Down regulácia Thrombospondin2 predpovedá zlú prognózu u pacientov so žalúdočnými cancer

down regulácia Thrombospondin2 predpovedá zlú prognózu u pacientov s rakovinou žalúdka
abstraktné
pozadia
Thrombospondins (THBSs) sú rodina multioborový a vylučovaný matricellular Ca 2 + viažuci glykoproteíny, ktoré má najmenej päť členov kódovaných nezávislými génmi. Ako THBSs člena rodiny, Thrombospondin2 (THBS2) bola hlásená k regulácii angiogenézy. Avšak, funkcie a klinický význam THBS2 stále zostáva nejasný u karcinómu žalúdka.
Metódy
Hladiny mRNA a expresie proteínu z THBS2 boli hodnotené 14 spárované jedincov s karcinómom žalúdka a zodpovedajúce normálne sliznice pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase a western blot analýzy. Imunohistochémia THBS2 a CD34 na mikroskopických sústav tkanív populačných pozostávajúci zo 129 prípadov rakoviny žalúdka boli použité pre vyhodnotenie prognostický význam THBS2 a mikrociev hustote (MVD) každej vzorky. Prežitie analýzy boli vykonané metódou Kaplan-Meiera a Coxovho modelu proporcionálneho rizika. Tvorba test kolónií, test formácie endoteliálnych buniek trubice, bunková migrácia Test a analýza apoptózy v MKN-45 a SGC-7901 bunkových línií boli vykonané za účelom vyhodnotenia účinkov THBS2 o rakovine žalúdka in vitro
.
Výsledky
85,71% (12 z 14) žalúdočné rakovinové tkanivá vyjadrené výrazne nižšie THBS2 v oboch mRNA a nízka hladina bielkovín ako zodpovedajúce normálnych kontrol. Dôsledne, mikroskopické sústavy tkanív (TMA), výsledky ukázali, THBS2 hladiny boli inhibované v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní s normálnymi kontrolami. Okrem toho sme pozorovali, že pacienti s vyššími hladinami THBS2 významne koreluje s priaznivejšie prognózou a zároveň sa znížil THBS2 expresia boli spojené s horšími histologické stupňov karcinómu žalúdka. Navyše, naše pokusy in vitro ďalej preukázané, že nadmerná expresia THBS2 by mohli ohroziť ako rýchlosť šírenia a formovanie trubiek pre ľudské pupočnej žily endotelových buniek (HUVEC) v MKN-45 a SGC-7901 bunkových línií.
Záver
Náš štúdia naznačuje, THBS2 je aberantne vyjadrená v karcinómu žalúdka a hrá dôležitú úlohu v progresii rakoviny, ktorá môže byť potenciálnym prognóza predpovedá rakoviny žalúdka.
Kľúčové
THBS2 rakovinou žalúdka angiogenézy prognostických biomarkerov Úvod
rakovina žalúdka je vysoko agresívne a smrteľný zhubný nádor. Celkom 952,000 nových prípadov rakoviny žalúdka a 723,000 úmrtia boli odhadnuté že k nim došlo v roku 2012, čo predstavuje 6,8% z celkového počtu prípadov a 8,8% z celkového počtu usmrtených osôb. Okrem toho obe nových prípadov a úmrtí na rakovinu žalúdka v Číne, a to hneď prvý po celom svete, čo predstavuje viac ako 40%, že vo svete [1]. Z tohto dôvodu veľké obavy sú zvýšené pre výskumov rakoviny žalúdka.
Thrombospondins (THBSs) sú rodina multidoménovém a matricellular Ca 2 + viažuci glykoproteíny vylučované stromálne fibroblasty, endoteliálne bunky a bunky imunitného systému [2]. Majú najmenej päť členov kódovaných nezávislými génmi. Väzbou s mnohými cieľových proteínov, ktoré sa zúčastňujú rôznych biologických procesov, ako je angiogenézy, bunkovej motility, apoptózy, cytoskeletálne organizácie, a slúži ako interakcie platformy v extracelulárnej matrix (ECM) [3, 4]. Pozoruhodne, THBS1 a THBS2 sú zvláštne v tejto rodine za ich opakovanie typu I a obaja sú prevažne zobrazené ako inhibítory angiogenézy [5, 6], jednej časť výskumu rakoviny [7-9]. hustoty mikrociev (MVD) je široko používaný parameter pre odhad stupňa angiogenézy v nádoroch s CD34 bytia mikrociev výrobcu u karcinómu žalúdka [10]. Na základe predchádzajúcich zistení [2], sme predložiť hypotézu v našej štúdii, ktorá by mohla tiež mať vplyv na angiogenézu v karcinómu žalúdka.
