Dol ureditev Thrombospondin2 napoveduje slabo prognozo pri bolnikih z razjedo cancer

Downovim regulacijo Thrombospondin2 napoveduje slabo prognozo pri bolnikih z rakom želodca
Abstract
Ozadje
Thrombospondins (THBSs) so družina multidomain in izloča matricellular Ca 2 + -binding glikoproteini, ki ima najmanj pet članov, ki so kodirane s strani neodvisnih genov. Kot THBSs družinskega člana, Thrombospondin2 (THBS2) so poročali, da urejanje angiogenezo. Kljub temu, funkcije in klinični pomen THBS2 še vedno ni jasno, raka želodca.
Metode
Raven mRNA in izražanje beljakovin iz THBS2 so bili ocenjeni na 14 v paru želodčnih osebkov raka in ustrezne normalne sluznice s pomočjo kvantitativne PCR v realnem času in western blot analiza. Imunohistokemija za THBS2 in CD34 na mikromrež tkiva temeljijo na prebivalstvu, ki so sestavljeni iz 129 želodca primerov raka so bili uporabljeni za oceno napovedni pomen THBS2 in microvessel gostote (MVD) vsakega vzorca. analize preživetja smo izvedli po metodi Kaplan-Meier in Cox sorazmernih tveganj modela. Colony oblikovanje testa, endotelijskih celic cev oblikovanje testa, celične migracije test in analiza apoptozo v MKN-45 in SGC-7901 celičnih linij so bile opravljene za ovrednotenje učinkov THBS2 na raka želodca in vitro
.
Rezultati
85,71% (12 od 14) želodčni rak tkiva, izražena presenetljivo nižji THBS2 tako v mRNA in koncentracije proteina od ustreznih običajnih kontrol. Dosledno, tkivo mikromrež (TMA) Rezultati so pokazali, THBS2 vrednosti so bile ovira tudi v želodčnih tkiva raka v primerjavi z običajnimi kontrolami. Poleg tega smo ugotovili, da so bolniki z višjimi stopnjami THBS2 pomembno povezana z ugodnejšo prognozo pa je bil manjši THBS2 izraz so bili povezani s slabšimi histoloških vrst raka želodca. Poleg tega naši vitro poskusi nadalje pokazala, da bi čezmernim THBS2 oviralo hitrost širjenja in oblikovanje cevi človekovih centralnih žil endotelijskih celic (HUVECs) v MKN-45 in SGC-7901 celičnih linijah.
Zaključek
Naša študija kaže, THBS2 je odklonsko izražena v raka želodca in igra ključno vlogo pri napredovanju raka, ki je lahko potencialno prognoza napovedovalec raka želodca.
Ključne besede
THBS2 rak želodca angiogenezo prognostičnih biomarkerjev Uvod
rak želodca je zelo agresivna in smrtonosna malignosti. smo ocenili skupno 952,000 novih primerov raka želodca in 723,000 smrti se je zgodila v letu 2012, kar predstavlja 6,8% vseh primerov in 8,8% vseh smrti. Poleg obeh novih primerov in smrtnih primerov raka želodca na Kitajskem, postavljen 1. svetovni ravni, kar predstavlja več kot 40%, da je v svetu [1]. Zato so veliki pomisleki za raziskave raka želodca.
Thrombospondins (THBSs) so družina multidomain in matricellular Ca 2 + -binding glikoproteini, ki stromalnih fibroblastov, endotelijskih celic in imunske celice izločajo [2]. Imajo vsaj pet članov kodirane neodvisnih genov. Z vezavo s številnimi ciljnimi proteini, ki so sodelovali v različnih bioloških procesih, kot angiogenezo, celično motiliteto, apoptoze, citoskeletnim organizacijo in služijo kot interakcij platform v ekstracelularnem matriksu (ECM) [3, 4]. Predvsem THBS1 in THBS2 posebno v tej družini za svoje I ponovitev tip in oba se večinoma prikazane kot inhibitorji angiogenezo [5, 6], eni ključni del raziskav raka [7-9]. Gostota Microvessel (MVD) se pogosto uporablja parameter za oceno stopnje angiogenezo pri tumorjih z CD34 čemer microvessel kavo rakom želodca [10]. Na podlagi predhodnih ugotovitev [2], smo pripravili hipotezo v naši raziskavi, ki bi lahko vplivala tudi na angiogenezo pri raku želodca.
