Giù regolazione della Thrombospondin2 prevede cattiva prognosi nei pazienti con cancer

gastrica Giù regolazione della Thrombospondin2 predice cattiva prognosi nei pazienti con carcinoma gastrico
Abstract
sfondo
Thrombospondins (THBSs) sono una famiglia di multidominio e secreta matricellular Ca 2 + -di legame glicoproteine ​​che ha almeno cinque membri codificati da geni indipendenti. Come un membro della famiglia THBSs, Thrombospondin2 (THBS2) è stata riportata per regolare l'angiogenesi. Tuttavia, le funzioni e significato clinico di THBS2 rimane ancora poco chiaro nel carcinoma gastrico.
Metodi
I livelli di mRNA e di espressione proteica di THBS2 sono stati valutati in 14 accoppiato di campioni di cancro gastrico e corrispondente mucose normali utilizzando quantitativa real-time PCR e l'analisi Western blot. Immunoistochimica di THBS2 e CD34 su microarray di tessuti basati sulla popolazione costituito da 129 casi di cancro gastrico sono stati usati per valutare il significato prognostico della THBS2 e microvasi densità (MVD) di ciascun campione. analisi di sopravvivenza sono state eseguite con il metodo di Kaplan-Meier e proporzionale modello rischi di Cox. saggio Colony formazione, saggio di formazione del tubo di cellule endoteliali, saggio di migrazione delle cellule e l'analisi apoptosi nelle MKN-45 e linee di cellule SGC-7901 sono state effettuate per valutare gli effetti di THBS2 sul cancro gastrico in vitro
.
Risultati
85.71% (12 su 14) dei tessuti di cancro gastrico espresse notevolmente inferiore THBS2 sia mRNA e livelli di proteine ​​rispetto ai corrispondenti controlli normali. Coerentemente, microarray tissutale (TMA) risultati hanno mostrato THBS2 livelli sono stati inibiti nei tessuti cancro gastrico rispetto ai controlli normali. Inoltre, abbiamo osservato che i pazienti con livelli più elevati di THBS2 erano significativamente correlati con la prognosi più favorevole, mentre è diminuito THBS2 espressione sono stati associati con più povere gradi istologici di cancro gastrico. Inoltre, i nostri esperimenti in vitro hanno ulteriormente dimostrato che la sovraespressione di THBS2 potrebbe impedire sia il tasso di proliferazione e la formazione del tubo delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) in linee cellulari MKN-45 e SGC-7901.
Conclusione
La nostra studio suggerisce THBS2 è aberrante espresso in cancro gastrico e svolge un ruolo critico nella progressione del cancro, che può essere un potenziale fattore predittivo prognosi del cancro gastrico.
Parole
THBS2 cancro gastrico angiogenesi prognostico biomarker Introduzione
cancro gastrico è un altamente aggressivo e malignità letale. Un totale di 952.000 nuovi casi di cancro allo stomaco e 723.000 decessi sono stati stimati che si sono verificati nel 2012, pari al 6,8% dei casi totali e 8,8% dei decessi totali. Inoltre, entrambi i nuovi casi e morti di cancro gastrico in Cina, la 1 a livello mondiale, che rappresentano oltre il 40% di quello del mondo [1]. Quindi grandi preoccupazioni sono sollevate per le ricerche di cancro gastrico
. Thrombospondins (THBSs) sono una famiglia di multidominio e matricellular Ca 2 + -di legame glicoproteine ​​secrete da parte dei fibroblasti stromali, cellule endoteliali e cellule del sistema immunitario [2]. Essi hanno almeno cinque membri codificati da geni indipendenti. Legandosi con numerose proteine ​​bersaglio, partecipano in diversi processi biologici come angiogenesi, la motilità cellulare, apoptosi, organizzazione del citoscheletro, e servono come piattaforme interazione nella matrice extracellulare (ECM) [3, 4]. In particolare, THBS1 e THBS2 sono speciali in questa famiglia per il loro tipo I ripete e due di loro sono principalmente indicati come inibitori dell'angiogenesi [5, 6], una parte fondamentale della ricerca sul cancro [7-9]. densità dei microvasi (MVD) è un parametro ampiamente utilizzato per stimare il grado di angiogenesi nei tumori con CD34 essere il creatore dei microvasi nel cancro gastrico [10]. Sulla base dei risultati precedenti [2], abbiamo presentato una ipotesi nel nostro studio che potrebbe anche influenzare l'angiogenesi nel tumore gastrico.
