Dolje regulacija Thrombospondin2 predviđa lošu prognozu u bolesnika s karcinomom želuca

Dolje regulacija Thrombospondin2 predviđa lošu prognozu u bolesnika s karcinomom želuca pregled apstraktne pregled pozadine
Thrombospondins (THBSs) su porodica mikrodomena i luči matricellular Ca 2 + -vezujući glikoproteini koji ima najmanje pet članova kodirane neovisnim genima. Kao član obitelji THBSs, Thrombospondin2 (THBS2) je izvijestila da regulira angiogenezu. Ipak, funkcije i klinički značaj THBS2 dalje ostaje nejasno u rak želuca.
Metode
mRNA i proteina razina THBS2 ispitana je na 14 paru želučanih uzoraka raka i odgovarajuće normalne mucosas pomoću kvantitativne real-time PCR i western blot analize. Imunohistokem od THBS2 i CD34 na populacije na bazi microarrays tkiva koja se sastoji od 129 slučajeva raka želuca su korišteni za procjenu prognostički značaj THBS2 i krvnih žila, gustoće (MVD) svakog uzorka. Preživljavanje analize provedene su Kaplan-Meier metodi i Cox proporcionalnog opasnosti modela. Kolonija formiranje ispitivanje, stvaranje cjevčica endotelnih stanica, migraciju stanica test i apoptoze analiza u MKN-45 i SGC-7901 stanične linije su provedena za procjenu učinaka THBS2 na rak želuca in vitro pregled. Pregled Rezultati
85,71% (12 od 14) želučani tkiva raka izražene značajno niži THBS2 u oba mRNA i proteina nego odgovarajući normalnih kontrola. Dosljedno, microarray tkiva (TMA) Rezultati su pokazali THBS2 razine također su inhibirane u želučanom tkivu raka u usporedbi s kontrolnom skupinom. Osim toga, primijetili smo da su pacijenti s višim razinama THBS2 su značajno korelira s povoljnijim prognozu, dok smanjena THBS2 izraz su bili povezani sa siromašnijim histološkim stupnjem raka želuca. Osim toga, naši in vitro pokusi se pokazalo da prekomjerna ekspresija THBS2 može otežati i stopa proliferacije i formiranje cijevi za ljudska endotelne stanice umbilikalne vene (HUVEC) u MKN-45 i SGC-7901 stanične linije. Pregled Zaključak
Naša studija sugerira THBS2 neprirodno umnaža u rak želuca i igra ključnu ulogu u progresiji karcinoma, koja može biti potencijalni prognoza prediktor raka želuca. pregled Ključne riječi pregled THBS2 rak želuca angiogeneze prognostički marker-Uvod pregled, rak želuca je vrlo agresivni i smrtonosni zloćudni tumor. Ukupno 952,000 novih slučajeva raka želuca i 723,000 smrtnih slučajeva procijenjeno je da su se dogodili u 2012, što čini 6,8% od ukupnog broja slučajeva i 8,8% ukupnih smrtnih slučajeva. Osim toga, oba nova slučaja i smrti od karcinoma želuca u Kini, zauzela 1. globalno, što čini više od 40% da je u svijetu [1]. Stoga velike zabrinutosti su podigli za istraživanja raka želuca. Pregled Thrombospondins (THBSs) su porodica mikrodomena i matricellular Ca 2 + -vezujući glikoproteini luče strome fibroblasta, endotelne stanice i stanica imunološkog sustava [2]. Oni imaju najmanje pet članova kodirane neovisnim genima. Vezanjem s brojnim ciljnih proteina, sudjeluju u različitim biološkim procesima kao što su angiogeneza, motilitet stanice, apoptoza, organizacije citoskeleta, te služe kao interakcije platforme u ekstracelularnog matriksa (ECM) [3, 4]. Naime, THBS1 i THBS2 smo posebno u ovoj obitelji za njihove tipa I ponavlja i obojica su uglavnom prikazani kao inhibitori angiogeneze [5, 6], jedan ključni dio istraživanja raka [7-9]. Gustoća sitnih krvnih žila (MVD) je naširoko koristi parametar za procjenu stupnja angiogeneze u tumorima s CD34 bude mikropora kavu u rakom želuca [10]. Na temelju dosadašnjih nalaza [2], mi iznijela tezu u našem istraživanju da ona također može utjecati na angiogenezu u rak želuca.