Poleg angiogenezo, THBS2 so poročali, da interakcijo z več receptorji celic, rastnih faktorjev in ECM proteinov kot tudi uravnavajo apoptozo, celično proliferacijo in adhezijo [11]. V raka raziskavah, so vse večje pozornosti usmerjena na THBS2. Tokunaga sod. [12] je pokazala, da THBS2 izražen pri bolnikih z rakom debelega črevesa, so opazili pomembno manjše tveganje za jetrnih metastaz in tumorjev vaskularnosti v primerjavi z bolniki, katerih tumorji so bili pomanjkanje THBS2. Poleg De FRAIPONT sod. [13] je pokazala, da je bila THBS2 značilno povezana s klinično stanje in izidu, in za večino tumorjev, se je inverzna korelacija med stopnjo THBS2 izražanja in stopnjo njihove malignosti. Poleg tega THBS2 igral ključno vlogo pri raku dojke [14], plazmocitomom [15], malignega melanoma [16], raka na prostati [17] in pljučnega adenokarcinoma [18, 19]. Pri raku želodca, lahko drugi člani THBSs, THBS1 [20] in THBS4 [21] je kot prognostični biomarker ali močan označevalec difuzna tipa želodčnega adenokarcinoma. Vendar podroben funkcija THBS2 pri raku želodca in njegove posledice za klinično diagnosticiranje še vedno žalostna. Tako smo poskušali odkril klinični pomen THBS2 in njen vpliv na raka želodca.
Da bi preverili našo omenjeno hipotezo smo preverjali raven izražanja THBS2 v človeških želodčnega tkiva raka in ustrezne normalnih tkiv in nato raziskati možne korelacije med izraz THBS2 in clinicopathological značilnosti, klinične prognozo in MVD štetje pri bolnikih z rakom želodca. Poleg tega so bile kolonije oblikovanje testa, endotelijskih celic cev oblikovanje testa, celične migracije test in analiza apoptoza izvedena v MKN-45 in SGC-7901 celičnih linij, da razišče in vitro
učinek THBS2 v želodčnih rakavih celic.
Rezultati
bolnikov značilnosti in klinični rezultati
V tej študiji smo vpisanih 129 upravičenih bolnikov, ki so bili sestavljeni iz 101 moških in 28 žensk. Glede na starost bolnikov je bila od 29 do 80 let (y) s srednjo starostjo 61y. Vse clinicopathological značilnosti so povzete v tabeli 1. Mediana celokupnega preživetja (OS) bolnikov je bila 57 mesecev, in pomeni OS je 44.01 [95% interval zaupanja (CI) 39.78-49.24 mesecev] .table 1 zveza med clinicopathological spremenljivk in THBS2 izražanja in celokupno preživetje bolnikov z rakom želodca
spremenljivk
Negativne
pozitivno
Skupaj št
P valuea
Celokupno preživetje OS
log-rank PB
HR (95% CI)
št. (%)
št. (%)
Starost (y )
0,112
0,743
< 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (sklic)
≥61
35 ( 53.0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67-1,77)
Spol
0,831
0,405
Moški
47 (46,5)
54 ( 53.5)
101
1 (sklic)
ženski
12 (42,9)
16 (57,1)
28
0,76 (0.40-1.45)
histološke
0,005
0,011
dobro in zmerno
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (referenčna)
revnih in drugih
35 (60,3 )
23 (39,7)
58
1,89 (1.16-3.09)
tumor lokacijo
0,419
0,204
Zgornja
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (sklic)
Srednja
15 (53,6)
13 (46,4)
28
1,66 (0,86-3,18)
Spodnji
17 (50,0)
17 (50,0)
34
1,90 (0,90-4,01)
Globina invazije
0.271
0.001
T1-T2
9 ( 34.6)
17 (65,4)
26
1 (referenčna)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11,60 (2,83 -47,45)
limfnega vozla metastaze
0,454
< 0,001
Odsoten
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (sklic)
Present
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5.16 (2,46-10,84)
stopnjo TNM
0,283
< 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (sklic)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52-14,49)
Bold vrednost je statistično značilna pri P
< 0,05, razmerje ogroženosti HR.