Okrem angiogenézy, THBS2 bolo hlásené pre interakciu s receptormi viac buniek, rastových faktorov a proteínov ECM rovnako ako regulovať apoptózu, bunkovú proliferáciu a adhéziu [11]. V rakovinových výskumov, boli rastúce pozornosti bolo zamerané na THBS2. Tokunaga et al. [12] zistili, že THBS2 vyjadrená u pacientov s rakovinou hrubého čreva mali signifikantný nižšie riziko vzniku metastáz do pečene a nádorovej prekrvenie v porovnaní s pacientmi, ktorých nádory boli nedostatok THBS2. Okrem toho, De Fraipont et al. [13] preukázali, že THBS2 významne koreluje s klinickým stavom a výsledky, a pre väčšinu nádorov, došlo k inverzný korelácia medzi THBS2 úrovne expresie a od miery ich malignity. Okrem toho, THBS2 tiež hrá kľúčovú úlohu v rakovine prsníka [14], [15] myelóm, malígny melanóm [16], rakoviny prostaty [17] a pľúcne adenokarcinóm [18, 19]. V karcinómu žalúdka, ďalší členovia THBSs, THBS1 [20] a [21] THBS4 môže byť ako prognostický biomarker alebo silný marker pre žalúdočné adenokarcinómov difúzne typu. Avšak, detailné funkcie THBS2 u karcinómu žalúdka a jeho dôsledky pre klinickú diagnostiku stále neutešená. Preto sme sa pokúsili odhaliť klinický význam THBS2 a jeho vplyv na rakovinu žalúdka.
Pre overenie našej vyššie uvedenej hypotézy sme skúmali hladiny THBS2 výraz v ľudských nádorových tkanív žalúdka a zodpovedajúce normálne tkanivá a potom preskúmal možné korelácie medzi expresie THBS2 a klinicko-funkcií, klinické prognózy a počítanie MVD u pacientov s karcinómom žalúdka. Navyše, tvorba kolónií test, test tvorba endoteliálnych buniek trubice, migráciu buniek Test a analýza apoptózy vykonávali v MKN-45 a SGC-7901 bunkových línií preskúmať in vitro
účinok THBS2 do buniek karcinómu žalúdka.
výsledky
charakteristiky pacientov a klinické výsledky
V tejto štúdii sme sa zapísal 129 vhodných pacientov, ktorá sa skladala zo 101 mužov a 28 žien. Vek chorých sa pohyboval od 29 do 80 rokov (y) s priemerným vekom 61y. Všetky klinicko-patologické charakteristiky sú zhrnuté v tabuľke 1. Medián celkového prežívania (OS) pacientov bol 57 mesiacov a stredné OS bola 44,01 [95% interval spoľahlivosti (CI) 39.78-49.24 mesiacov] .Table 1 Združenia medzi premennými a klinicko THBS2 expresie a celkové prežívanie pacientov s nádorovým ochorením žalúdočných
premenné
Negatívny
Pozitívna
spoločností pocet
P valuea
celkové prežívanie OS
log-rank PB
HR (95% CI)
č. (%)
č. (%)
vek (y )
0,112 0,743
Hotel < 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (referencie)
≥61
35 ( 53.0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67-1,77)
Pohlavie
0,831 0,405
Muž
47 (46,5)
54 ( 53,5)
101
1 (referencie)
Žena
12 (42,9)
16 (57,1)
28
0,76 (0.40-1.45)
histologického stupňa
0,005 0,011
No a stredne
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (referencie)
chudobný a ďalších strojov 35 (60,3 )
23 (39,7)
58
1,89 (1.16-3.09)
lokalizácia nádoru
0,419 0,204
Horní
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (referencie)
Middle
15 (53,6)
13 (46,4)
28
1,66 (0,86-3,18)
Lower
17 (50,0)
17 (50,0)
34
1,90 (0,90-4,01)
Hĺbka invázie
0,271 0,001
T1-T2
9 ( 34,6)
17 (65,4)
26
1 (referencie)
T3, T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11.60 (2.83 -47,45)
lymfatických uzlín
0,454 Hotel < 0,001
Absent
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (referencie)
súčasnosť
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5,16 (2,46 - 10,84)
TNM štádium
0.283 Hotel < 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (referencie)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52 - 14,49)
Bold hodnota je štatisticky významné pri P Hotel < 0,05, pomer rizika HR.
