidos de cáncer gástrico y el tejido normal correspondiente. (A) expresión de ARNm relativa de THBS2 fue detectado por cuantitativa en tiempo real PCR. La expresión de los tejidos normales se normalizaron a 1,0 como se indica. resultados de los análisis (B) La densitometría de las bandas THBS2 se normalizaron a GAPDH utilizando Image J. Expresión de tejidos normales se normalizaron a 1,0 como se indica. (C) la expresión de proteínas relativa de THBS2 se estimó por el ensayo de Western blot.
Figura 2 El análisis inmunohistoquímico de THBS2, CD34. (A) Imágenes representativas de THBS2 y expresión CD34: N1, N2, N3, N4, tejido gástrico normal (N); M1, M2, M3, M4, moderadamente diferenciado (M); P1, P2, P3, P4, pobremente diferenciado (P). Ampliación: 100x (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) y 400 × (N2, M2, P2). (B) comparación de la expresión THBS2 de cáncer gástrico (n = 129) y los tejidos gástricos normales (n = 24) en TMA. El nivel de expresión THBS2 presentan como media ± SEM. (C) Comparación de MVD en el grupo de cáncer gástrico THBS2-positivo grupo de cáncer gástrico (n = 70) y THBS2-negativo (n = 59). Los puntos representan MVD de cada muestra. Los valores son medias ± SEM.
Niveles de expresión se THBS2 inversa correlacionadas con los grados histológicos de cáncer gástrico
Para aclarar aún más la importancia clínica de THBS2, hemos analizado la relación entre la expresión de la proteína THBS2 y las características clínicas como la edad, el género, histológicos grado, la localización del tumor, profundidad de la invasión, metástasis de ganglios linfáticos y TNM etapa de pacientes con cáncer gástrico en grupos THBS2-positivos y negativos. Como se muestra en la Tabla 1, se encontró una correlación inversa significativa con los grados histológicos de cáncer gástrico (P Hotel < 0,01). Los grados histológicos de los pacientes del grupo THBS2-positivos tenían más probabilidades de estar bien y moderada, mientras que los pacientes en el grupo THBS2-negativos tendían a ser pobre y otra. Sin embargo, no hemos podido descubrir ninguna significación estadística entre los niveles de expresión de THBS2 y otros parámetros clínicos. En conjunto, nuestros resultados sugieren que THBS2 se correlaciona inversamente con el grado histológico de cáncer gástrico.
Niveles de expresión se THBS2 inversa correlacionadas con MVD en el cáncer gástrico y los informes de anteriores THBS2 implícita podrían regular la angiogénesis tumoral [6], sin embargo, se informó que ninguno en el cáncer gástrico. Por lo tanto, nos preguntamos si había alguna correlación entre los niveles de expresión MVD y THBS2, así como otros parámetros clínicos en nuestras muestras clínicas. El MVD en 129 especímenes de cáncer gástrico varió de 0 a 120, con la mediana de 40 y la media de 48,12 ± 28,99 (media ± SD) de acuerdo con la inmunorreactividad de CD34 en nuestra TMA. Como se muestra en la Figura 2C, THBS2 se correlacionó significativamente con la MVD. El MVD en el grupo THBS2-negativo fue mucho mayor que en el grupo THBS2-positivos (P
< 0,001). Sin embargo, no pudimos observar ninguna diferencia estadística entre MVD y otras características clínico-patológicas, incluyendo el pronóstico clínico en nuestras muestras (datos no mostrados). En conclusión, nuestros hallazgos demuestran que THBS2 se correlaciona inversamente con MVD en el cáncer gástrico.
