Nedregulering af Thrombospondin2 forudser dårlig prognose hos patienter med gastrisk cancer

nedregulering af Thrombospondin2 forudser dårlig prognose hos patienter med mavekræft
Abstract
Baggrund
Thrombospondins (THBSs) er en familie af multidomain og udskilles matricellular Ca 2 + -bindende glycoproteiner, som har mindst fem medlemmer kodes af uafhængige gener. Som THBSs familiemedlem har Thrombospondin2 (THBS2) blevet rapporteret at regulere angiogenese. Alligevel funktioner og kliniske betydning af THBS2 stadig uklart i gastrisk cancer. Salg Fremgangsmåder
mRNA og protein ekspressionsniveauer af THBS2 blev vurderet hos 14 parret af mavekræft prøver og tilsvarende normale slimhinder ved brug af kvantitativ realtids-PCR og western blot-analyse. Immunhistokemi af THBS2 og CD34 på populationsbaserede væv microarrays består af 129 gastriske kræfttilfælde blev brugt til at evaluere den prognostiske betydning af THBS2 og mikrokar densitet (MVD) af hver prøve. Overlevelse blev udført af Kaplan-Meier-metoden og Cox 'proportionale farer model. Kolonidannelse assay, endothelcelle rør dannelse assay, cellemigrationsassay og apoptose analyse i MKN-45 og SGC-7901 cellelinjer blev udført for at vurdere virkningerne af THBS2 på mavekræft in vitro
.
Resultater
85,71% (12 af 14) gastrisk cancer væv udtrykt bemærkelsesværdigt lavere THBS2 i både mRNA og protein niveauer end de tilsvarende normale kontroller. Konsekvent, viste væv microarray (TMA) resultater THBS2 niveauer blev også hæmmet i mavekræft væv sammenlignet med de normale kontroller. Desuden har vi observeret, at patienter med højere niveauer af THBS2 var signifikant korreleret med mere gunstig prognose, mens faldet THBS2 udtryk var forbundet med fattigere histologiske kvaliteter af mavekræft. Derudover vores in vitro eksperimenter yderligere vist, at overekspression af THBS2 kunne hindre både spredning sats og røret dannelsen af ​​Humane umbilical vene endotelceller (HUVEC'er) i MKN-45 og SGC-7901 cellelinjer.
Konklusion
Vores undersøgelse tyder THBS2 er afvigende udtrykt i gastrisk kræft og spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​kræft, der kan være en potentiel prognose indikator for mavekræft.
Nøgleord
THBS2 mavekræft angiogenese Prognostisk biomarkør Introduktion
gastrisk kræft er en meget aggressiv og dødelig malignitet. blev anslået i alt 952,000 nye tilfælde mavekræft og 723.000 dødsfald at have fundet sted i 2012, tegner sig for 6,8% af de samlede sager og 8,8% af de samlede dødsfald. Desuden Både nye tilfælde og dødsfald mavekræft i Kina, som nummer 1 på verdensplan, der tegner sig for over 40% af det i verden [1]. store bekymringer er derfor rejst til undersøgelser af mavekræft.
Thrombospondins (THBSs) er en familie af multidomain og matricellular Ca 2 + -bindende glycoproteiner udskilles af stromale fibroblaster, endotelceller og immunceller [2]. De har mindst fem medlemmer kodes af uafhængige gener. Ved at binde med mange målproteiner, de deltager i forskellige biologiske processer, såsom angiogenese, cellemotilitet, apoptose, cytoskeletorganisation, og tjene som interaktionsplatforme i den ekstracellulære matrix (ECM) [3, 4]. Især THBS1 og THBS2 er specielle i denne familie for deres type I gentagelser og begge af dem er primært vist som hæmmere af angiogenese [5, 6], en central del af kræftforskningen [7-9]. Mikrokar densitet (MVD) er et meget anvendt parameter til at estimere graden af ​​angiogenese i tumorer med CD34 er den mikrokar maker i gastrisk cancer [10]. Baseret på de tidligere resultater [2], vi fremsatte en hypotese i vores undersøgelse, at det også kan påvirke angiogenese i mavekræft.