, P
hodnota klinicko-premenných a THBS2 prejavu.
B, P
hodnota asociácie medzi klinicko-premenných a celkové prežívanie pacientov s karcinómom žalúdka.
THBS2 je down-regulovaná v karcinómu žalúdka
na stanovenie hladiny expresie THBS2 v karcinómu žalúdka, najprv hodnotené hladiny expresie mRNA THBS2
v karcinómu žalúdka kvantitatívnej real-time na druhú skupinu. Táto kohorta vzoriek, je uvedené v metódach, vrátane 14 rakovina žalúdka u ľudí a zodpovedajúcich normálneho tkaniva. Ako je znázornené na obrázku 1A, THBS2
hladiny boli v 85,7% (12 z 14) žalúdočné rakovinové tkanive než jeho normálne kontroly výrazne nižší, zatiaľ čo zvyšné dva páry vzoriek vykazovali opak. Potom sme zistili expresné hladiny proteínu THBS2 cez westernovým prenosom do rovnakej skupiny. Ako ukazuje Figure1B a C, sme pozorovali, že THBS2 hladiny expresie proteínov boli znížené na 85,7% (12 z 14) zo vzoriek nádoru v porovnaní s jeho zodpovedajúce kontrole, zatiaľ čo vzorka 5 a 11 zobrazí inverzne. Na potvrdenie tohto zistenia sme ďalej vykonali mikroskopické sústavy tkanív (TMA) a hodnotené expresné hladiny proteínu THBS2 podľa imunoreaktivity skóre (IZS) každej vzorky. Zistili sme, THBS2 proteíny boli exprimované hlavne v cytoplazme žalúdočných buniek (obrázok 2A), a v súlade s výsledkami western blot, hladiny THBS2 boli významne inhiboval v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní s normálnymi kontrolami (obrázok 2B, P <0,05). Celkovo vzaté, naše výsledky ukazujú, že THBS2 je down-regulovaný u karcinómu žalúdka v oboch mRNA a nízka hladina bielkovín. Obrázok 1 mRNA a proteín úroveň expresie THBS2 v 14 žalúdočné rakovinové tkanive a zodpovedajúce normálne tkanivo. (A) Expresia mRNA Relatívna THBS2 bol detekovaný kvantitatívnej real-time PCR. Expresie normálneho tkaniva boli normalizované na 1,0, ako je uvedené. (B) denzitometria výsledky analýzy pásom THBS2 boli normalizované na GAPDH pomocou Obrázok J. Expresia normálneho tkaniva boli normalizované na 1,0, ako je uvedené. (C) Relatívna expresia proteínu THBS2 bola stanovená testom Western Blot.
Obrázok 2 imunohistochemické analýzu THBS2, CD34. (A) Reprezentatívne obrazy THBS2 a CD34 expresie: N1, N2, N3, N4, normálne žalúdočné tkaniva (N); M1, M2, M3, M4, mierne diferencované (M); P1, P2, P3, P4, zle diferencované (P). Zväčšenie: 100 x (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 x (N4, M4, P4) a 400 x (N2, M2, P2). (B) Porovnanie THBS2 expresie karcinómu žalúdka (n = 129) a normálne žalúdočné tkaniva (n = 24) v TMA. Hladina expresie THBS2 uvedené ako priemer ± SEM. (C) Porovnanie MVD v THBS2-pozitívnej žalúdka skupina karcinómu (n = 70) a THBS2-negatívne žalúdočné skupiny rakoviny (n = 59). Bodky predstavujú MVD jednotlivých vzoriek. Hodnoty sú priemer ± SEM. Expresné hladiny
THBS2 sú inverzné koreláciu s histologickými stupňov rakoviny žalúdka
bližšie objasniť klinický význam THBS2 sme analyzovali vzťah medzi expresiou THBS2 proteínov a klinických príznakov vrátane vek, pohlavie, histologických stupeň, lokalizácia nádoru, hĺbka invázie, lymfatických uzlín a stav TNM pacientov s karcinómom žalúdka v THBS2-pozitívnych a negatívnych skupín. Ako je uvedené v tabuľke 1, sme zistili, že významný inverzný koreláciu s histologickými stupňov rakovinou žalúdka (P