THBS2 se asoció significativamente con el pronóstico clínico de los pacientes con cáncer gástrico
Para examinar la relación entre la expresión THBS2 y el pronóstico clínico de los pacientes con cáncer gástrico, se realizaron análisis de supervivencia en un modelo de regresión de riesgos proporcionales univariante y multivariante de Cox. Como se muestra en la Tabla 1, encontramos el grado histológico, profundidad de la invasión, metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio TNM fueron factores estadísticamente significativos para la OS en el análisis univariado. la supervivencia multivariante Sin embargo, desde el estadio TNM también contiene la información de la profundidad de la invasión y la metástasis de los ganglios linfáticos, se realizó un análisis adicionales con ajuste para el grado histológico y el estadio TNM. Nos dimos cuenta de que el estadio TNM (P Hotel < 0,001) y la expresión THBS2 (P Hotel < 0,01) fueron los dos factores pronósticos independientes para la evaluación de los resultados de los pacientes. TNM etapa superior era un factor de riesgo para el sistema operativo más largo [P Hotel < 0,001, HR (HR) = 7,23; IC del 95%: 3,55 a 14,69) y la elevada expresión de THBS2 fue sin embargo un factor favorable para el sistema operativo más largo (P
< 0,01, HR = 0,51, IC del 95%: 0,31 a 0,85). Por otra parte, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier confirmó además que la expresión THBS2 se correlacionó significativamente con los resultados clínicos (Figura 3, P < 0,01, n = 129). Los pacientes con menor expresión THBS2 muestran una supervivencia general significativamente más corta [mediana de 36 meses, con una media de 40,07 ± 3,65 (media ± SE) meses], mientras que los pacientes con mayor expresión THBS2 mostraron un pronóstico favorable [mediana de 59 meses, la media de 53,70 ± 2,95 (media ± EE ) meses]. En conjunto, nuestros resultados demuestran THBS2 se asoció significativamente con el pronóstico clínico de los pacientes con cáncer gástrico, lo que podría convertirse en un marcador pronóstico para el cáncer gástrico. Figura 3 de supervivencia de Kaplan-Meier análisis con la prueba de log-rank para la supervivencia global (OS). El análisis de Kaplan-Meier de las correlaciones entre los diferentes niveles de expresión THBS2 y OS en 129 pacientes con cáncer gástrico.
La sobreexpresión de THBS2 inhibe el crecimiento de células de cáncer gástrico in vitro
Debido THBS2 fue significativamente las reguladas en gástrica cáncer, inferimos que THBS2 podría inhibir el crecimiento, la promoción de la apoptosis y aumentar la capacidad de migración de células de cáncer gástrico. Para comprobar nuestra hipótesis, se construyó un vector lentiviral que expresa transcripciones THBS2 estables en líneas celulares de cáncer gástrico. La expresión alterada de THBS2 en 293 células T se confirmó por Western blot (Figura 4A). A continuación, elegimos MKN-45 y SGC-7901 líneas celulares in vitro para nuestro estudio en
debido a que los niveles de expresión de ARNm de THBS2 eran más bajos que otros (datos no mostrados). A continuación realizó el ensayo de formación de colonias para evaluar los efectos de THBS2 sobre el crecimiento de MKN-45 y las células SGC-7901. Como se muestra en la Figura 4B, encontramos células con sobreexpresión THBS2 formado número significativamente menor de colonias en agar blando en comparación con los de las células infectadas por vectores de control (P
< 0,01 para MKN-45 células y P
< 0,001 para células SGC-7901, respectivamente). Por otra parte, se examinaron los niveles de apoptosis entre los dos grupos en ambas líneas celulares y descubrimos que THBS2 promueve la apoptosis en células SGC-7901 (Figura 4F), pero no en las células MKN-45 (archivo adicional 1: Figura S1A). Y no hubo diferencias significativas entre los dos grupos en líneas de células MKN-45 SGC-7901 y en la migración de células de acuerdo con los ensayos transwell (archivo adicional 1: Figura S1B y C). En resumen, nuestros datos apoyan que THBS2 impide el crecimiento de células de cáncer gástrico in vitro posiblemente a través de la regulación de la apoptosis. Figura 4 La sobreexpresión de THBS2 inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico, suprime la angiogénesis del cáncer gástrico, y promover la apoptosis en la línea celular SGC-7901 in vitro. (A) Western blot de la bandera en células 293 T con THBS2 sobreexpresión. (B) Análisis número de colonias de MKN-45 y células SGC-7901 con THBS2 sobreexpresión y el control negativo. Los valores son medias ± SD de tres experimentos independientes. (C) Imágenes de ensayo de formación de colonias. (D) Análisis de AngiogenicIndexCh1 de ensayo de formación de tubo celular endotelial. Los valores son medias ± SD. (E) Imágenes del ensayo de formación de tubo celular endotelial. Análisis (F) de la apoptosis en la línea celular MKN-45. Los valores son medias ± SD.