Udover angiogenese har THBS2 blevet rapporteret til at interagere med flere celle receptorer, vækstfaktorer og ECM-proteiner såvel som at regulere apoptose, celleproliferation og adhæsion [11]. I kræft research, er stigende opmærksomhed været fokuseret på THBS2. Tokunaga et al. [12] fandt, at THBS2 udtrykt i patienter med coloncancer udviste en signifikant lavere risiko for hepatiske metastaser og tumor vaskularisering sammenlignet med de patienter, hvis tumorer var THBS2 mangel. Endvidere De Fraipont et al. [13] viste, at THBS2 var signifikant korreleret med klinisk status og resultaterne og for de fleste tumorer, var der en omvendt korrelation mellem THBS2 ekspressionsniveauet og graden af ​​deres malignitet. Derudover THBS2 spillede også en central rolle i brystcancer [14], myeloma [15], malignt melanom [16], prostatacancer [17] og pulmonal adenocarcinom [18, 19]. I mavekræft, kan andre medlemmer af THBSs, THBS1 [20] og THBS4 [21] være som en prognostisk biomarkør eller en stærk markør for diffus gastriske adenokarcinomer. Men den detaljerede funktion THBS2 i gastrisk kræft og dens konsekvenser for klinisk diagnose stadig trist. Således har vi forsøgt at afsløre den kliniske betydning af THBS2 og dens virkning i mavekræft.
At verificere vores førnævnte hypotese, vi undersøgte THBS2 ekspressionsniveauerne i humane gastrisk kræft væv og tilsvarende normale væv og derefter udforskes de mulige sammenhænge mellem ekspression af THBS2 og klinisk-patologiske træk, klinisk prognose og MVD optælling i patienter med gastrisk cancer. Desuden blev kolonidannelse assayet endotelcelle rør-dannelse assay cellemigrationsassay og apoptose analyse i MKN-45 og SGC-7901 cellelinier til at udforske in vitro
virkning THBS2 i gastriske cancerceller.
resultater
Patient karakteristika og kliniske resultater
i den foreliggende undersøgelse, vi indskrevet 129 egnede patienter, som bestod af 101 mænd og 28 kvinder. Alderen af ​​patienterne varierede fra 29 til 80 år (y) med en median alder på 61y. Alle klinisk-patologiske karakteristika er sammenfattet i tabel 1. Den mediane samlede overlevelse (OS) af patienterne var 57 måneder, og betyde OS var 44,01 [95% konfidensinterval (CI) 39.78-49.24 måneder] .table en Association blandt klinisk-patologiske variabler og THBS2 udtryk og samlet overlevelse af gastriske kræftpatienters
Variabler
Negativ
Positiv
Total No.
P værdiA
Samlet overlevelse OS
Log-Rank Pb
HR (95% CI)
Nej. (%)
Nej. (%)
Alder (y )
0,112
0,743
< 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (reference)
≥61
35 ( 53,0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67-1,77)
Køn
0,831
0,405
Mand
47 (46,5)
54 ( 53,5)
101
1 (reference)
Female
12 (42,9)
16 (57,1)
28
0,76 (0,40-1,45)
Histologisk klasse
0,005
0,011
Godt og moderat
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (reference)
Fattige og andre
35 (60,3 )
23 (39,7)
58
1,89 (1,16-3,09)
Tumor placering
0,419
0,204
Øvre
27 (40.3)
40 ( 59,7)
67
1 (reference)
Mellemøsten
15 (53,6)
13 (46,4)
28
1,66 (0,86-3,18)
Lavere
17 (50,0)
17 (50,0)
34
1,90 (0,90-4,01)
dybde invasion
0,271
0.001
T1-T2
9 ( 34,6)
17 (65,4)
26
1 (reference)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11,60 (2,83 -47,45)
lymfeknudemetastase
0,454
< 0,001
Fraværende
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (reference)
Nuværende
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5,16 (2,46-10,84)
TNM stadie
0,283
< 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (reference)
III-IV
38 (50,0)
38 (50,0)
76
7,14 (3,52-14,49)
Fed værdi er statistisk signifikant ved P
< 0,05, HR hazard ratio.