< 0,01). Histologické stupňa uskutočňované u pacientov na THBS2-pozitívnej skupiny boli viac pravdepodobné, že bude dobre a mierna, zatiaľ čo pacienti v THBS2-negatívne skupinou tendenciu byť chudobný a ďalšie. Sme však nepodarilo zistiť žiadny význam štatisticky medzi úrovňami expresie THBS2 a iných klinických parametrov. Spoločne, naše výsledky naznačujú, že THBS2 je inverzný koreláciu s histologického stupňa rakoviny žalúdka. Expresné hladiny
THBS2 sú inverzné koreláciu s MVD v karcinómu žalúdka
Predchádzajúce správy odvodené THBS2 mohla regulovať nádorové angiogenézy [6], ale žiadny bol zaznamenaný u rakoviny žalúdka. Z tohto dôvodu sme sa opýtali, či boli nejaké korelácia medzi MVD a expresných hladín THBS2 ako aj ďalšie klinické parametre v našich klinických vzorkách. MVD v 129 vzorkách s karcinómom žalúdka v rozmedzí od 0 do 120, s mediánom 40 a stredná hodnota ± 48.12 28.99 (priemer ± SD) v súlade s imunoreaktivity CD34 v našej TMA. Ako je ukázané na obrázku 2C, THBS2 významne koreluje s MVD. MVD v THBS2-negatívnej skupine bola omnoho vyššia ako v THBS2-pozitívnej skupiny (P Hotel &0,001). Avšak, mohli by sme nespozorovali žiadne štatistické rozdiely medzi MVD a ďalších patologickým funkcií vrátane klinického prognózou u našich vzoriek (dáta nie sú uvedené). Záverom možno povedať, naše objavy ukazujú, že THBS2 je inverzný koreláciu s MVD v karcinómu žalúdka.
THBS2 sa významne spojené s klinickou prognózou u pacientov s karcinómom žalúdka
skúmať vzťah medzi THBS2 prejavu a klinickou prognózou u pacientov s rakovinou žalúdka, sme vykonali analýzu prežitie tým, jednorozmerné a viacrozmerné pomerného rizika regresie modelu Cox. Ako je uvedené v tabuľke 1, sme zistili, histologického stupňa, hĺbku invázie, lymfatických uzlín a TNM fázy boli štatisticky významné faktory pre OS v jednorozmerné analýze. Vzhľadom k tomu, TNM stupeň tiež obsahuje informácie o hĺbke invázie a metastáz lymfatických uzlín, sme ďalej vykonaná multivariačný analýzy prežitie s úpravou pre histologického stupňa a TNM fáze. Zistili sme, že TNM stupeň (P Hotel <0,001) a THBS2 výraz (P Hotel < 0,01) boli obidva nezávislé prognostické faktory pre posudzovanie výsledkov pacientov. Vyššia TNM štádium bolo rizikovým faktorom pre dlhšie OS [P Hotel < 0,001, HR (hazard ratio) = 7,23, 95% CI 3,55-14,69) a zvýšená expresia THBS2 bol ešte priaznivý faktor pre dlhšie OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% CI 0,31 do 0,85). Okrem toho, analýza prežitie Kaplan-Meier ďalej potvrdili, že THBS2 expresia významne koreluje s klinickými výsledkami (obrázok 3, P < 0,01, n = 129). Pacienti s nižšou THBS2 vyjadrenie vykazovali podstatne kratšia OS [medián 36 mesiacov, priemer 40,07 ± 3,65 (priemer ± SE) mesiacov], zatiaľ čo pacienti s vyšším THBS2 vyjadrenie vykázali priaznivú prognózu [medián 59 mesiacov, priemer 53,70 ± 2,95 (priemer ± SE ) mesiace]. Spolu, naše výsledky ukazujú, THBS2 je významne spojená s klinickou prognózou u pacientov s karcinómom žalúdka, čo sa môže stať prognostický marker pre rakovinu žalúdka. Obrázok 3 Kaplan-Meier prežitie analýz s testom Log-rank na celkové prežívanie (OS). Kaplan-Meierova analýza korelácií medzi rôznymi úrovňami expresie a THBS2 OS 129 pacientov s karcinómom žalúdka.