A, p
vrednost clinicopathological spremenljivk in THBS2 izraz.
B, P
vrednost povezovanja med clinicopathological spremenljivk in celotnem preživetju bolnikov z rakom želodca.
THBS2 je navzdol urejeno želodčnega raka
za določitev ravni izražanja THBS2 na raka želodca, smo najprej ocenili raven mRNA izražanje THBS2
pri raku želodca s kvantitativno realnem času v drugi kohorte. Ta kohorta vzorcev, navedeno v metodah, ki so vključeni 14 raka človeškega želodca in ustrezne normalno tkivo. Kot je prikazano na sliki 1A so THBS2
ravni občutno nižja v 85,7% (12 od 14) želodca rakavih tkivih kot pri svojih običajnih kontrol, medtem ko preostala dva para vzorcev razstavljeni nasprotno. Nato smo ugotovili raven beljakovin izraz THBS2 preko Western Blot v isti kohorti. Kot kažejo v Figure1B in C, smo ugotovili, da so bile THBS2 beljakovinske vrednosti izraz v 85,7% (12 od 14) vzorcev tumorjev v primerjavi z ustreznim nadzorom zmanjšal, medtem ko vzorec 5 in 11 prikazana obratno. Da bi potrdili te ugotovitve, smo dodatno izvedli mikromrež tkiva (TMA) ter ocenil raven beljakovin izraz THBS2 glede na rezultat radioinkorporacijo (IRS) vsakega vzorca. Našli smo THBS2 proteini so večinoma izražene v cytoplasms želodčnih celic (slika 2a), in v skladu z rezultati Western Blot, so bile ravni THBS2 močno zaviral v želodčnih tkivih raka v primerjavi z običajnimi kontrolami (slika 2B, P <0,05). Skupaj, naši rezultati kažejo, da je THBS2 navzdol urejeno v raka želodca tako mRNA in koncentracije proteina. Slika 1 mRNA in proteina nivo izražanja THBS2 v 14 želodčnih tkivih rakom in ustrezno normalno tkivo. (A) Relativna mRNA Izražanje THBS2 bila odkrita s kvantitativno PCR v realnem času. Izražanje normalnih tkiv smo normalizirali na 1,0, kot je navedeno. (b) denzitometrijo rezultati analize razponov THBS2 so preračunana na GAPDH uporabo Image J. Izražanje normalnih tkiv so normalizirani na 1,0, kot je navedeno. (C) Relativna protein izraz THBS2 ocenili Western blot testom.
Slika 2 imunohistokemičnim analizo THBS2, CD34. (A) Reprezentativni slike THBS2 in CD34 izraza: N1, N2, N3, N4, normalno v želodcu tkiva (N); M1, M2, M3, M4, zmerno razlikuje (M); P1, P2, P3, P4, slabo razlikujejo (P). Povečava: 100 × (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) in 400 × (N2, M2, P2). (B) Primerjava THBS2 izražanja raka želodca (n = 129) in normalnih tkiv želodca (n = 24) v TMA. Raven THBS2 izraz predstavljeni kot povprečje ± SEM. (C) Primerjava MVD v THBS2 pozitivni želodčni rak skupino (n = 70) in THBS2-negativne želodčnega raka skupine (n = 59). Pike predstavljajo MVD vsake vzorcev. Vrednosti so sredstva ± SEM. Stopnje izraženosti
THBS2 so inverzno povezana z histoloških vrst raka želodca
dodatno pojasniti klinično pomembno THBS2 smo analizirali odnos med THBS2 beljakovin izražanja in kliničnih značilnosti, vključno s starostjo, spolom, histoloških razred, lokacija tumorja, globina invazije, bezgavko metastaze in TNM faza bolnikov želodca raka v THBS2 pozitivnih in negativnih skupin. Kot je prikazano v tabeli 1, smo našli veliko inverzno povezavo z histoloških vrst raka želodca (P