En, P Drømmeholdet værdi af klinisk-patologiske variabler og THBS2 udtryk.
B P Drømmeholdet værdi af sammenhæng mellem klinisk-patologiske variabler og samlet overlevelse af gastrisk kræftpatienter.
THBS2 nedreguleres i gastrisk cancer
for at bestemme ekspressionsniveauerne af THBS2 i gastrisk cancer, vi først evalueret mRNA ekspressionsniveauer af THBS2
i gastrisk cancer ved kvantitativ real-time i den anden gruppe. Denne kohorte af prøver, der er nævnt i Methods, omfattede 14 human gastrisk cancer og de tilsvarende normale væv. Som vist i figur 1A, THBS2
niveauer var markant lavere i 85,7% (12 af 14) af de gastriske cancer væv end dens normale kontroller, mens de resterende to par prøverne udviste det modsatte. Derefter, vi har registreret de protein ekspressionsniveauer af THBS2 via western blot i samme kohorte. Som vist i Figure1B og C, vi observeret, at THBS2 protein ekspressionsniveauer var nedsat i 85,7% (12 af 14) af de tumorprøver forhold til dens tilsvarende kontrol, mens prøve 5 og 11 vises inverst. For at bekræfte dette fund, vi yderligere udføres et væv microarray (TMA) og vurderet protein ekspressionsniveauer af THBS2 ifølge immunoreaktiviteten score (IRS) af hver prøve. Vi fandt THBS2 proteiner blev hovedsageligt udtrykt i cytoplasmaer af mavens celler (figur 2A), og i overensstemmelse med resultaterne af western blot, niveauerne af THBS2 var signifikant hæmmet i mavekræft væv sammenlignet med de normale kontroller (figur 2B, P <0,05). Tilsammen viser vores resultater, at THBS2 nedreguleres i gastrisk cancer hos både mRNA og protein niveauer. Figur 1 mRNA og protein ekspressionsniveauet af THBS2 i 14 gastriske cancervæv og det tilsvarende normale væv. (A) Relativ mRNA ekspression af THBS2 blev påvist ved kvantitativ realtids-PCR. Ekspression af normale væv blev normaliseret til 1,0 som angivet. (B) Den densitometrianalyse resultaterne af THBS2 båndene blev normaliseret til GAPDH hjælp af Image J. Ekspression af normale væv blev normaliseret til 1,0 som angivet. (C) Relativ protein ekspression af THBS2 blev vurderet ved Western blot-assay.
Figur 2 Immunhistokemisk analyse af THBS2, CD34. (A) Repræsentative billeder af THBS2 og CD34-ekspression: N1, N2, N3, N4, normal gastrisk væv (N); M1, M2, M3, M4, moderat differentieret (M); P1, P2, P3, P4, dårligt differentierede (P). Forstørrelse: 100 × (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) og 400 × (N2, M2, P2). (B) Sammenligning af THBS2 udtryk for mavekræft (n = 129) og normale gastriske væv (n = 24) i TMA. Den THBS2 ekspressionsniveau præsenteret som gennemsnit ± SEM. (C) Sammenligning af MVD i THBS2-positiv mavekræft (n = 70) og THBS2-negative mavekræft (n = 59). Dots repræsenterer MVD af hver prøver. Værdier er middel ± SEM.