Nadmerná expresia THBS2 inhibuje rast buniek karcinómu žalúdka in vitro
Pretože THBS2 bola významne down-regulované v žalúdočných rakovina, sme vyvodiť, že THBS2 môže blokovať rast, podporujú apoptózu a zvýšiť migračné schopnosti buniek karcinómu žalúdka. Ak chcete overiť našu hypotézu, najprv postavený jeden lentivirálním vektora stabilné expresné THBS2 prepisov v žalúdku nádorových bunkových línií. Zmenené expresia THBS2 293 T buniek bola potvrdená metódou Western blot analýzou (Obrázok 4A). Potom sme zvolili MKN-45 a SGC-7901 bunkových línií pre naše štúdie in vitro
preto, že hladiny expresie mRNA THBS2 boli nižšie než ostatné (dáta nie sú uvedené). Potom sme vykonali test formáciu kolónie vyhodnotiť dopady THBS2 na rast MKN-45 a SGC-7901 buniek. Ako je znázornené na obrázku 4B, sme zistili, bunky s nadmernou expresiou THBS2 vytvoreného podstatne menej kolónií na mäkkom agare v porovnaní s tými, ktoré z kontrolných buniek infikovaných vektor (P
< 0,01 pre MKN-45 bunkách a P Hotel &0,001 pre SGC-7901 bunky, príslušne). Okrem toho sme skúmali úrovne apoptózu medzi týmito dvoma skupinami v oboch bunkových líniách a zistil, že THBS2 podporoval apoptózu v SGC-7901 bunkách (obr 4F), ale nie v MKN-45 bunkách (dodatočný súbor 1: Obrázok S1A). A tam boli v migrácii buniek žiadne významné rozdiely medzi oboma skupinami v SGC-7901 a MKN-45 bunkových línií podľa testov transwell (dodatočný súbor 1: Obrázok S1B a C). V súhrne možno konštatovať, že naše dáta podporujú THBS2 bráni rastu buniek karcinómu žalúdka in vitro, prípadne cez reguláciu apoptózy. Obrázok 4 Nadmerná expresia THBS2 inhibuje proliferáciu buniek karcinómu žalúdka, potlačil angiogenézy rakoviny žalúdka, a podporovať apoptózu v SGC-7901 bunkové línie in vitro. (A) Analýza Western blot Flag na 293 T buniek s nadmernou expresiou THBS2. (B) Číslo Colony analýza pre MKCH-45 a SGC-7901 buniek s nadmernou expresiou THBS2 a negatívne kontrolou. Hodnoty sú priemer ± SD z troch nezávislých experimentov. (C) Snímky z testu tvorby kolónií. (D) Analýza AngiogenicIndexCh1 z testu tvorby endotelových buniek trubice. Hodnoty sú priemer ± SD. (E) Obrázky z testu tvorby endotelových buniek trubice. (F) Analýza apoptózy v MKN-45 bunkové línie. Hodnoty sú priemer ± SD.
THBS2 potláča rakovina žalúdka angiogenézy in vitro
THBS2 je známy ako inhibítor angiogenézy [2]. Poskytnúť dôkazy o THBS2 reguluje angiogénny fenotyp karcinómu žalúdka, endoteliálny testy tvorby buniek trubice boli vykonané. Ako je znázornené na obrázku 4E a D, v oboch bunkových líniách MKN-45 a SGC-7901, ľudské pupočnej žily endoteliálne bunky (HUVEC), kultivované s médiom z THBS2-nadmerná expresia buniek karcinómu žalúdka ukázala významne nižšie AngiogenicIndexCh1 ako u negatívnej kontroly (P
menšia ako 0,05 pre MKN-45 bunkách a P Hotel < 0,001 pre SGC-7901 buniek, v danom poradí). Súhrnne, naše výsledky naznačujú, že THBS2 potláča angiogenézu buniek karcinómu žalúdka in vitro
.
Diskusia
THBS2 je známy ako prírodné silný inhibítor angiogenézy a modulátora procesu remodelácie [22, 23]. Avšak, žiadny z predchádzajúcich výskumov diskutovali úlohu THBS2 a jeho klinický význam u karcinómu žalúdka.
Po prvé, sme zistili, že mRNA a expresie proteínov hladiny THBS2 boli down-regulované vo väčšine vzoriek. Avšak, jeden predchádzajúci výskum hlásených THBS2 mRNA hladiny expresie v karcinómu žalúdka boli vyššie ako normálne kontroly [24]. S ohľadom na obmedzenú veľkosť vzorky v tejto štúdii, ktorá vznikne až 6 tkanivové vzorky, je možné, že tento rozdiel v dôsledku nádoru heterogenity pre dva páry našej druhú skupinu sa tiež vykazujú rovnaké vzory. Ale naše následné výsledkom TMA, väčšie veľkosti vzorky, bolo v súlade s výsledkom z druhej kohorty. Celkovo vzaté, sme sa domnievali, že THBS2 bolo viac pravdepodobné, že sa regulované v žalúdočnej nádorové bunky v porovnaní s normálnou sliznicou.