Oltre angiogenesi, THBS2 è stato segnalato per interagire con più recettori delle cellule, fattori di crescita e proteine ​​ECM nonché regolare l'apoptosi, la proliferazione cellulare e l'adesione [11]. In ricerche cancro, crescenti attenzioni si sono concentrate su THBS2. Tokunaga et al. [12] ha rilevato che THBS2 espresso nei pazienti con tumore del colon mostrato un rischio significativamente più basso di metastasi epatiche e vascolarizzazione del tumore rispetto ai pazienti i cui tumori erano carenza THBS2. Inoltre, De Fraipont et al. [13] hanno dimostrato che THBS2 era significativamente correlata con lo stato clinico ed esito, e per la maggior parte dei tumori, c'era una correlazione inversa tra il livello di espressione THBS2 e il loro grado di malignità. Inoltre, THBS2 anche svolto un ruolo chiave nel cancro al seno [14], il mieloma [15], il melanoma maligno [16], il cancro alla prostata [17] e l'adenocarcinoma polmonare [18, 19]. Nel cancro gastrico, altri membri della THBSs, THBS1 [20] e THBS4 [21] potrebbe essere come un marcatore prognostico o di un potente marker per diffusa di tipo adenocarcinoma gastrico. Tuttavia, la funzione dettagliata di THBS2 nel carcinoma gastrico e le sue implicazioni per la diagnosi clinica rimangono ancora triste. Così, abbiamo cercato di svelare il significato clinico di THBS2 e il suo effetto nel cancro gastrico.
Per verificare la nostra ipotesi di cui sopra, abbiamo esaminato i livelli di espressione THBS2 nei tessuti di cancro gastrico umano e corrispondenti tessuti normali e poi esplorato le possibili correlazioni tra la espressione di THBS2 e le caratteristiche clinico-patologici, la prognosi clinica e il conteggio MVD nei pazienti con cancro gastrico. Inoltre, dosaggio colonia formazione, dosaggio formazione del tubo di cellule endoteliali, dosaggio migrazione cellulare e analisi apoptosi sono stati effettuati in MKN-45 e linee cellulari SGC-7901 per esplorare la vitro
effetto di THBS2 nelle cellule di cancro gastrico.
Risultati
caratteristiche del paziente e gli esiti clinici
Nel presente studio, abbiamo arruolato 129 pazienti eleggibili, che consisteva di 101 maschi e 28 femmine. L'età dei pazienti variava da 29 a 80 anni (y) con un'età media di 61y. Tutte le caratteristiche clinico-patologici sono riassunte nella tabella 1. La sopravvivenza mediana globale (OS) dei pazienti era di 57 mesi, e la media del sistema operativo era 44.01 [95% intervallo di confidenza (CI) 39.78-49.24 mesi] .table 1 associazione tra le variabili clinico-patologiche e THBS2 espressione e la sopravvivenza globale del cancro gastrico pazienti
variabili
negativo positivo

Numero totale
P valoreA
Nel complesso la sopravvivenza OS
log-rank Pb
HR (95% CI)
No. (%)
No. (%)
Age (y )
0,112 0,743

< 61
24 (38,1)
39 (61,9)
63
1 (di riferimento)
≥61
35 ( 53.0)
31 (47,0)
66
1,09 (0,67-1,77)
genere
0,831 0,405

Maschio
47 (46,5)
54 ( 53.5)
101
1 (di riferimento)
femminile
12 (42,9)
16 (57,1)
28
0,76 (0,40-1,45)
grado istologico
0,005 0,011

Bene e moderato
24 (33,8)
47 (66,2)
71
1 (di riferimento)
Poveri e altri
35 (60.3 )
23 (39,7)
58
1.89 (1,16-3,09)
localizzazione del tumore
0,419 0,204

Alto
27 (40,3)
40 ( 59,7)
67
1 (di riferimento)
Medio
15 (53,6)
13 (46,4)
28
1,66 (0,86-3,18)
inferiore
17 (50.0)
17 (50.0)
34
1,90 (0,90-4,01)
profondità dell'invasione
0,271 0,001

T1-T2
9 ( 34.6)
17 (65,4)
26
1 (di riferimento)
T3-T4
50 (48,5)
53 (51,5)
103
11.60 (2.83 -47,45)
metastasi linfonodali
0,454
< 0,001
Assente
17 (40,5)
25 (59,5)
42
1 (di riferimento)
presente
42 (48,3)
45 (51,7)
87
5,16 (2,46-10,84)
TNM fase
0,283
< 0,001
I-II
21 (39,6)
32 (60,4)
53
1 (di riferimento)
III-IV
38 (50.0)
38 (50.0)
76
7.14 (3,52-14,49)
valore Bold è statisticamente significativa a P
< 0.05, rischio HR rapporto. Impara una, P
valore delle variabili clinico-patologiche e THBS2 espressione.