THBS2 ekspressionsniveauerne er omvendt korreleret med histologiske kvaliteter af mavekræft
For yderligere at præcisere den kliniske betydning THBS2, vi analyserede forholdet mellem THBS2 proteinekspression og kliniske funktioner, herunder alder, køn, histologiske kvalitet, tumor position, dybde af invasion, lymfeknudemetastase og TNM fase af mavecancerpatienter i THBS2-positive og negative grupper. Som vist i tabel 1, fandt vi en signifikant omvendt korrelation med de histologiske kvaliteter af gastrisk cancer (P
< 0,01). De histologiske kvaliteter af patienter i THBS2-positive gruppe var mere tilbøjelige til at være godt og moderat, mens patienter i THBS2-negative gruppe tendens til at være dårlig og andre. Vi undlod imidlertid at opdage nogen betydning statistisk mellem ekspressionsniveauerne af THBS2 og andre kliniske parametre. Kollektivt vores resultater tyder på, at THBS2 invers korreleret med histologisk grad af gastrisk cancer.
THBS2 ekspressionsniveauer er invers korreleret med MVD i gastrisk cancer
Tidligere rapporter underforstået THBS2 kunne regulere tumor angiogenese [6], men ingen blev rapporteret i gastrisk cancer. Derfor har vi spurgt, om der var nogen korrelationer mellem MVD og THBS2 udtryk niveauer samt andre kliniske parametre i vores kliniske prøver. MVD i 129 gastrisk cancer prøver lå mellem 0 til 120, med en median på 40 og gennemsnit af 48,12 ± 28,99 (middel ± SD) i overensstemmelse med immunoreaktiviteten af ​​CD34 i vores TMA. Som vist i figur 2C blev THBS2 signifikant korreleret med MVD. Den MVD i THBS2-negative gruppe var meget højere end i THBS2-positive gruppe (P
< 0,001). Men vi kunne ikke observere nogen statistik forskelle mellem MVD og andre clinicopathologic funktioner, herunder klinisk prognose i vores prøver (data ikke vist). Afslutningsvis vores opdagelser viser, at THBS2 omvendt er korreleret med MVD i mavekræft.
THBS2 er signifikant associeret med klinisk prognose mavecancerpatienter
at undersøge forholdet mellem THBS2 udtryk og den kliniske prognose af gastrisk kræftpatienter, vi gennemførte overlevelse analyser af univariate og multivariate Cox 'proportionale farer regressionsmodel. Som vist i tabel 1, fandt vi histologisk kvalitet, dybde af invasion, lymfeknudemetastase og TNM stadie var statistisk signifikante faktorer for OS i univariat analyse. Men da TNM stadie endvidere indeholder oplysninger om dybden af ​​invasion og lymfeknude metastaser, vi yderligere udført multivariate overlevelse analyser med justering for den histologiske kvalitet og TNM stadie. Vi bemærkede, at TNM stadie (P
< 0,001) og THBS2 udtryk (P
< 0,01) var begge uafhængige prognostiske faktorer for vurderingen af ​​patientresultater. Højere TNM etape var en risikofaktor for længere OS [P
< 0,001, HR (hazard ratio) = 7,23, 95% CI 3,55-14,69) og forhøjet udtryk for THBS2 blev endnu en gunstig faktor for længere OS (P
< 0,01, HR = 0,51, 95% CI 0,31 til 0,85). Desuden Kaplan-Meier overlevelsesanalyse yderligere bekræftet, at THBS2 udtryk var signifikant korreleret med kliniske resultater (Figur 3, P < 0,01, n = 129). Patienter med lavere THBS2 udtryk viste en signifikant kortere OS [median 36 måneder, betyder 40,07 ± 3,65 (gennemsnit ± SE) måneder], mens patienter med højere THBS2 udtryk viste en gunstig prognose [median 59 måneder, betyder 53,70 ± 2,95 (gennemsnit ± SE ) måneder]. Sammen vore resultater demonstrerer THBS2 er signifikant associeret med den kliniske prognose af mavecancerpatienter, som kan blive en prognostisk markør for mavekræft. Figur 3 Kaplan-Meier overlevelse analyser med Log-Rank test for samlet overlevelse (OS). Kaplan-Meier analyse af sammenhænge mellem forskellige THBS2 ekspressionsniveauerne og OS i 129 mavecancerpatienter.