< 0,01). V histološke stopnje bolnikov v THBS2 pozitivni skupini so bili bolj verjetno, da bodo dobro in zmerno, ker se bolniki v THBS2-negativno skupine večinoma slabi in drugi. Vendar pa nismo odkrili nobenega pomena statistično med izražanjem THBS2 in drugih kliničnimi parametri. Kolektivno, naši rezultati kažejo, da je THBS2 inverzno povezana z histološke raka želodca. Stopnje izraženosti
THBS2 so inverzno povezana z MVD v raka želodca
Prejšnja poročila pomenilo THBS2 bi uredili tumorsko angiogenezo [6], vendar so poročali none pri raku želodca. Zato smo vprašali, ali obstajajo povezave med MVD in stopnjah izražanja THBS2 kot tudi druge klinične parametre v naših kliničnih vzorcev. MVD v 129 želodčnih osebkov rakom v razponu od 0 do 120, z mediano 40 in srednja vrednost 48.12 ± 28.99 (povprečje ± SD) po radioinkorporacijo za CD34 v našem TMA. Kot je prikazano na sliki 2C, je THBS2 značilno povezana z MVD. MVD v THBS2-negativne skupine je bila precej višja od tiste v THBS2 pozitivni skupini (P
< 0,001). Vendar pa ni bilo mogoče opazovati vse s statističnimi razlike med MVD in drugih clinicopathologic funkcij, vključno s kliničnim prognozo v naših vzorcih (podatki niso prikazani). Skratka, naša odkritja kažejo, da je THBS2 inverzno povezana z MVD raka želodca.
THBS2 je bistveno povezan s klinično prognozo bolnikov želodca z rakom
Za preuči razmerje med THBS2 izražanja in klinično prognozo bolnikov z rakom želodca, smo izvedli preživetje analiz, ki jih univariatno in multivariatno Cox sorazmernega nevarnosti regresijski model. Kot je prikazano v tabeli 1, smo ugotovili, histološki razred, globina invazije, bezgavko metastaze in stopnja TNM bili statistično pomembni dejavniki za OS v univariantne analize. Ker pa stopnja TNM vsebuje tudi podatke o globini invazije in bezgavkah metastaze, smo dodatno izvedli multivariatne preživetje analize s prilagoditvijo za histološko razred in stopnjo TNM. Opazili smo, da TNM faza (P
< 0,001) in THBS2 izraz (P
< 0,01) sta bili obe neodvisni napovedni dejavniki za oceno rezultatov bolnikov. Višja stopnja TNM je dejavnik tveganja za daljše OS [P
< 0,001, HR (razmerje ogroženosti) = 7.23; 95% CI 3,55-14,69) in povišano izražanje THBS2 je še ugoden dejavnik za daljše OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% IZ 0,31-0,85). Poleg tega, Kaplan-Meier analizo preživetja tudi potrdili, da je bila THBS2 izraz značilno povezana s kliničnimi rezultati (slika 3, P < 0,01, n = 129). Bolniki z nižjo THBS2 izražanja prikaže bistveno krajši OS [mediano 36 mesecev, pomeni 40,07 ± 3,65 (povprečje ± SE) mesecev], medtem ko so bolniki z višjo THBS2 izražanja pokazala prognozo [mediano 59 mesecev, pomeni 53.70 ± 2,95 (povprečje ± SE ) mesecev]. Skupaj, naši rezultati kažejo, THBS2 je bistveno povezan s kliničnim prognozo bolnikov z rakom želodca, ki bi lahko postala prognostični označevalec raka želodca. Slika 3 Kaplan-Meier preživetje analize z log-rang test za celokupno preživetje (OS). Kaplan-Meier analiza korelacije med različnimi ravnmi THBS2 izražanja in OS pri 129 bolnikih z rakom želodca.