Osim angiogeneze, THBS2 je izvijestila da interakciju s više staničnih receptora, faktora rasta i proteina ECM kao i reguliraju apoptozu, proliferaciju stanica i prianjanje [11]. U istraživanjima raka, povećanje pažnje bile su usmjerene na THBS2. Tokunaga et al. [12] je utvrdio da THBS2 izražena u bolesnika s karcinom debelog crijeva pokazala je značajno manji rizik od jetrenih metastaza i tumora vaskularne u usporedbi s pacijentima čiji su tumori bili nedostatak THBS2. Nadalje, De Fraipont et al. [13] pokazalo je da THBS2 značajno korelira s kliničkom stanju i ishodu, a za većinu tumora, bilo je inverzna korelacija između razine THBS2 izražavanja i stupanj njihove malignosti. Osim toga, THBS2 također odigrao ključnu ulogu u raka dojke [14], mijeloma [15], malignog melanoma [16], rak prostate [17] i plućni adenokarcinom [18, 19]. Kod karcinoma želuca, ostali članovi THBSs, THBS1 [20] i THBS4 [21] može biti kao prognostički biomarkera ili moćne marker za difuzne tipa želučanog adenokarcinoma. Međutim, detaljni funkcija THBS2 kod raka želuca i njegove implikacije za kliničku dijagnozu i dalje tužan. Dakle, pokušali smo otkriti kliničko značenje THBS2 i njezin utjecaj na rak želuca.
Biste provjerili našu navedenu hipotezu, ispitali smo razine THBS2 ekspresije u ljudskim tkivima s rakom želuca i odgovara normalna tkiva, a potom istražiti moguće korelacije između izraz THBS2 i kliničkopatološkim značajkama, kliničkom prognozom i MVD brojenje u bolesnika s karcinomom želuca. Pored toga, formiranje kolonija ispitivanje, stvaranje cjevčica endotelnih stanica, migraciju stanica testom i apoptozu analize su provedene u MKN-45 i SGC-7901 staničnih linija za istraživanje in vitro
učinak THBS2 u želučanom stanica raka.
Rezultati
bolesnika obilježja i kliničkih ishoda
u ovom istraživanju, upisani smo 129 pogodnih bolesnika, koji se sastojao od 101 muškaraca i 28 žena. Dob bolesnika u rasponu od 29 do 80 godina (Y) prosječne dobi od 61y. Sve kliničkopatološkim obilježja sažeto su prikazani u tablici 1. Prosječno preživljavanje (OS) bolesnika bila je 57 mjeseci, a znači OS je 44.01 [95% interval pouzdanosti (CI) 39.78-49.24 mjeseci] .table 1 Udruga među kliničkopatološkim varijabli i THBS2 izražavanje i preživljavanje pacijenata s rakom želuca
varijabli pregled pregled Negativan
pozitivan
Ukupno broj
P valuea
Sveukupno preživljenje OS
log-rank PB
HR (95% CI)
br. (%) pregled, br. (%) pregled doba (y )
0,112 pregled 0.743 izvoznici < 61 pregled, 24 (38,1)
39 (61,9)
63 pregled, 1 (referenca) pregled ≥61 pregled 35 ( 53,0)
31 (47,0)
66 pregled, 1,09 (0,67-1,77)
Spol pregled 0.831
0,405 pregled Muški pregled 47 (46,5) pregled, 54 ( 53,5) pregled, 101 pregled 1 (referenca) pregled ženskih pregled, 12 (42,9)
16 (57,1)
28
0.76 (0.40-1.45) pregled histološkog stupnja
0,005 pregled 0,011 pregled pa i umjerena pregled 24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (referentna) pregled siromašnih i drugi pregled, 35 (60,3 )
23 (39,7)
58
1,89 (1.16-3.09) pregled tumora lokaciji pregled 0,419 pregled 0.204
Gornja pregled 27 (40,3)
40 ( 59,7)
67 pregled, 1 (referenca) pregled Srednji
15 (53,6)
13 (46,4)
28 pregled, 1,66 (0,86-3,18) pregled, starijima
17 (50,0)
17 (50,0)
34 pregled, 1,90 (0,90-4,01) pregled Dubina invazije
0,271 pregled 0.001 pregled T1-T2 pregled 9 ( 34.6)
17 (65,4)
26
1 (referentnim) pregled, T3-T4 pregled 50 (48,5)
53 (51,5)
103
11,60 (2,83 -47,45) pregled limfnih čvorova metastaze pregled 0.454 Netlogu < 0,001 pregled Odsutni pregled 17 (40,5)
25 (59,5)
42 pregled, 1 (referenca)
Present pregled 42 (48,3)
45 (51,7)
87 pregled, 5,16 (2,46 - 10,84)
TNM stadij pregled 0.283 izvoznici < 0,001 pregled i-II pregled, 21 (39,6)
32 (60.4)
53 pregled, 1 (referenca) pregled, III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52 - 14,49)
Bold vrijednost nije statistički značajan na P Netlogu < 0.05, omjer HR opasnost.