Overekspression af THBS2 hæmmer væksten af ​​mavekræft celler in vitro
Fordi THBS2 var signifikant nedreguleret i gastrisk cancer, vi udledes, at THBS2 kan hæmme vækst, fremme apoptose og øge migration evne gastriske cancerceller. For at verificere vores hypotese, vi først bygget en lentiviral vektor til stabile udtrykkelige THBS2 udskrifter i gastrisk cancer cellelinjer. Ændret ekspression af THBS2 i 293 T-celler blev bekræftet ved Western blot-analyse (figur 4A). Derefter valgte vi MKN-45 og SGC-7901 cellelinier for vores in vitro
undersøgelse, fordi mRNA ekspressionsniveauer af THBS2 var lavere end andre (data ikke vist). Vi udførte derefter kolonidannelse assayet at vurdere virkningerne af THBS2 på væksten af ​​MKN-45 og SGC-7901 celler. Som vist i figur 4B, fandt vi celler med THBS2 overekspression dannet signifikant færre kolonier på blød agar sammenlignet med virkningerne af styrevektor-inficerede celler (P
< 0,01 for MKN-45-celler og P
< 0,001 for SGC-7901 celler, henholdsvis). Desuden har vi undersøgt apoptose niveauer mellem de to grupper i begge cellelinier og opdagede, at THBS2 forfremmet apoptose i SGC-7901 celler (Figur 4F), men ikke i MKN-45 celler (Yderligere fil 1: Figur S1A). Og der var ingen signifikante forskelle mellem de to grupper i SGC-7901 og MKN-45 cellelinjer i celle migration i henhold til de transwell assays (Yderligere fil 1: Figur S1B og C). Sammenfattende vores data understøtter, at THBS2 hæmmer væksten af ​​gastriske kræftceller in vitro eventuelt via regulering af apoptose. Figur 4 Overekspression af THBS2 hæmmede udbredelsen af ​​gastrisk kræftceller, undertrykt angiogenese af mavekræft, og fremmes apoptose i SGC-7901-cellelinje in vitro. (A) Western blot analyse af Flag i 293 T celler med THBS2 overekspression. (B) Colony nummer analyse for MKN-45 og SGC-7901 celler med THBS2 overekspression og negativ kontrol. Værdier er middelværdier ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (C) Billeder af kolonidannelse assayet. (D) AngiogenicIndexCh1 analyse af endotelcelle kanaldannelse assay. Værdier er middelværdier ± SD. (E) Billeder af endotelcelle kanaldannelse assay. (F) Analyse af apoptose i MKN-45 cellelinien. Værdier er middelværdier ± SD.
THBS2 undertrykker mavekræft angiogenese in vitro
THBS2 er kendt som en inhibitor af angiogenese [2]. At give beviser for THBS2 regulerer angiogene fænotype af mavekræft, blev endotel celler rør dannelse analyser udført. Som vist i figur 4E og D, i begge MKN-45 og SGC-7901 cellelinier, humane navlevene-endotelceller (HUVEC'er) dyrket med mediet fra THBS2-overekspression gastriske cancerceller viste signifikant lavere AngiogenicIndexCh1 end den negative kontrol (P
< 0,05 for MKN-45 celler og P
< 0,001 for SGC-7901 celler, henholdsvis). Kollektivt vores resultater antyder, at THBS2 undertrykker angiogenese af gastriske cancerceller in vitro
.
Diskussion
THBS2 er kendt som en naturlig potent inhibitor af angiogenese og en modulator af remodeling proces [22, 23]. Ingen af ​​de tidligere undersøgelser diskuterede roller THBS2 og dens kliniske betydning i gastrisk cancer.