Okrem toho sme tiež zistili, že relatívna expresia vzoriek vykazovala odlišne v mRNA a proteínovej úrovni. Chýba dostatočné dôkazy, usudzujeme, že funkcia THBS2 vnútri buniek karcinómu žalúdka, môže byť upravená niektorými intracelulárnu signalizáciu proti prúdu faktorov, proteínov ubikvitinace, a ďalšími možnými spôsobmi, ktoré môžu mať vplyv na hladiny proteínovej THBS2 a fenotyp v rakovinových bunkách žalúdka. A väčší dôraz je kladený na tento zaujímavý jav. Avšak, väčšina vzoriek z našej druhú skupinu zobrazené rovnaké expresné vzorce medzi mRNA a na úrovni proteínov.
Po druhé, naše dáta ukazujú, že THBS2 mohol podporovať apoptózu iba u SGC-7901 buniek, ale nie v MKN-45 bunkách. Predchádzajúce výskumy ukázali, že N-terminálny fragment rekombinantnej THBS2 mohol aktivovať CD36-sprostredkovanej apoptosy endotheliálních buniek [14], a kombinácie CD36 a THBS2 mohol aktiváciu kaspázy signálnej dráhy [25]. Preto sme predpokladali, že heterogenita oboch bunkových línií používaných v našej štúdii, rovnako ako diferencované CD36 výrazov, môže byť čiastočne príčinou rôznych úrovní apoptózy indukovanej THBS2, ktorý vyzval k ďalšiemu vyšetrovaniu.
Po tretie, naše výsledky ukázali, že THBS2 mohol potlačiť angiogenézy rakoviny žalúdka. Je známe, že proliferácia nádoru, invázia alebo metastázy sú závislé na angiogenézu [26]. A dôkazy založené podporujú náš objav a poukázať na to, že možné mechanizmy, ktoré THBS2 inhibuje angiogenézu: 1) apoptózu nezávislú módu vyvolaním endotheliálních buniek apoptózu, bunkového cyklu zatknutie a klesajúci endoteliálny bunkovú migráciu [27], 2) v závislosti na kaspázy signalizáciu dráha aktivovaná CD36 [28]. 3) fungujú ako ko-receptorov pre proteín príbuzný na lipoproteín s nízkou hustotou receptora (LRP1), ktorá by mohla odbaviť komplexy THBS2 s matrixom metaloproteinázy-2, -9 alebo vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), z pericelulárních prostredia mezenchymálnych buniek [ ,,,0],29 až 32].
Konečne, MVD je jedným z najčastejšie používaných parametrov pre posúdenie miery nádorové angiogenézy a predchádzajúce štúdie preukázali, MVD môže byť nezávislý prognostický faktor v žalúdku rakoviny a iných nádorov [33-35]. V našej štúdii sme zistili, MVD významne koreluje s expresiou THBS2 proteínu (P Hotel &0,001) v karcinómu žalúdka, ale nie s klinickými príznakmi a klinickú prognózou. Tieto výsledky ukázali, že THBS2 by mohli mať vplyv na angiogenézu v karcinómu žalúdka, však, pretože žiadna korelácia medzi MVD a prognózy v našich vzorkách sme podozrenie, že vyššia THBS2 výraz označujúci dlhšie prežitie nebol iba inhibíciou angiogenézy rakoviny žalúdka, iných mechanizmov, ako je napríklad regulácia ECM remoulding [23] a proliferácie miera nádorových buniek žalúdka môžu byť tiež dôvody, ktoré potrebujú ďalšie výskumy na preskúmanie.
Dohromady naše zistenia zdôraznil dôležitých rolí THBS2 v prognostických významov rovnako ako nádorového bujnenia a angiogenézy v žalúdočnej rakovina. Tieto údaje naznačujú, THBS2 mohol byť významný prognostický marker pre pacientov s rakovinou žalúdka. Okrem toho na základe účinkov THBS2 na vývoj nádoru a angiogenézy, naše výskumy poskytujú cenná vodítka pre klinickej praxe vyvinúť molekulárnej spomaľujúci postupov liečby pomocou ciele odvodené z biologického poznatkov poskytnutých podpisom THBS2.