B, P
valore di associazione tra variabili clinico-patologiche e la sopravvivenza complessiva dei pazienti affetti da cancro gastrico.
THBS2 è down-regolato in cancro gastrico
al fine di determinare i livelli di espressione di THBS2 a cancro gastrico, in primo luogo abbiamo valutato i livelli di espressione di mRNA di THBS2
nel cancro gastrico quantitativa in tempo reale nella seconda coorte. Questa coorte di campioni, di cui metodi, inclusi 14 cancro gastrico umano e dei tessuti normali corrispondenti. Come mostrato in figura 1A, THBS2
livelli erano nettamente inferiore a 85,7% (12 su 14) dei tessuti di cancro gastrico rispetto ai suoi controlli normali, mentre i rimanenti due coppie di campioni mostravano il contrario. Poi, abbiamo rilevato i livelli di espressione della proteina di THBS2 tramite Western Blot nella stessa coorte. Come esposizione Figure1B e C, abbiamo osservato che i livelli di espressione della proteina THBS2 sono diminuiti a 85,7% (12 su 14) dei campioni di tumore rispetto al suo controllo corrispondente, mentre campione di 5 e 11 rappresentate in modo inverso. A conferma di questo dato, abbiamo eseguito ulteriormente un tessuto microarray (TMA) e ha valutato i livelli di espressione della proteina di THBS2 secondo il punteggio immunoreattività (IRS) di ciascun campione. Abbiamo trovato THBS2 proteine ​​sono state espresse principalmente nei citoplasma di cellule gastriche (Figura 2A), e in conformità con i risultati del western blot, i livelli di THBS2 erano significativamente inibito nei tessuti cancro gastrico rispetto ai controlli normali (Figura 2B, P <0,05). Nel loro insieme, i nostri risultati dimostrano che THBS2 è down-regolato nel carcinoma gastrico sia in mRNA e livelli di proteine. Figura 1 mRNA e proteine ​​livello di espressione di THBS2 in 14 tessuti cancro gastrico e il corrispondente tessuto normale. (A) espressione di mRNA relativa di THBS2 è stato rilevato dal quantitativa real-time PCR. Espressione dei tessuti normali sono stati normalizzati a 1,0 come indicato. risultati di analisi (B) La densitometria delle bande THBS2 sono stati normalizzati per GAPDH utilizza Immagine J. Espressione dei tessuti normali sono stati normalizzati a 1,0 come indicato. (C) l'espressione della proteina relativa di THBS2 è stato stimato da test Western Blot.