A, P pregled vrijednost kliničkopatološkim varijabli i THBS2 izražavanja.
B, P pregled vrijednost povezanosti kliničkopatološkim varijabli i ukupno preživljavanje pacijenata s rakom želuca. Pregled THBS2 je dolje regulirana u rak želuca Netlogu kako bi se odredila razina ekspresije THBS2 kod raka želuca, prvo smo ocijenili razinu ekspresije mRNA THBS2 Netlogu kod raka želuca kvantitativnom realnom vremenu u drugoj skupini. Ova skupina od uzoraka, koji se spominje u Postupcima, uključeno 14 humanog karcinoma želuca i odgovarajuće normalna tkiva. Kao što je prikazano na slici 1A, THBS2 pregled razine bile značajno niže u 85,7% (12 od 14) želučanog tkiva raka od svojih normalnih kontrola, dok su preostala dva para uzoraka pokazao je suprotno. Zatim, otkrili smo razine ekspresije proteina u THBS2 putem Western blot u istoj skupini. Kao što je prikazano u Figure1B i C, primijetili smo da su razine ekspresije proteina THBS2 smanjena u 85,7% (12 od 14) uzoraka tumora u usporedbi s odgovarajućom kontrolom, a uzorak 5 i 11 prikazuju obrnuto. Da biste potvrdili ovaj nalaz, mi i dalje obavlja mikročipa tkiva (TMA) i procjenjivanje razine ekspresije proteina u THBS2 skladu s rezultatom imunoreaktivnosti (IRS) svakog uzorka. Pronašli smo THBS2 proteini uglavnom su izražene u cytoplasms želučane stanice (slika 2a), te u skladu s rezultatima western blot, razine THBS2 bile značajno inhibirana u želučanom tkivu raka u usporedbi s kontrolnom skupinom (slika 2B, P ' 0,05). Uzeti zajedno, naši rezultati pokazuju da THBS2 je dolje regulirana karcinoma želuca u oba mRNA i proteina. Slika 1 mRNA i proteina razina ekspresije THBS2 u 14 želučanog tkiva raka i odgovarajući normalno tkivo. (A) Relativni mRNA ekspresija THBS2 detektira se kvantitativno u realnom vremenu PCR. Ekspresija normalnih tkiva su normalizirani na 1.0 kako je naznačeno. (b) denzitometrijskih rezultati analiza THBS2 bendova su normalizirani na GAPDH pomoću slika J. Izražavanje normalnog tkiva su normalizirani na 1,0 kako je naznačeno. (C) Relativna proteina izraz THBS2 procijenjena je metodom Western blot.