Čezmerno THBS2 zavira rast želodčnih rakavih celic in vitro
Ker je THBS2 občutno navzdol urejena v želodcu rak, smo sklepali, da bi lahko THBS2 zavirajo rast, spodbujajo apoptozo in povečanje migracije sposobnost želodca rakavih celic. Da bi preverili našo hipotezo, smo najprej zgrajena eno lentivirusni vektor k stabilnim express THBS2 transkriptov v želodcu raka celičnih linijah. Spremenjeno ekspresijo THBS2 v 293 T celic smo potrdili zahodni blot analizo (slika 4A). Nato smo izbrali MKN-45 in GSS-7901 celičnih linij za naše vitro
študije zaradi bile ravni mRNA ekspresijski THBS2 nižji kot drugi (podatki niso prikazani). Nato smo izvedli test nastanek kolonije oceniti učinke THBS2 na rast MKN-45 in SGC-7901 celic. Kot je prikazano na sliki 4B, smo ugotovili, celice THBS2 prekomerno tvori bistveno manj kolonije na mehki agar v primerjavi s tistimi za nadzor-vektorskih okuženih celic (P
< 0,01 za MKN-45 celic in P
< 0,001 za SGC-7901 celic, v tem zaporedju). Poleg tega smo pregledali ravni apoptoze med obema skupinama v obeh celičnih linijah in ugotovil, da THBS2 spodbuja apoptozo v SGC-7901 celic (slika 4f), vendar ne v MKN-45 celic (Dodatni datoteka 1: Slika S1A). In ni bilo bistvenih razlik med obema skupinama v SGC-7901 in MKN-45 celičnih linijah v celični migraciji v skladu z transwell teste (Dodatni datoteka 1: Slika S1B in C). Skratka, naši podatki potrjujejo, da THBS2 ovira rast želodčnih rakavih celic in vitro lahko preko regulacije apoptoze. Slika 4 Čezmerno THBS2 inhibira proliferacijo rakavih celic želodca, zatrl angiogenezo raka želodca ter spodbuja apoptozo v SGC-7901 celične linije in vitro. (A) Western blot analiza Zastava v 293 T celic s THBS2 prekomerno. (B) Analiza Colony številka MKN-45 in SGC-7901 celic z THBS2 prekomerno in negativno kontrolo. Vrednosti so sredstva ± SD od treh neodvisnih poskusih. (C) Slike tvorbe kolonij preizkusa. (D) analiza AngiogenicIndexCh1 endotelijske oblikovanja testa celica cevi. Vrednosti so sredstva ± SD. (E) Slike endotelijske tvorbe testu celica cevi. (F) Analiza apoptoze v celični liniji MKN-45. Vrednosti so sredstva ± SD.
THBS2 zavira raka želodca angiogenezo vitro
THBS2 je znana kot inhibitor angiogeneze [2]. Zagotoviti dokaze o THBS2 ureja angiogenski fenotip raka želodca so endotelne tvorba teste celica cevi izvedena. Kot je prikazano na sliki 4E in D, v obeh MKN-45 in SGC-7901 celičnih linijah, človekove popkovna vene endotelijske celice (HUVECs) kultivirani z medijem iz THBS2 overexpression želodčnih rakavih celic so pokazale bistveno nižje AngiogenicIndexCh1 kot negativno kontrolo (P
< 0,05 za MKN-45 celice in P
< 0,001 za SGC-7901 celic oz). Skupaj, naši rezultati kažejo, da THBS2 zavira angiogenezo želodčnih rakavih celic in vitro
.
Razprava
THBS2 je znan kot naravni močan inhibitor angiogeneze in modulator procesa preoblikovanja [22, 23]. Vendar nobena od nekdanjih raziskav so razpravljali o vlogi THBS2 in njegovo klinično pomembna pri raku želodca.
Prvič, smo ugotovili, da so bile ravni mRNA in izražanje beljakovin v THBS2 navzdol urejeno v večini vzorcev. Vendar pa je eden prejšnje raziskave poročajo THBS2 mRNA izraz pri raku želodca so bili višji od običajnega nadzora [24]. Glede na velikost omejeno vzorca v tej študiji, ki je vgrajena le 6 vzorcev tkiva, je možno, da te razlike zaradi tumorja heterogenosti za dva para naš drugi kohorte niso pokazali tudi enake vzorce. Toda naša poznejša posledica TMA, večje velikosti vzorca, je bil skladen z rezultatom iz drugega kohorte. Skupaj smo verjeli, da je THBS2 bolj verjetno, da bo dol urejeno v želodčnem rakave celice v primerjavi z normalno sluznico.