Figura 2 L'analisi immunoistochimica di THBS2, CD34. (A) Immagini rappresentative della THBS2 ed espressione CD34: N1, N2, N3, N4, tessuto gastrico normale (N); M1, M2, M3, M4, moderatamente differenziato (M); P1, P2, P3, P4, scarsamente differenziato (P). Ingrandimento: 100 × (N1, M1, P1, N3, M3, P3), 200 × (N4, M4, P4) e 400 × (N2, M2, P2). (B) Confronto di THBS2 espressione di cancro gastrico (n = 129) e nei tessuti gastrici normali (n = 24) in TMA. Il livello di espressione THBS2 presentati come media ± SEM. (C) Confronto di MVD nel gruppo cancro gastrico THBS2-positivi gruppo cancro gastrico (n = 70) e THBS2-negativi (n = 59). Punti rappresentano MVD di ogni campione. I valori sono media ± SEM. Livelli di espressione
THBS2 sono inversamente correlati con gradi istologici di cancro gastrico
Per chiarire ulteriormente l'importanza clinica di THBS2, abbiamo analizzato la relazione tra espressione della proteina THBS2 e caratteristiche cliniche tra cui l'età, il sesso, istologico grado, localizzazione del tumore, profondità di invasione, metastasi linfonodali e TNM fase di pazienti affetti da cancro gastrico in gruppi THBS2-positivi e negativi. Come indicato nella tabella 1, abbiamo trovato una significativa correlazione inversa con i gradi istologici di cancro gastrico (P
< 0,01). I gradi istologici di pazienti nel gruppo THBS2-positivo avevano una maggiore probabilità di essere bene e moderata, mentre i pazienti nel gruppo THBS2-negativi tendevano ad essere povero e altri. Tuttavia, non siamo riusciti a scoprire un significato statistico tra i livelli di espressione di THBS2 e di altri parametri clinici. Collettivamente, i nostri risultati suggeriscono che THBS2 è inversamente correlata con il grado istologico del tumore gastrico. Livelli di espressione
THBS2 sono inversamente correlati con MVD nel carcinoma gastrico
rapporti precedenti THBS2 implicita potrebbe regolare l'angiogenesi tumorale [6], ma nessuno è stato segnalato nel cancro gastrico. Quindi, abbiamo chiesto se ci fossero eventuali correlazioni tra MVD e livelli di espressione THBS2 così come altri parametri clinici nei nostri campioni clinici. Il MVD in 129 campioni di cancro gastrico variava da 0 a 120, con la mediana di 40 e media di 48.12 ± 28.99 (media ± SD) secondo l'immunoreattività di CD34 nella nostra TMA. Come mostrato nella Figura 2C, THBS2 era significativamente correlata con MVD. Il MVD in gruppo THBS2-negativo è stato molto superiore a quello in THBS2-positivi gruppo (P
< 0,001). Tuttavia, non abbiamo potuto osservare eventuali differenze statistiche tra MVD e altre caratteristiche clinico-patologiche, tra cui la prognosi clinica nei nostri campioni (dati non riportati). In conclusione, le nostre scoperte dimostrano che THBS2 è inversamente correlata con MVD nel carcinoma gastrico.
THBS2 è significativamente associato con la prognosi clinica dei pazienti affetti da cancro gastrico
Per esaminare la relazione tra espressione THBS2 e la prognosi clinica dei pazienti di cancro gastrico, abbiamo condotto la sopravvivenza analizza per modello pericoli di regressione proporzionale univariata e multivariata di Cox. Come indicato nella tabella 1, abbiamo trovato grado istologico, profondità di invasione, metastasi linfonodali e lo stadio TNM sono stati fattori statisticamente significativi per OS nell'analisi univariata. Tuttavia, dato che stadio TNM contiene anche le informazioni di profondità di invasione e metastasi linfonodali, abbiamo ulteriormente effettuato sopravvivenza multivariata con regolazione per il grado istologico e stadio TNM. Abbiamo notato che TNM fase (P
< 0,001) e l'espressione THBS2 (P
< 0,01) sono stati entrambi i fattori prognostici indipendenti per la valutazione dei risultati del paziente. Superiore stadio TNM è stato un fattore di rischio per più OS [P
< 0,001, HR (hazard ratio) = 7.23, 95% CI 3,55-14,69) ed elevata espressione di THBS2 era ancora un fattore favorevole per l'OS più lungo (P