Slika 2 imunohistokemijska analiza THBS2, CD34. (A) Reprezentativne slike THBS2 i CD34 izrazom: N1, N2, N3, N4, normalno tkivo želuca (N); M1, M2, M3, M4, umjereno diferencirani (M); P1, P2, P3, P4, slabo diferencirani (P). Povećanje: 100 × (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) i 400 × (N2, M2, P2). (B) Usporedba THBS2 ekspresije raka želuca (n = 129) i normalnog tkiva želuca (n = 24) u TMA. Razina THBS2 izraz prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. (C) Usporedba MVD u THBS2 pozitivne rak želuca skupina (n = 70) i ​​THBS2 negativnom želučanog skupine raka (n = 59). Točkice predstavljaju MVD svakog uzorka. Vrijednosti su ± SEM. Razine ekspresije pregled THBS2 inverzni su u korelaciji s histološkim stupnjem karcinoma želuca pregled dodatno razjasniti kliničku važnost THBS2, analizirali smo odnos između izraza THBS2 proteina i kliničke značajke, uključujući dob, spol, histološkog razred, lokacija tumora, dubina invazije, limfni čvor metastaze i TNM stadij bolesnika s rakom želuca u THBS2-pozitivne i negativne grupe. Kao što je prikazano u tablici 1, otkrili smo značajnu inverznu korelaciju s histološkim stupnjem rakom želuca (P pregled < 0,01). Histološki razreda pacijenata u THBS2-pozitivne grupe bili su više vjerojatno da će biti dobro i umjereno, dok su pacijenti u THBS2-negativne grupe skloni biti siromašan i druge. Međutim, nismo uspjeli otkriti bilo značenje statistički između razina ekspresije THBS2 i drugih kliničkih parametara. Zajedno, naši rezultati ukazuju na to da THBS2 inverzni korelaciji s histološkim stupnjem raka želuca. Pregled THBS2 razine ekspresije inverzni koreliraju s MVD u rakom želuca pregled Raniji izvještaji implicira THBS2 može regulirati tumorske angiogeneze [6], ali nitko nije bio prijavio u raka želuca. Dakle, pitali smo je li bilo korelacija između MVD i THBS2 razinama ekspresije, kao i drugi klinički parametri u našim kliničkim uzorcima. MVD u 129 želučanim uzoraka raka u rasponu od 0 do 120, sa srednje vrijednosti od 40, a srednja vrijednost 48.12 ± 28.99 (srednja vrijednost ± SD), u skladu s imunoreaktivnosti CD34 u našem TMA. Kao što je prikazano na Slici 2C, THBS2 značajno korelira s MVD. MVD u THBS2 negativnom skupine bio je znatno veći nego u THBS2 pozitivne skupine (P pregled < 0,001). Međutim, ne možemo promatrati bilo statističke razlike između MVD i drugih kliničko značajki, uključujući kliničkom prognozom u našim uzorcima (podaci nisu prikazani). U zaključku, naša otkrića pokazuju da THBS2 inverzni korelaciji s MVD u rak želuca.
THBS2 značajno je povezana s kliničkom prognozom bolesnika s rakom želuca
Ispitati odnos između THBS2 izražavanja i kliničkom prognozom bolesnika s rakom želuca, proveli smo opstanak analize, univarijantne i multivarijatne Cox-a proporcionalnom opasnosti regresije. Kao što je prikazano u tablici 1, pronašli smo histološki stupanj, dubinu invazije, limfnih čvorova metastaze i TNM stadij bili statistički značajni faktori za OS u univarijantne analize. Međutim, budući da TNM stadij također sadrži podatke o dubini invazije i metastaziranja limfnog čvora, mi i dalje obavlja multivarijatne opstanak analizira s podešavanjem za histološkog stupnja i TNM fazi. Primijetili smo da je TNM stadij (P izvoznici < 0,001) i THBS2 izraz (P izvoznici < 0,01) bili su neovisni prognostički čimbenici za procjenu ishoda bolesnika. Viši stadij TNM je faktor rizika za duži OS [P izvoznici < 0,001, HR (omjer rizika) = 7,23, 95% CI 3,55-14,69) i povišena ekspresija THBS2 je još povoljniji faktor za duži OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% CI 0,31 do 0,85). Štoviše, Kaplan-Meier analiza preživljavanja dodatno je potvrdila da THBS2 izražavanje bilo značajno povezano s kliničkim ishodima (slika 3, P < 0,01, n = 129). Bolesnici s nižim THBS2 