Første fandt vi, at mRNA og protein ekspressionsniveauer af THBS2 blev nedreguleret i de fleste prøver. Men en tidligere forskning rapporterede THBS2 mRNA ekspressionsniveauer i mavekræft var højere end normalt kontrol [24]. I betragtning af den begrænsede prøvestørrelse i denne undersøgelse, som inkorporerede kun 6 vævsprøver, er det muligt for denne forskel skyldes tumor heterogenitet for to par vores anden kohorte havde også vise de samme mønstre. Alligevel vores efterfølgende resultat af TMA, større i prøvestørrelse, var i overensstemmelse med resultatet fra den anden kohorte. Taget sammen, vi mente, at THBS2 var mere tilbøjelige til at blive nedreguleret i gastrisk cancercellelinie versus normal slimhinde.
Desuden har vi også bemærket, at den relative ekspression af prøverne udviste forskelligt i mRNA og proteinniveauet. Manglende tilstrækkelige beviser, vi udlede, at funktionen af ​​THBS2 inden gastrisk kræftceller kan reguleres af nogle intracellulære opstrøms signalsystemer faktorer, protein ubiquitinering, og andre mulige måder, der kan påvirke protein niveauer THBS2 og fænotyper i mavens kræftceller. Og kan sættes yderligere fokus på dette interessante fænomen. Alligevel størstedelen af ​​prøverne fra vores anden kohorte viste de samme ekspressionsmønstre mellem mRNA og protein niveauer.
Andet viste vores data, at THBS2 kunne fremme apoptose kun i SGC-7901 celler, men ikke i MKN-45-celler. Tidligere undersøgelser har vist, at et N-terminalt rekombinant fragment af THBS2 kunne aktivere CD36-medieret endotelcelle apoptose [14], og kombinationen af ​​CD36 og THBS2 kunne aktivere caspase signalvejen [25]. Således har vi antaget, at heterogenitet af de to cellelinjer, der anvendes i vores undersøgelse, ligesom differentierede CD36 udtryk, kan dels være årsagen til forskellige niveauer af apoptose induceret af THBS2, som opfordrede til yderligere undersøgelser.
Tredje viste vores resultater at THBS2 kunne undertrykke angiogenese af mavekræft. Det er kendt, at tumor proliferation, invasion, eller metastase er afhængige af angiogenese [26]. Og baserede beviser støtte vores opdagelse og påpege, at de mulige mekanismer, der THBS2 hæmmer angiogenese: 1) en apoptose-uafhængig måde ved at inducere endotelceller apoptose, cellecyklus arrestere og faldende af endotelceller migration [27], 2) afhængig af caspase signalering pathway aktiveret af CD36 [28]. 3) at fungere som co-receptorer for lipoprotein med lav densitet receptor relateret protein (LRP1), der kunne rydde komplekserne ifølge THBS2 med matrixmetalloproteinaser-2, -9 eller vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) fra den pericellulære miljø mesenkymale celler [ ,,,0],29-32].
Endelig MVD er en af ​​de mest almindeligt anvendte parametre til at vurdere graden af ​​tumorangiogenese og tidligere undersøgelser har fundet MVD kunne være en uafhængig prognostisk faktor i gastrisk cancer og andre tumor [33-35]. I vores undersøgelse fandt vi MVD var signifikant korreleret med THBS2 proteinekspression (P
< 0,001) gastrisk kræft, men ikke med de kliniske funktioner og kliniske prognose. Disse resultater viste, at THBS2 kunne påvirke angiogenese i gastrisk kræft, alligevel, på grund af ingen sammenhæng mellem MVD og prognose i vores prøver, vi mistanke om, at højere THBS2 udtryk indikerer længere overlevelse ikke blot var gennem hæmme angiogenese af mavekræft, andre mekanismer som regulerer ECM omformer [23] og spredning på gastriske kræftceller kan også være de grunde, der har behov for yderligere undersøgelser for at udforske.
Kollektivt, vores resultater understreget på de vigtige roller THBS2 i prognostiske betydninger samt tumor spredning og angiogenese i gastrisk kræft. Disse data tyder THBS2 kunne være en vigtig prognostisk markør for gastrisk kræftpatienter. Desuden er baseret på virkningerne af THBS2 på tumor udvikling og angiogenese, vores undersøgelser giver værdifulde fingerpeg til kliniske praksis til at udvikle molekylære hæmmende lægemidler ved hjælp af mål udledt fra den biologiske viden leveres af THBS2 underskrift.