THBS2 suprime el cáncer gástrico angiogénesis in vitro
THBS2 es conocido como un inhibidor de la angiogénesis [2]. Para proporcionar evidencias de THBS2 regula el fenotipo angiogénico de cáncer gástrico, ensayos de formación de tubos de células endoteliales se llevaron a cabo. Como se muestra en la Figura 4E y D, en ambas líneas celulares MKN-45 y SGC-7901, las células humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) en cultivo con el medio de células de cáncer gástrico THBS2-sobreexpresión mostraron AngiogenicIndexCh1 significativamente más bajos que el control negativo (P
< 0,05 para MKN-45 y P células Hotel < 0,001 para las células SGC-7901, respectivamente). En conjunto, nuestros resultados implican que THBS2 suprime la angiogénesis de células de cáncer gástrico in vitro
.
Discusión
THBS2 es conocido como un potente inhibidor natural de la angiogénesis y un modulador del proceso de remodelación [22, 23]. Sin embargo, ninguna de las anteriores investigaciones discute el papel de los THBS2 y su importancia clínica en el cáncer gástrico.
En primer lugar, se encontró que los niveles de mRNA y de expresión proteica de THBS2 se redujeron regulado en la mayoría de las muestras. Sin embargo, una investigación anterior informó THBS2 de ARNm de los niveles de expresión en el cáncer gástrico fueron más altos que el control normal [24]. Considerando el tamaño limitado de la muestra en este estudio, que incorpora sólo 6 muestras de tejido, es posible de esta diferencia debido a la heterogeneidad tumoral para dos pares de nuestra segunda cohorte también mostró los mismos patrones. Sin embargo, nuestro resultado posterior de TMA, mayor en tamaño de la muestra, fue consistente con el resultado de la segunda cohorte. Tomados en conjunto, creíamos que THBS2 era más probable que se rige en el celular de cáncer gástrico en comparación con la mucosa normal.
Por otra parte, también notamos que la expresión relativa de las muestras exhibieron de manera diferente en ARNm y proteínas. Al carecer de suficientes evidencias, inferimos que la función de THBS2 dentro de las células de cáncer gástrico puede estar regulada por algunos factores intracelulares de señalización aguas arriba, ubiquitinación de proteínas, y otras maneras posibles, que pueden afectar los niveles de proteína de THBS2 y los fenotipos de células de cáncer gástrico. Y aún más énfasis se puede poner en este interesante fenómeno. Sin embargo, la mayoría de las muestras de nuestro segunda cohorte muestra los mismos patrones de expresión entre niveles de ARNm y de proteínas.
En segundo lugar, nuestros datos muestran que THBS2 podría promover la apoptosis sólo en células SGC-7901 pero no en MKN-45 células. Ex investigaciones mostraron que un fragmento recombinante N-terminal de THBS2 podría activar CD36 mediada por apoptosis de las células endoteliales [14], y la combinación de CD36 y THBS2 podría activar la vía de señalización de caspasa [25]. Por lo tanto, se asumió que la heterogeneidad de las dos líneas celulares utilizadas en nuestro estudio, al igual que las expresiones CD36 diferenciadas, podría ser en parte la razón de los diferentes niveles de apoptosis inducida por THBS2, que pidió más investigaciones.
En tercer lugar, nuestros resultados mostraron que THBS2 podría suprimir la angiogénesis del cáncer gástrico. Se sabe que la proliferación tumoral, invasión, o metástasis son dependientes de la angiogénesis [26]. Y evidencias basadas apoyan nuestra descubrimiento y señalan que los posibles mecanismos que THBS2 inhibe la angiogénesis: 1) una forma de apoptosis independiente mediante la inducción de apoptosis de células endoteliales, el ciclo celular deteniendo y la disminución de la migración de las células endoteliales [27], 2) dependiente de la señalización de caspasa vía activada por CD36 [28]. 3) que funciona como co-receptores para la proteína relacionada con la lipoproteína de baja densidad de receptor (LRP1), que podría borrar los complejos de THBS2 con las metaloproteinasas de la matriz-2, -9 o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) desde el entorno pericelular de células mesenquimales [ ,,,0],29-32].