izražavanja prikazuje znatno kraći OS [medijan 36 mjeseci, znači 40,07 ± 3,65 (srednja vrijednost ± SE) mjeseci], dok bolesnici s višim THBS2 izraza su pokazali povoljan prognozu [medijan 59 mjeseci, znači 53.70 ± 2.95 (srednja vrijednost ± SE ) mjeseci]. Zajedno, rezultati pokazuju THBS2 značajno je povezana s kliničkom prognozom za pacijente s rakom želuca, što može postati prognostički marker za rak želuca. Slika 3 Kaplan-Meier opstanak analizira s log-rank test za ukupno preživljenje (OS). Kaplan-Meier analiza korelacija između različitih razina THBS2 ekspresije i OS u 129 bolesnika s rakom želuca. Pregled Prekomjerna ekspresija THBS2 inhibira rast stanica želuca raka in vitro
Zbog THBS2 bila je značajno dolje regulirana želuca rak, zaključuje se da THBS2 mogli inhibirati rast, potiču apoptozu i poboljšati sposobnost migracije želučanih stanica raka. Da biste potvrdili našu hipotezu, prvo konstruirao jedan lentivirusnog vektor na stabilne izričitim THBS2 transkripata u želučanom staničnim linijama karcinoma. Promijenjena ekspresija THBS2 u 293 T stanica potvrđena je pomoću Western blot analize (Slika 4A). Zatim, odabrali smo MKN-45 i SGC-7901 stanične linije za naše in vitro
studija, jer su razine ekspresije mRNA THBS2 bile su niže od ostalih (podaci nisu prikazani). Zatim smo izveli pokus formiranja kolonija za procjenu učinaka THBS2 na rast MKN-45 i SGC-7901 stanica. Kao što je prikazano na Slici 4B, pronašli smo stanice s prekomjernom ekspresijom THBS2 formiran znatno manje kolonije na mekanom agaru u usporedbi s onima iz kontrolne vektora inficirane stanice (P pregled < 0.01 za MKN-45 stanice i P
< 0.001 za SGC-7901 stanice, respektivno). Štoviše, ispitali smo razine apoptoze između dviju skupina u obje stanične linije i otkrio da THBS2 promovira apoptoze u SGC-7901 stanica (Slika 4f), ali ne u MKN-45 stanica (dodatne datotečne 1: Slika S1A). A nije bilo značajne razlike između dviju skupina u SGC-7901 i MKN-45 staničnim linijama u migraciji stanica prema transjažična testovima (Dodatni datoteke 1: Slika S1B i C). Ukratko, naši podaci podržavaju da THBS2 sprječava rast želučanih stanica raka in vitro eventualno putem regulacije apoptoze. Slika 4 Prekomjerna ekspresija THBS2 inhibiraju proliferaciju želučanih stanica karcinoma, potisnuti angiogenezu raka želuca i promovira apoptoze u SGC-7901 stanične linije in vitro. (A) Western blot analiza zastave u 293 T stanicama s THBS2 prekomjernom ekspresijom. (B) Kolonija broj analiza za MKN-45 i SGC-7901 stanica s THBS2 prekomjernom ekspresijom i negativnu kontrolu. Vrijednosti su sredstva ± SD iz tri neovisna pokusa. (C) Slike testom formiranja kolonije. (D) AngiogenicIndexCh1 analiza testa stvaranje cjevčica endotelnih stanica. Vrijednosti su sredstva ± SD. (E) Slike testa stvaranje cjevčica endotelnih stanica. (F) Analiza apoptoze u MKN-45 stanične linije. Vrijednosti su srednje vrijednosti ± SD. Pregled THBS2 potiskuje tumor želuca angiogeneza in vitro
THBS2 poznat kao inhibitor angiogeneze [2]. Osigurati dokazi THBS2 regulira angiogeni fenotip karcinoma želuca, testovi stvaranje cjevčica endotelnih stanica provedeno. Kao što je prikazano na slici 4E i D, u oba MKN-45 i SGC-7901 staničnih linija ljudske endotelne stanice umbilikalne vene (HUVEC) su uzgojene u mediju iz THBS2-prekomjernom ekspresijom stanica raka želuca pokazao znatno niže AngiogenicIndexCh1 od negativne kontrole (P
0,05 za MKN-45 stanice i P
< 0.001 za SGC-7901 stanice, respektivno). Kolektivno, naši rezultati pokazuju da THBS2 potiskuje angiogenezu želučanih stanica raka in vitro pregled.
Rasprava pregled THBS2 poznat kao prirodni moćan inhibitor angiogeneze i modulator procesa pregradnja [22, 23]. Međutim, niti jedan od bivših istraživanja raspravlja uloge THBS2 i njegove kliničke važnosti u rak želuca.