Konklusion
Vores undersøgelse gaver den første linje af beviser, THBS2 udtryk nedreguleret på både mRNA og protein niveauer og faldt THBS2 udtryk er forbundet med de fattige histologiske kvalitet af mavekræft. Afgørende, overekspression af THBS2 har en signifikant sammenhæng med gunstige prognose af gastrisk kræftpatienter. På den anden side, THBS2 påvirket prognose i gastrisk kræft kan ikke kun gennem regulering af angiogenese, men i nogle andre måder, såsom regulering af ECM omformer og inhibering af proliferationen af ​​gastriske cancerceller. Disse resultater antyder, at THBS2 kunne være en potentielt kritisk rolle af i patogenesen og udviklingen af ​​mavekræft. Vi bekræfter, at med de gradvise dybde studier af THBS2, kan det være en lovende nyttig og enkel biomarkør til forudsigelse kliniske resultat for mavecancerpatienter.
Metoder
Patienter og vævsprøver
I nærværende undersøgelse har vi indarbejdet to kohorter af prøver. Den første kohorte indeholdt 129 formalin-fikseret, paraffin-indlejret menneskelig mavekræft og 24 tilfældigt udvalgte normale gastriske væv. De blev konsekutivt rekrutteret fra december 2006 og maj 2008 fra Institut for Almen Kirurgi, The First Affiliated Hospital i Anhui Medical University, Hefei, Kina. Disse prøver blev indarbejdet i TMA for immunhistokemisk farvning. Histologiske funktioner i disse prøver blev bekræftet af patologer. Patologisk TNM mellemstationer blev evalueret i henhold til de 2010 kriterier fra det amerikanske fælles udvalg om kræft (AJCC). Den anden kohorte bestod af 14 gastrisk kræftpatienter, der undergået tumor resektion terapi på ottende Institut for Almen Kirurgi, The First Affiliated Hospital i Anhui Medical University. Den friske gastrisk cancer væv og tilsvarende normal mucosa (mindst 5 cm fjernt fra tumoren kant) blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse af for Kvantitativ realtids-PCR og Western blot-analyse. Patienterne i begge kohorter modtog ikke præoperativ kemoterapi og /eller strålebehandling. Skriftligt informeret samtykke blev leveret af alle deltagere. Alle prøver blev håndteret anonymt i henhold til de etiske standarder. Denne undersøgelse blev udført med godkendelse af Etisk Review Committee af hospitalet.
RNA ekstraktion og kvantitativ real-time PCR
Total RNA blev ekstraheret fra den anden kohorte hjælp Trizol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens protokol. cDNA blev syntetiseret ved tilfældige primere og Superscript II revers transkriptase (Toyobo, Osaka, Japan). Primerne anvendt til amplifikation til THBS2: forward primer 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'og revers primer 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev amplificeret i den samme q-PCR som en intern kontrol under anvendelse af primere: fremadrettet primer 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'og revers primer 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3'. Reaktionen modtog ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA) i nærvær af SYBR-grønt farvestof (Toyobo, Osaka, Japan). Reaktionen betingelse var en denaturering program (95 ° C i 5 minutter), og en forstærkning og kvantificering program i 40 cykler (95 ° C i 15 s og 60 ° C i 45 s). Hver prøve blev testet in triplo, og en smeltekurveanalyse af hver prøve blev anvendt til at kontrollere specificiteten af ​​amplifikation. Ekspressionsniveauet blev bestemt som et forhold mellem THBS2 og det indre GAPDH kontrol i mængden af ​​mRNA beregnet ved sammenlignende CT metode.