por último, MVD es uno de los parámetros más utilizados para evaluar el grado de angiogénesis tumoral y estudios previos han encontrado MVD podría ser un factor pronóstico independiente en el cáncer gástrico y otro tumor [33-35]. En nuestro estudio, encontramos MVD se correlacionó significativamente con la expresión de la proteína THBS2 (P Hotel < 0,001) en el cáncer gástrico, pero no con las características clínicas y el pronóstico clínico. Estos resultados demostraron que THBS2 podría afectar la angiogénesis en el cáncer gástrico, sin embargo, debido a la correlación entre MVD y el pronóstico en nuestras muestras, por la sospecha de que una mayor expresión THBS2 lo que indica una mayor supervivencia no era simplemente a través de la inhibición de la angiogénesis del cáncer gástrico, otros mecanismos, como la regulación de recauchutado ECM [23] y la tasa de proliferación de las células de cáncer gástrico también podrían ser las razones por las que necesitan más investigaciones para explorar.
en conjunto, nuestros resultados hincapié en las importantes funciones de THBS2 en significaciones de pronóstico, así como la proliferación tumoral y la angiogénesis en gástrica cáncer. Estos datos sugieren THBS2 podría ser un marcador pronóstico importante para los pacientes con cáncer gástrico. Por otra parte, sobre la base de los efectos de THBS2 en el desarrollo del tumor y la angiogénesis, nuestras investigaciones proporcionan pistas valiosas para las prácticas clínicas para desarrollar productos terapéuticos que inhiben moleculares utilizando objetivos deducidos del conocimiento biológico proporcionado por la firma THBS2.
Conclusión
Nuestros regalos de estudio la primera línea de evidencias de que la expresión THBS2 es el regulado, tanto en los niveles de proteína y ARNm y la disminución de THBS2 expresión se asocia con los pobres el grado histológico de cáncer gástrico. Fundamentalmente, la sobreexpresión de THBS2 tiene una correlación significativa con un pronóstico favorable de los pacientes con cáncer gástrico. Por otro lado, THBS2 afectada pronóstico en el cáncer gástrico puede no sólo a través de la regulación de la angiogénesis, pero en algunas otras maneras, como la regulación de remodelación de ECM y la inhibición de la proliferación de células de cáncer gástrico. Estos hallazgos sugieren que THBS2 podría ser un papel potencialmente crítico de en la patogénesis y progresión del cáncer gástrico. Confirmamos que, con los estudios en profundidad graduales de THBS2, puede ser un biomarcador útil y sencilla prometedora para predecir el resultado clínico de los pacientes con cáncer gástrico.
Métodos
Pacientes y muestras de tejido Hoteles en el presente estudio, se incorporado dos cohortes de muestras. La primera cohorte contenía 129, el cáncer humano embebido en parafina fijado con formalina gástrico y 24 tejidos gástricos normales seleccionados al azar. Fueron reclutados consecutivamente entre diciembre de 2006 y mayo de 2008, del Departamento de Cirugía General, el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui, Hefei, China. Estas muestras se incorporaron en TMA para la tinción inmunohistoquímica. características histológicas de estos especímenes fueron confirmados por patólogos. Patológica de estadificación TNM se evaluó según los criterios de 2010 del Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC). El segundo grupo estaba compuesto por 14 pacientes con cáncer gástrico que sometido a tratamiento de la resección del tumor en el Departamento de Cirugía General Octavo, el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui. El fresco tejido de cáncer gástrico y mucosa normal correspondientes (al menos 5 cm de distancia del borde del tumor) se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta el uso para Quantitative PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western. Los pacientes en ambos grupos no recibieron quimioterapia y /o radioterapia preoperatoria. escrito el consentimiento informado fue proporcionada por todos los participantes. Todas las muestras fueron manejadas de forma anónima de acuerdo con las normas éticas. Este estudio se llevó a cabo con la aprobación del Comité de Ética del hospital.
Extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total fue extraído de la segunda cohorte utilizando reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se sintetizó ADNc mediante cebadores aleatorios y transcriptasa inversa Superscript II (Toyobo, Osaka, Japón). Los cebadores utilizados para la amplificación de THBS2: cebador directo 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'y el cebador inverso 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) se amplificó en la misma q-PCR como un control interno usando los cebadores: cebador directo 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'y el cebador 5' GCCCAATACGACCAAATCC-3 inversa ". La reacción corrió en el sistema ABI 7900HT de detección de secuencias (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) en presencia de un colorante SYBR-Green (Toyobo, Osaka, Japón). La condición de reacción fue de un programa de desnaturalización (95 ° C durante 5 min), y un programa de amplificación y cuantificación durante 40 ciclos (95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 45 s). Cada muestra se ensayó por triplicado, y se utilizó un análisis de la curva de fusión de cada muestra para comprobar la especificidad de la amplificación. El nivel de expresión se determina como la relación entre THBS2 y la GAPDH de control interno en las cantidades de ARNm calculados por el método comparativo CT.