Prvo, otkrili smo da mRNA i proteina razina THBS2 podregulirani u većini uzoraka. Međutim, prethodna istraživanja izvijestio THBS2 mRNA razine ekspresije u raka želuca bila je viša od normalne kontrole [24]. S obzirom na ograničenu veličinu uzorka u ovoj studiji, koji su obuhvatili samo 6 uzoraka tkiva, to je moguće za tu razliku zbog tumora heterogenosti dva para našoj drugoj skupini je također pokazuju iste obrasce. Ipak, naše zatim rezultat TMA, veće veličine uzorka, je u skladu s rezultatima iz druge skupine. Uzeti zajedno, vjerovali smo da THBS2 je više vjerojatno da će biti lijepo uređeno želučane stanice raka u odnosu na normalne sluznice.
Osim toga, mi također primijetio da je relativni izraz uzoraka drugačije izlaže u mRNA i proteina. U nedostatku dovoljno dokaza, možemo zaključiti da je funkcija THBS2 roku želučanih stanica raka mogu se urediti nekim unutarstaničnih signalnih uzvodno faktora, proteina ubiquitination i drugih mogućih načina, što može utjecati na razinu proteina od THBS2 i fenotipova u želučanom stanica raka. I dalje je naglasak može staviti na ovaj zanimljiv fenomen. Ipak, većina uzoraka iz naše druge skupine prikazani iste izraz uzoraka između mRNA i proteina.
Drugo, naši podaci su pokazali da THBS2 može potaknuti apoptozu samo u SGC-7901 stanica, ali ne u MKN-45 stanica. Dosadašnja istraživanja pokazali su da je N-terminalni rekombinantni fragment THBS2 može aktivirati CD36-posredovane apoptoze endotelnih stanica [14], i kombinacije CD36 i THBS2 može aktivirati kaspaze signalni put [25]. Dakle, pretpostavili smo da je heterogenost dvije stanične linije se koriste u našem istraživanju, kao i diferencirane CD36 izrazima, može djelomično biti razlog različitih razina apoptoze potaknute THBS2, koji je pozvao na daljnja istraživanja.
Treće, naši rezultati pokazuju da THBS2 mogao potisnuti angiogenezu od raka želuca. Poznato je da je proliferacija tumora, invaziju ili metastazu su ovisne o angiogenezi [26]. I na temelju dokaza podržati naše otkriće te ističu da su mogući mehanizmi koji THBS2 inhibira angiogenezu: 1) od apoptoze neovisan modni zbog izazivanja endotelnih stanica apoptoza, stanični ciklus zaustavljanje i smanjenje migracije endotelne stanice [27], 2) ovisna o kaspaze signalizaciju put aktivira CD36 [28]. 3) koji djeluje kao koreceptori za vezanih proteina lipoproteina niske gustoće receptora (LRP1), što bi moglo se jasno komplekse THBS2 s matričnih metaloproteinaza-2, -9 ili vaskularni endotelni faktora rasta (VEGF) iz pericelularno okruženje mezenhimalnih stanica [ ,,,0],29-32].
kraju, MVD je jedan od parametara najčešće se koristi za procjenu stupnja tumorske angiogeneze i prethodne studije su otkrili MVD bi mogao biti nezavisna prognostički čimbenik raka želuca i drugih tumora [33-35]. U našem istraživanju pronašli smo MVD je značajno korelira s izrazom THBS2 proteina (P izvoznici < 0,001) kod raka želuca, ali ne s kliničkim značajkama i kliničkom prognozom. Ti rezultati pokazuju da THBS2 moglo utjecati angiogeneze kod raka želuca, ipak, zbog niti povezanosti MVD i prognozu u našim uzorcima, sumnja se da je veći izraz THBS2 ukazuje na duži opstanak nije samo putem inhibicije angiogeneze raka želuca, drugih mehanizama, kao što su reguliranje ECM remoulding [23] i proliferacija stopa želučanih stanica raka također mogu biti razlozi koji trebaju daljnja istraživanja za istraživanje. pregled Zajedno, naši rezultati naglasili na važne uloge THBS2 u prognostičke značenja, kao i proliferacije tumora i angiogeneze u želučanom Rak. Ovi podaci ukazuju THBS2 mogla biti važan prognostički marker za pacijente s rakom želuca. Osim toga, na temelju učinaka THBS2 na razvoj tumora i angiogeneze, naša istraživanja pružiti vrijedne tragove za klinička praksa za razvoj molekularne inhibicije terapeutika pomoću ciljeva, izvedenim iz biološkog znanja koje se nalaze u THBS2 potpisom. Pregled Zaključak
Naša studija poklone prva linija dokaza da THBS2 izraz dolje regulirana na razini mRNA i proteina, a smanjen THBS2 izraz je povezana sa slabom histološkog stupnja raka želuca. Presudno, pojačanom ekspresijom THBS2 ima značajnu korelaciju s povoljnom prognozom bolesnika s rakom želuca. S druge strane, THBS2 utjecati prognozi kod karcinoma želuca može, ne samo kroz regulaciju angiogeneze, a u nekim drugim načinima kao što su reguliranje ECM remoulding i inhibirati proliferaciju stanica želuca raka. Ovi rezultati sugeriraju da THBS2 može biti potencijalno kritičnu uloga u patogenezi i progresiju raka želuca. Potvrđujemo da, s postupnim dubini studija THBS2, to može biti obećavajući koristan i jednostavan biomarker za predviđanje klinički ishod pacijenata s rakom želuca.