Poleg tega smo opazili tudi, da je relativni izraz vzorcev razstavljeni različno mRNA in na ravni proteinov. Nimajo zadostnih dokazov, sklepamo, da se funkcija THBS2 v želodčnih rakavih celic lahko ureja tudi nekaj znotrajceličnih nabavnih signalnih dejavnikov, beljakovin ubikvitinacije in drugih možnih načinov, ki lahko vplivajo na raven beljakovin za THBS2 in fenotipi v želodcu rakavih celic. In nadalje poudarek se lahko dajo na ta zanimiv pojav. Kljub temu je večina vzorcev iz našega drugi kohorte prikazan isti izraz vzorcev med mRNA in koncentracije proteina.
Drugič, naši podatki kažejo, da bi lahko THBS2 spodbuja apoptozo samo v SGC-7901 celic, ne pa tudi v MKN-45 celic. Nekdanji Raziskave so pokazale, da bi lahko N-terminal rekombinantni fragment THBS2 aktiviranje-CD36 posredovano endotelijske celične apoptoze [14], in kombinacijo CD36 in THBS2 lahko aktivira kaspaze signalno pot v [25]. Tako smo predpostavili, da heterogenost dveh celičnih linij, ki se uporabljajo v naši raziskavi, kot se razlikujejo CD36 izrazov, morda deloma razlog različnih ravneh apoptoze s THBS2, ki je zahtevala nadaljnje preiskave inducirane.
Tretjič, naši rezultati so pokazali, da THBS2 lahko zavirajo angiogenezo raka želodca. Znano je, da so proliferacije tumorja, invazija ali metastaze odvisna angiogenezo [26]. In dokaze, ki temeljijo podpirajo naše odkritje in poudarjajo, da so možne mehanizme, ki THBS2 zavirajo angiogenezo: 1) apoptoza neodvisen moda z indukcijo endotelnih celic apoptozo, celični cikel aretirali in zmanjšanje migracijskih endotelijskih celic [27], 2), odvisno od kaspaze signalizacijo pot aktivira CD36 [28]. 3), ki deluje kot so-receptorje za povezane beljakovine LDL receptorjev (LRP1), ki bi lahko očistili kompleksov THBS2 z matriko metaloproteinaz-2, -9 ali vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF) iz pericellular okolja mezenhimskih celic [ ,,,0],29-32].
Nazadnje MVD je eden izmed najpogosteje uporabljenih parametrov za oceno stopnje tumorsko angiogenezo in prejšnje študije so pokazale, MVD je lahko neodvisen napovedni dejavnik za rakom želodca in drugih tumorja [33-35]. V naši raziskavi smo ugotovili, MVD je pomembno povezana z izrazom THBS2 beljakovin (P
< 0,001) pri raku želodca, vendar ne s kliničnimi znaki in klinično prognozo. Ti rezultati so pokazali, da bi lahko THBS2 vpliva na angiogenezo pri raku želodca, kljub temu, ker ni korelacije med MVD in prognozo v naših vzorcih, smo domnevali, da višje THBS2 izraz označuje daljše preživetje ni bilo zgolj z inhibira angiogenezo raka želodca, drugih mehanizmov, kot so urejanje ECM remoulding [23] in širjenje stopnja želodčnih rakavih celic lahko tudi razlogi, ki jih je potrebno nadaljnje raziskave za raziskovanje.
kolektivno, naše ugotovitve poudaril pomembne vloge THBS2 v prognostičnih pomenov, kot tudi širjenje tumorja in angiogenezo v želodcu rak. Ti podatki kažejo, THBS2 lahko pomemben prognostični marker za bolnike z rakom želodca. Še več, na podlagi učinkov THBS2 na razvoj tumorjev in angiogenezo, naše raziskave zagotavljajo dragocene namige za klinične prakse na nanotehnologiji, ki zavirajo terapije s pomočjo ciljev izpeljane iz biološkega znanja, ki ga s podpisom THBS2.