Protein ekstraktion og Western blot
totalt protein blev ekstraheret fra 14 frosne mavekræft og dens tilsvarende normale slimhinde væv af is i radio immunopræcipitationsassay Lysis Buffer (RIPA; Beyotime institut for bioteknologi, Jiangsu, Kina), og målt ved hjælp af en BCA protein assay kit (Beyotime institut for bioteknologi, Jiangsu, Kina). Lysatet blev centrifugeret ved 12000 rpm i 5 minutter, og supernatanten blev opvarmet ved 100 ° C i 5 minutter. Derefter ækvivalente proteiner i hvert par prøver blev separeret på 8% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese og elektrooverført til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA). After The blokeret med TBST indeholdende 5% skummetmælk i ved stuetemperatur i en time, blev membranerne blottet med anti-THBS2 antistof (1: 1500; Novus) og anti-Flag (1: 3000; Sigma). Efterfulgt membraner inkubering med peberrodsperoxidase-mærket anti-kanin og anti-muse-IgG som det sekundære antistof (Beyotime Institute of Biotechnology). Anti-GAPDH-antistof (1: 4000; Aogma) blev anvendt som en loading kontrol antistof. De bundne antistoffer blev påvist med forøget kemiluminescens-metoden.
Immunhistokemi og TMA-analyse
mavekræft og normale maveslimhinden prøver blev formalin-fikseret, paraffin-indlejret og blev brugt til at konstruere et væv TMA. H &E-farvede objektglas blev screenet for at identificere optimale intratumoral væv til analyse. 4 um tykke snit blev bagt ved 60 ° C i 1 time, deparaffinised med xylener, og rehydreret i gradueret ethanol til destilleret vand. Antigen genfinding blev opnået med at placere sektionerne med citratpuffer i en ris damper i 30 minutter. At standse endogen peroxidaseaktivitet blev sektionerne behandlet med 3% H 2O 2 i methanol. Derefter anvendte vi 1% bovint serumalbumin for at blokere uspecifik binding. Anti-THBS2 antistof (Novus, 1: 2000) og anti-CD34 (Abcam, 1: 250) blev inkuberet med snittene ved 37 ° C natten over, derefter inkuberet med peberrodsperoxidase-mærket anti-kanin-IgG som det sekundære antistof (Life Technologies). I sidste ende blev der slides placeret på et Autostainer link instrument og fortsætte med farvning. For negative kontroller blev de primære antistoffer erstattet med normalt kaninserum. Den endelige effektive immunhistokemisk farvning blev bedømt ved to uafhængige patologer uden at kende information af patienter ifølge farvningsintensitet og omfanget af farvning. Tissue afsnit blev scoret som procentdelen af ​​farvede cytoplasma i gastrisk cancer kirtel celler og normale kirtel celler (0 point for ingen cellerne farvet, 1 point for < 25%, 2 point for 25-75%, og 3 point for > 75 % af cellerne farvet), og farvningen intensiteten af ​​immunreaktivitet blev bedømt på en skala fra 0 til 3. immunoreaktivitet score (IRS) blev ført ved multiplikation af begge parametre. Prøver blev scoret som følger: negativ (IRS = 0 ~ 2), positive (IRS = 3 ~ 9)
MVD tælle
immunhistokemisk farvning af CD34 og almindeligt anerkendte kriterier udført af Weidner et al.. [36] blev anvendt til MVD tælling. Eventuelle farvede endotelceller eller endotheliale celleklynger blev adskilt fra tilstødende mikrokar, og tykkelsen af ​​hvert fartøj væggen over 2,75 um ville blive udelukket. Tre separate afsnit med hot-spots (hvor det højeste antal diskrete mikrokar blev farvet) i hver prøve af TMA blev valgt i lave forstørrelser (100 ×) under et lysmikroskop (Leica, Tyskland). Efterfølgende blev mikrokar tælles i hvert afsnit i høj forstørrelse (200 ×). P
< Alle forfattere læst og godkendt manuskriptet.

• LNC RNA hotair fungerer som en konkurrerende endogen RNA til at regulere HER2 ekspression ved sponging miR-331-3p i gastrisk kræft
• Proteomisk ændring i gastic adenokarcinomer fra japanske patienter