Metode pregled bolesnika i uzorke tkiva pregled U ovom istraživanju smo uključene dvije kohorte primjeraka. Prvi kohorta sadržavala 129 formalinom fiksna, parafin-ugrađen ljudski rak želuca i 24 nasumično odabranih normalan želudac tkiva. Oni su redom regrutirani u razdoblju od prosinca 2006. do svibnja 2008. godine iz odjela za opću kirurgiju, Prvi Povezana bolnice Anhui Medical University, Hefei, Kina. Ovi primjerci su uključeni u TMA za imunohistokemijsku bojenja. Histološki značajke tih uzoraka su potvrđene od strane patologa. Patološka TNM je ocijenjena prema kriterijima Zajedničkog odbora američkog protiv raka (AJCC) 2010. godine. Drugi kohorta se sastojala od 14 pacijenata s rakom želuca koji podvrgnuti odstranjivanja tumora terapiju na Osmoj Zavoda za opću kirurgiju, prvi SRODNE bolnice Anhui Medicinskom fakultetu Sveučilišta. Svježi rak želuca tkiva i odgovarajuće normalne sluznice (najmanje 5 cm udaljene od ruba tumora) odmah su zamrznuti u tekućem dušiku i pohranjeni na -80 ° C do upotrebe za kvantitativno realnom vremenu PCR i Western blot analize. Pacijenti u obje kohorte nije dobio preoperativna kemoterapija i /ili zračenje. Pismeni informirani pristanak dao je sve sudionike. Svi su uzorci obrađeni anonimno skladu s etičkim standardima. Istraživanje je provedeno uz odobrenje Etičkog pregled Odbora bolnici.
Ekstrakcija RNA i kvantitativnog real-time PCR pregled Ukupna RNA je izvađen iz druge kohorte pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača. cDNA sintetiziran je prajmera i Superscript II reverzne transkriptaze (Toyobo, Osaka, Japan). Primeri korišteni za amplifikaciju za THBS2: Forward primer 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'i reverznog primera 5' GCCATCGTTGTCATCATCAG-3 '. Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) amplificiran na isti q-PCR kao interna kontrola uporabom klica: primerom 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'i reverznog primera 5' GCCCAATACGACCAAATCC-3 '. Reakcija je vodio na sustavu ABI 7900HT Sequence Detection (Applied Biosystems, CA, USA) u prisutnosti SYBR-zelena boja (Tovobo, Osaka, Japan). Reakcija je stanje denaturacijom program (95 ° C za 5 minuta) i amplifikacije i kvantitativno program za 40 ciklusa (95 ° C za 15 s i 60 ° C, 45 s). Svaki uzorak ispitan je u triplikatu, a analiza krivulje taljenja svakog uzorka korišten je za provjeru specifičnosti pojačanja. Razina ekspresije određena je kao omjer između THBS2 i kontrolne GAPDH unutarnje u iznosima od mRNA izračunatih komparativne CT metodom. Vađenje pregled Proteini i Western blot pregled Ukupni proteini su iz 14 smrznutog raka želuca i njegov odgovarajući normalno sluznica tkiva ledom u radio imunotaloženje testnom puferu za lizu (Ripa, Beyotime institut za biotehnologiju, Jiangsu, Kina), a mjeri se pomoću pribora za ispitivanje BCA proteina (Beyotime instituta za biotehnologiju, Jiangsu, Kina). Lizat je centrifugiran na 12000 rpm tijekom 5 minuta, a supernatant se zagrijava na 100 ° C tijekom 5 minuta. Zatim ekvivalent proteini svakog para uzoraka su odvojeni na 8% natrijev dodecil sulfat poliakrilamid