Záver
našej štúdie darčeky prvý rad dôkazov, že THBS2 výraz je down-regulovaná na úrovni mRNA a proteínov a hladiny klesli THBS2 expresie je spojená s chudobnými histologického stupňa rakoviny žalúdka. Kľúčové je, že zvýšená expresia THBS2 má významnú koreláciu s priaznivou prognózou pacientov s rakovinou žalúdka. Na druhej strane, THBS2 ovplyvnená prognózu karcinómu žalúdka môže nielen reguláciu angiogenézy, ale v niektorých inými spôsobmi, ako je regulácia ECM remoulding a inhibíciu proliferácie buniek karcinómu žalúdka. Tieto zistenia naznačujú, že THBS2 by mohol byť potenciálne rozhodujúcu úlohu v patogenéze a progresii karcinómu žalúdka. Sme potvrdiť, že s postupným hĺbka štúdií THBS2, môže to byť sľubnú užitočné a jednoduché biomarker pre predikciu klinické výsledky pre pacientov s rakovinou žalúdka.
Metódy
Pacienti a vzorky tkaniva
V tejto štúdii sme začlenené dve kohorty exemplárov. Prvá kohorta obsahovala 129 formalínom fixované, parafínové rakovina žalúdka u ľudí a 24 náhodne vybraných normálne žalúdočné tkaniva. Oni boli postupne prijatí od decembra 2006 do mája 2008 z odboru všeobecnej chirurgie, Prvý pričlenil nemocnice Anhui lekárskej univerzity, Che-fej, Čína. Tieto vzorky boli včlenené do TMA pre imunohistochemické farbenie. Histologické črty týchto vzoriek boli potvrdené patológov. Patologická TNM staging bol hodnotený podľa kritérií amerického spoločného výboru rakoviny (AJCC) 2010. Druhá kohorta bola zložená z 14 pacientov s karcinómom žalúdka, ktorí podstúpili resekciu nádoru terapiu na ôsmej odboru všeobecnej chirurgie, prvá Affiliated nemocnice Anhui lekárskej univerzity. Čerstvý žalúdočné tkaniva karcinómu a zodpovedajúce normálne sliznicu (najmenej 5 cm od okraja nádoru) boli okamžite zmrazený v kvapalnom dusíku a skladované pri teplote -80 ° C až do použitia pre kvantitatívne real-time PCR a analýzou Western blot. Pacienti v oboch kohorty neobdržali predoperačnej chemoterapii a /alebo radiácia. Písomný informovaný súhlas, bola poskytnutá všetkými účastníkmi. Všetky vzorky boli spracované anonymne v súlade s etickými normami. Táto štúdia bola vykonaná so súhlasom Etického revíznej komisie nemocnice.
Extrakciu RNA a kvantitatívne real-time PCR
Celková RNA bola extrahovaná z druhej kohorty pomocou TRIzolu činidlo (Invitrogen) podľa protokolu výrobcu. cDNA bola syntetizovaná pomocou náhodných primérov a Superscript II reverznej transkriptázy (Toyobo, Osaka, Japonsko). Priméry použité pre amplifikáciu pre THBS2 primery: dopredný primer 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'a reverzné primer 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) bol amplifikovaný v rovnakom q-PCR, ako vnútorná kontrola použitím primérov primery: dopredný primer 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'a reverzné primer 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. Reakčná bežal na 7900HT systéme ABI Sequence Detection (Applied Biosystems, CA, USA) v prítomnosti SYBR-Green farbivá (Toyobo, Osaka, Japonsko). Reakčná podmienka bola denaturačné program (95 ° C po dobu 5 minút), a amplifikácia a kvantifikácia program pre 40 cyklov (95 ° C počas 15 s a 60 ° C počas 45 s). Každá vzorka bol testovaný v troch vyhotoveniach, a analýza krivky topenia každej vzorky bola použitá na kontrolu špecifickosti zosilnenie. Hladina expresie bola stanovená ako pomer medzi THBS2 a GAPDH vnútornej kontroly v množstve mRNA vypočítané porovnávacie metódou CT. Extrakcia
Protein a Western blot
Celkový proteín bol extrahovaný z 14 mrazené karcinómu žalúdka a jeho zodpovedajúce normálne sliznice tkanivo od ľadu v radio immunoprecipitation teste Lysis Buffer (RIPA; Beyotime Biotechnologický ústav, Jiangsu, Čína), a merané pomocou testovacieho kitu BCA proteín (Beyotime Biotechnologický ústav, Jiangsu, Čína). Lyzát bol centrifugován pri 12000 otáčkach za minútu po dobu 5 minút, a supernatant sa zahrieva na teplotu 100 ° C po dobu 5 minút. Potom ekvivalentné proteíny z každej dvojice vzoriek boli oddelené na 8% dodecylsulfát sodný elektroforézy na polyakrylamidovom gélu a electrotransferred na PVDF membrány (Millipore, Billerica, MA). Potom, čo blokovaná TBST s obsahom 5% odstredené mlieko pri teplote miestnosti po dobu jednej hodiny, boli membrány blotovány s anti-THBS2 protilátkou (1: 1500; Novus) a anti-Flag (1: 3000, Sigma). Nasledoval membrány inkubácie s chrenovou peroxidázou značený anti-králičie a anti-myšou IgG ako sekundárnej protilátky (Beyotime Biotechnologický ústav). Anti-GAPDH protilátkou (1: 4000; Aogma) bol použitý ako kontrola nanášania protilátky. Naviazané protilátky boli detekované so zvýšenou chemiluminiscenčná metóda.