Zaključek
naši raziskavi darila v prvi vrstici dokazov, da je THBS2 izraz navzdol urejene na ravni mRNA in ravni beljakovin in zmanjšala THBS2 izraz je povezan s slabim histološke raka želodca. Ključno je, čezmernim THBS2 ima pomembno povezanost z ugodno prognozo bolnikov z rakom želodca. Po drugi strani pa THBS2 prizadeti prognozo raka želodca, lahko ne samo skozi regulacijo angiogenezo, toda v nekaterih drugih načinov, kot so urejanje ECM remoulding in inhibira proliferacijo želodčnih rakavih celic. Te ugotovitve kažejo, da bi lahko THBS2 potencialno kritično vlogo v patogenezi in napredovanja raka želodca. Potrjujemo, da je s postopnim študij globino THBS2, je lahko obetaven koristno in enostavno biomarkerjev za napovedovanje rezultatov kliničnih raziskav pri bolnikih z rakom želodca.
Metode
Bolniki in vzorci tkiva
V tej študiji smo vključeni dve skupinama osebkov. Prvi kohorta je vsebovala 129, rak-formalinom fiksni parafinsko vgrajeni človeškega želodca in 24 naključno izbranih normalne želodca tkiva. Bili so zaporedoma zaposlen od decembra 2006 do maja 2008 na Oddelku za splošne kirurgije, Prva pridružiti bolnišnica Anhui Medical University, Hefei, Kitajska. Ti vzorci so bili vključeni v TMA za imunohistokemičnim barvanjem. Histološke značilnosti teh vzorcev so potrdili patologi. Patološka TNM uprizoritev je bil ocenjen po merilih skupnega odbora ameriškega raka (AJCC) 2010. Drugi kohorta je bila sestavljena iz 14 bolnikov želodca z rakom, ki so opravili tumorja zdravljenje v osmem oddelku za splošne kirurgije, The First odvisnimi bolnišnici Anhui Medical University. Sveže želodca tkivo rak in ustrezni normalno sluznico (vsaj 5 cm oddaljeno od roba tumorja) smo takoj zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C dokler je ne uporabi za Kvantitativno PCR v realnem času in Western blot analizo. Bolniki v obeh generacijah niso prejeli preoperativno kemoterapije in /ali obsevanje. Pisna privolitev je bila zagotovljena s strani vseh udeležencev. Vsi vzorci so bili obravnava anonimno v skladu z etičnimi standardi. Ta študija je bila izvedena z odobritvijo etični odbor za pregled v bolnišnico.
Ekstrakcijo RNA in kvantitativno PCR v realnem času
Total RNA je bila vzeta iz drugega kohorti uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen) po protokolu proizvajalca. cDNA smo sintetizirali z naključnimi primerji in Superscript II reverzne transkriptaze (Toyobo, Osaka, Japonska). Se primerji, ki se uporabljajo za pomnoževanje za THBS2: naprej oligonukleotidov 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'in obratno primer 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) smo pomnožili v istem q-PCR kot notranjo kontrolo s pomočjo primerjev: prednjega sesalno 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'in obratno premaz 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. Reakcija je potekal na sistemu ABI 7900HT Sequence Detection (Applied Biosystems, CA, ZDA) v prisotnosti SYBR-Green barvilom (Toyobo, Osaka, Japonska). Reakcijski pogoj je bil program denaturacijski (95 ° C 5 min) in program ojačitve in kvantifikacije za 40 krogov (95 ° C za 15 sekund in 60 ° C za 45 sekund). Vsak vzorec smo testirali v treh izvodih in analiza taljenje krivulja vsakega vzorca smo uporabili za preverjanje specifičnost pomnoževanja. Nivo izražanja je bil določen kot razmerje med THBS2 in GAPDH notranjih kontrol v zneskih mRNA izračunanih s primerjalno metodo CT. Ekstrakcija
beljakovin in Western Blot
Skupaj beljakovine so bili pridobljeni od 14. zamrznjenega raka želodca in njene ustrezne normalno sluznica tkiva z ledom v radio imuno testa liznega pufra (RIPA; Beyotime inštitut za biotehnologijo, Jiangsu, Kitajska), in izmerjene z uporabo analiznega kompleta BCA beljakovin (Beyotime inštitut za biotehnologijo, Jiangsu, Kitajska). Lizat smo centrifugirali pri 12000 obratih na minuto za 5 minut in supernatant smo segrevali pri 100 ° C 5 minut. Nato so bile enakovredne proteini vsakega para osebkov ločimo na 8% natrijevega dodecil sulfata poliakrilamidno gelsko elektroforezo in elektrotransferiramo na poliviniliden fluorid membrane (Millipore, Billerica, MA). Po blokirana s TBST vsebuje 5% posneto mleko v pri sobni temperaturi za eno uro, smo membrane osušili z anti-THBS2 protitelesa (1: 1500; Novus) in anti-Flag (1: 3000; Sigma). Sledi membrane inkubacija s hrenovo peroksidazo označenega anti-zajec in anti-miške IgG kot sekundarnih protiteles (Beyotime inštitut za biotehnologijo). Anti-GAPDH protitelo (1: 4000; Aogma) smo uporabili kot kontrolno nalagajo protitelesa. Pogodbene protitelesa so bila opažena z izboljšano metodo kemiluminiscentnim.