gel elektroforeze i electrotransferred na poliviniliden fluorida membrane (Millipore, Billerica, MA). Nakon Blokirani s TBST sadrži 5% obranog mlijeka u na sobnoj temperaturi jedan sat, membrane su osušene sa anti-THBS2 protutijelom (1: 1500; Novus) i anti-Flag (1: 3000, Sigma). Slijedi membrane inkubacija s peroksidaza-označenog anti-zec i anti-IgG-a kao sekundarnog protutijela (Beyotime Instituta za biotehnologiju). Anti-GAPDH antitijela (1: 4000; Aogma) je korišten kao kontrola utovar antitijela. Je vezana protutijela detektiraju sa poboljšanim postupkom kemiluminescencije. Pregled imunohistokemija i TMA analiza pregled rak želuca i normalno želučane sluznice jedinki formalinom fiksiranih, paraffin-embedded i korišteni su za konstrukciju tkiva TMA. H &E-obojeni slajdovi su testirane za identifikaciju optimalne intratumoural tkiva za analizu. 4 um debele sekcije su pečena na 60 ° C tijekom 1 sata, deparaffinised s ksilenom i rehidrirane kod stupnjevane etanola destilirane vode. Antigen dohvat je postignuta postavljanjem odjeljke citratnom puferu u riže parenje tijekom 30 minuta. Da bi se prekinula endogena peroksidazna aktivnost, sekcije su tretirane s 3% H 2O 2 u metanolu. Tada se koristi 1% goveđi serum albumin blokirati nespecifično vezanje. Anti-THBS2 antitijelo (Novus, 1: 2000) i anti-CD34 (Abcam, 1: 250) su inkubirani s dijelovima na 37 ° C preko noći, zatim se inkubira sa peroksidaza-označenog anti-zečjim IgG, kao sekundarno antitijelo (Life tehnologije). Na kraju, slajdovi su smještene na autostainer linka instrumenta i nastaviti s bojanjem. Za negativne kontrole, osnovni antitijela su zamijenjeni s normalnim serumom kunića. Konačni učinkovita imunohistokemijski bojanje Dva neovisna patologa bez poznavanja podatke pacijenata prema intenzitetu bojanja i opsegu bojenja. Tkivo sekcija je zabio kao postotak obojenog citoplazme u stanicama želuca rak žlijezda i normalnih stanica žlijezda (0 bodova za bez stanica obojenog, 1 bod za < 25%, 2 boda za 25-75%, a 3 boda za > 75 % stanica obojenog) i bojenje intenzitet imunoreaktivnosti je ocijenjena na skali od 0 do 3. imunoreaktivnost ocjena (IRS) je rezultat umnažanja oba parametra. Uzorci su označeni kao slijedi: negativne (IRS = 0 ~ 2), pozitivna (IRS = 3 ~ 9) pregled MVD računajući
imunohistokemijsku bojenje CD34 i općenito prihvaćenim kriterijima koje obavljaju Weidner i dr.. [36] su se koristili za MVD brojanje. Bilo obojene endotelne stanice ili endotelnih stanični klasteri su odvojeni od susjednih kapilarama, a debljina svakog stijenku posude preko 2,75 um će se isključiti. Tri odvojene sekcije sadrže hot-spotove (gdje je označena najveći broj diskretnih kapilarama) u svakom uzorku TMA su izabrani u malim povećanjima (100 ×) pod svjetlosnim mikroskopom (Leica, Njemačka). Nakon toga, Mikro vaskularne žile broje u svakom dijelu u velikim povećanjem (200 ×). P izvoznici < Svi autori pročitali i odobrili rukopis. Pregled

• LNC RNA HOTAIR funkcionira kao natječu endogene RNA da regulira ekspresiju HER2 po spužvom Mir-331-3p u želučanom cancer
• Proteomska promjena u gastic adenokarcinoma iz japanske patients