Imunohistochémia a analýza TMA
žalúdočné nádorových a normálnych vzoriek žalúdočnej sliznice boli formalínom fixované, zaliatych v parafínu a boli použité pre konštrukciu tkaniva TMA. H &E-nafarbená bol vykonávaný screening na identifikáciu optimálneho intratumoural tkaniva pre analýzu. 4-um silné rezy boli pečie pri teplote 60 ° C po dobu 1 hodiny, deparaffinised s xylény, a rehydratované v etanolové do destilovanej vody. Antigén vyhľadávanie bolo dosiahnuté umiestnením časti citrátovým pufrom v ryže parníku po dobu 30 minút. Uhasiť endogénnej peroxidázy, rezy boli ošetrené 3% H 2O 2 v metanole. Potom sa používa 1% hovädzieho sérového albumínu na blokovanie nešpecifickej väzby. Anti-THBS2 protilátka (Novus, 1: 2000) a anti-CD34 (abca, 1: 250) boli inkubované s sekciách pri teplote 37 ° C cez noc, potom sa inkubujú s chrenovou peroxidázou značeného anti-králičie IgG ako sekundárnej protilátky (Life technologies). Na konci bola sklíčka umiestnená na odkaz nástroj autostainer a pokračovať s farbením. Pre negatívne kontroly, primárne protilátky boli nahradené s normálnym králičím sérom. Konečný efektívne imunohistochemické farbenie bola hodnotená dvoma nezávislými patológov, bez toho aby vedel informácie o pacientov v závislosti na intenzite a rozsahu farbenie farbenie. časť tkaniva bola hodnotená ako percento farbené cytoplazmy v bunkách karcinómu žalúdka žľazy a normálnych žliaz buniek (0 bodov za žiadnych buniek zafarbených, 1 bod za < 25%, 2 body za 25-75%, a 3 body za > 75 % buniek zafarbené), a intenzita farbenie imunoreaktivity bola odstupňovaná na stupnici od 0 do 3. imunoreaktivitu skóre (IRS) bol výsledkom násobenie oboch parametrov. Vzorky boli hodnotené takto: negatívny (IRS = 0 ~ 2), pozitívne (IRS = 3 ~ 9)
MVD počítanie
Imunohistochemické farbenie CD34 a všeobecne uznávané kritériá uskutočňované Weidner et al .. [36] boli použité pre počítanie MVD. Akékoľvek zafarbené endotelové bunky alebo endotelové bunkové zhluky boli oddelené od susedných mikrocievkach, a hrúbka každej steny nádoby cez 2,75 um by bola vylúčená. Tri samostatné oddiely obsahujúce hot-spotov (kde bol zafarbený najvyšší počet diskrétnych vlásočníc) v každej vzorke TMA boli vybrané v nízkych zväčšenia (100 x) pod svetelným mikroskopom (Leica, Nemecko). Následne mikrocievkach boli počítané v každom oddiele v vysokom zväčšení (200 x). P Hotel < Všetci autori čítať a schválený rukopis.

• LNC RNA hotair funguje ako konkurenčné endogénne RNA regulovať HER2 expresie hubou Mir-331-3p u karcinómu žalúdka
• Proteomický zmena v gastic adenokarcinómov u japonských pacientov