Imunohistokemija in TMA analiza
želodca raka in normalnih želodčne sluznice primerki so formalinom določen, je vstavljen v parafin in so bili uporabljeni za gradnjo tkiva TMA. H & E-obarvajo diapozitivi so bili pregledani, da prepoznajo optimalno intratumoural tkivo za analizo. 4-Lun debele odseki smo pekli pri 60 ° C 1 uro, deparaffinised z ksilenov in rehidrirane v stopenjski etanolu z destilirano vodo. Antigen Preiskovalna smo dosegli z dajanjem odseke s citratnim pufrom v riža Parnik 30 minut. Pogasiti endogenega peroksidaze dejavnost, so oddelki zdravljenih s 3% H 2O 2 v metanolu. Nato smo uporabili 1% goveji serumski albumin, da blokira nespecifične vezave. Anti-THBS2 protitelesa (Novus, 1: 2000) in anti-CD34 (Abcam, 1: 250) inkubiramo z oddelki pri 37 ° C preko noči, nato inkubiramo s hrenovo peroksidazo označenega anti-kunčjega IgG kot sekundarnega protitelesa (življenjskem Technologies). Na koncu so bili diapozitivi postavljeni na povezavo instrumenta autostainer in nadaljujte z barvanjem. Za negativne kontrole, so primarni protitelesa nadomesti z običajnim kunčjega seruma. Končno učinkovito Imunohistokemijsko je bila ocenjena z dvema neodvisnima patologi brez poznavanja podatke pacientov odvisno od intenzivnosti in obsegu obarvanje barvanja. oddelek tkivo je dosegel kot odstotek obarvanih citoplazme v celicah želodčne rak žlez in normalnih celic žleze (0 točk za brez celic obarvajo, 1 točka za < 25%, 2 točki za 25-75% in 3 točke za > 75 % celic obarvajo), in intenzivnost obarvanja radioinkorporacijo bila ocenjena na lestvici od 0 do 3. bil rezultat radioinkorporacijo (IRS) je povzročila z množenjem obeh parametrov. Osebki so bili dosegel na naslednji način: negativni (IRS = 0 ~ 2), pozitivna (IRS = 3 ~ 9)
MVD štetje
Imunohistokemijsko za CD34 in splošno sprejeta merila, ki jih Weidner et al opravili.. [36] so bili uporabljeni MVD štetje. Koli obarvajo endotelne celice ali endotelijske celične grozdi ločimo od sosednjih microvessels in debelina vsake žilne stene kot 2,75 um bi izključena. Trije ločeni deli, ki vsebujejo vročih krajev (kjer je barvna najvišje število diskretnih microvessels) v vsakem vzorcu TMA so bili izbrani v majhnih povečavah (100 ×) pod svetlobnim mikroskopom (Leica, Nemčija). Nato so microvessels prešteti v vsakem oddelku v visoki povečavi (200 ×).

• LNC RNA HotAir deluje kot konkurenčnega endogenega RNA za urejanje HER2 izražanje sponging MIR-331-3p pri raku želodca
• Proteomskimi sprememba gastic adenokarcinomov iz japonskih bolnikih