La extracción de proteínas y Western blot
La proteína total se extrajeron de 14 cáncer gástrico congelada y su correspondiente normales el tejido de la mucosa por el hielo en el ensayo de inmunoprecipitación de radio tampón de lisis (RIPA; Beyotime Instituto de Biotecnología, Jiangsu, china), y se mide usando un kit de ensayo de proteína BCA (Instituto de Biotecnología Beyotime, Jiangsu, china). El lisado se centrifugó a 12.000 rpm durante 5 minutos, y el sobrenadante se calentó a 100 ° C durante 5 minutos. A continuación, las proteínas equivalentes de cada par muestras se separaron en electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de 8% de sodio y electrotransferred a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA). Después de la bloqueado con TBST que contenía 5% de leche desnatada en a temperatura ambiente durante una hora, las membranas se transfirieron con anticuerpo anti-THBS2 (1: 1500; Novus) y anti-Flag (1: 3000; Sigma). Seguido de la incubación con membranas marcado con peroxidasa de rábano picante anti-conejo y anti-IgG de ratón como el anticuerpo secundario (Instituto Beyotime de Biotecnología). El anticuerpo anti-GAPDH (1: 4.000; Aogma) se utilizó como un anticuerpo de control de carga. Los anticuerpos unidos se detectaron con el método de quimioluminiscencia potenciada.
Inmunohistoquímica y análisis de TMA
El cáncer gástrico y muestras de mucosa gástrica normal se fija-formalina, embebido en parafina y se utilizaron para construir un tejido TMA. H & E-manchado diapositivas fueron examinados para identificar el tejido intratumoral óptima para su análisis. secciones gruesas 4-micras se hornearon a 60 ° C durante 1 hora, deparaffinised con xilenos, y rehidratada en etanol graduado a agua destilada. La recuperación del antígeno se consiguió con la colocación de las secciones con tampón de citrato en un vapor el arroz durante 30 minutos. Para inactivar la actividad de la peroxidasa endógena, las secciones se trataron con 3% de H 2O 2 en metanol. A continuación, se utilizó 1% de albúmina de suero bovino para bloquear la unión no específica. El anticuerpo anti-THBS2 (Novus, 1: 2000) y anti-CD34 (Abcam, 1: 250) se incubaron con las secciones a 37 ° C durante la noche, después se incubaron con marcado con peroxidasa de rábano picante IgG anti-conejo como anticuerpo secundario (Vida Technologies). Al final, los portaobjetos se colocan en un instrumento enlace de tinción automática y proceder con la tinción. Para los controles negativos, los anticuerpos primarios fueron sustituidos con suero normal de conejo. La tinción inmunohistoquímica efectiva final se evaluó por dos patólogos independientes sin conocer la información de los pacientes de acuerdo con la intensidad de la tinción y el alcance de la tinción. sección de tejido se anotó como el porcentaje de citoplasma teñido en células de la glándula cáncer gástrico y células de las glándulas normales (0 puntos por no hay células teñidas, 1 punto por < 25%, 2 puntos por 25 a 75%, y 3 puntos por > 75 % de células teñidas), y la intensidad de la tinción de la inmunorreactividad se clasificó en una escala de 0 a 3. la puntuación inmunorreactividad (IRS) fue el resultado de la multiplicación de ambos parámetros. Los especímenes se obtuvieron de la siguiente manera: negativo (IRS = 0 ~ 2), positivo (IRS = 3 ~ 9)
contando
tinción inmunohistoquímica de CD34 MVD y criterios generalmente aceptados realizadas por Weidner et al.. [36] se utilizaron para MVD recuento. Cualquier células endoteliales teñidas o grupos de células endoteliales fueron separados de los microvasos adyacentes, y el espesor de cada pared del vaso sobre 2,75 m serían excluidos. Tres secciones separadas que contienen hot spots (en el que se manchaba el mayor número de microvasos discretos) en cada muestra de TMA fueron elegidos en aumentos bajos (100 ×) bajo un microscopio óptico (Leica, Alemania). Posteriormente, los microvasos fueron contados en cada sección de gran aumento (200 ×). P Hotel <

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