< 0,01, HR = 0.51, 95% CI ,31-,85). Inoltre, l'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier ha inoltre confermato che l'espressione THBS2 è risultata significativamente correlata con gli esiti clinici (figura 3, P < 0,01, n = 129). I pazienti con espressione inferiore THBS2 visualizzati un sistema operativo significativamente più breve [mediana di 36 mesi, media 40.07 ± 3.65 (media ± SE) mesi], mentre i pazienti con espressione più alta THBS2 hanno mostrato una prognosi favorevole [mediana 59 mesi, media 53,70 ± 2,95 (media ± SE ) mesi]. Insieme, i nostri risultati dimostrano THBS2 è significativamente associato con la prognosi clinica dei malati di cancro gastrico, che potrebbe diventare un marcatore prognostico del tumore gastrico. Figura 3 Kaplan-Meier di sopravvivenza analizza con log-rank test per la sopravvivenza globale (OS). analisi di Kaplan-Meier delle correlazioni tra i diversi livelli di espressione THBS2 e OS in 129 pazienti affetti da cancro gastrico
. sovraespressione di THBS2 inibisce la crescita di cellule di cancro gastrico in vitro
Perché THBS2 era significativamente down-regolato in gastrica il cancro, abbiamo dedotto che THBS2 potrebbe inibire la crescita, promuovere l'apoptosi e migliorare la capacità di migrazione delle cellule di cancro gastrico. Per verificare la nostra ipotesi, in primo luogo abbiamo costruito un vettore lentivirale a stabile trascrizioni THBS2 espressi in linee cellulari di cancro gastrico. alterata espressione di THBS2 in 293 cellule T è stata confermata da analisi Western Blot (Figura 4A). Poi, abbiamo scelto MKN-45 e SGC-7901 linee cellulari per la nostra vitro
studio perché i livelli di espressione di mRNA di THBS2 erano più bassi rispetto ad altri (dati non riportati). Abbiamo quindi effettuato il test formazione di colonie di valutare gli effetti del THBS2 sulla crescita di MKN-45 e le cellule SGC-7901. Come mostrato in Figura 4B, abbiamo trovato cellule con THBS2 sovraespressione formata significativamente minor numero di colonie su agar morbido rispetto a quelle delle cellule infettate da vettori di controllo (P
< 0,01 per MKN-45 cellule e P
< 0,001 per cellule SGC-7901, rispettivamente). Inoltre, abbiamo esaminato i livelli di apoptosi tra i due gruppi in entrambe le linee cellulari e abbiamo scoperto che THBS2 promosso apoptosi nelle cellule SGC-7901 (Figura 4F), ma non in MKN-45 cellule (sui file 1: Figura S1A). E non vi erano differenze significative tra i due gruppi in SGC-7901 e le linee di cellule MKN-45 nella migrazione cellulare secondo i saggi transwell (sui file 1: Figura S1B e C). In sintesi, i nostri dati supportano che THBS2 impedisce la crescita delle cellule di cancro gastrico in vitro possibilmente attraverso la regolazione dell'apoptosi. Figura 4 sovraespressione di THBS2 ha inibito la proliferazione delle cellule di cancro gastrico, soppresso l'angiogenesi del cancro gastrico, e promosso apoptosi nelle linee cellulari SGC-7901 in vitro. (A) Analisi Western Blot di bandiera in 293 T cellule con THBS2 sovraespressione. (B) Analisi numero Colony per MKN-45 e le cellule SGC-7901 con THBS2 sovraespressione e il controllo negativo. I valori sono medie ± SD di tre esperimenti indipendenti. (C) Immagini di test formazione di colonie. (D) Analisi AngiogenicIndexCh1 di dosaggio formazione del tubo delle cellule endoteliali. I valori sono medie ± SD. (E) Immagini di test formazione del tubo delle cellule endoteliali. (F) Analisi di apoptosi nelle cellule MKN-45. I valori sono medie ± SD.
THBS2 sopprime cancro gastrico angiogenesi in vitro
THBS2 è conosciuto come un inibitore dell'angiogenesi [2]. Per fornire prove della THBS2 regola il fenotipo angiogenico del cancro gastrico, saggi di formazione del tubo delle cellule endoteliali sono state effettuate. Come mostrato in figura 4E e D, in entrambe le linee cellulari MKN-45 e SGC-7901, vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) coltivate con il mezzo da cellule di cancro gastrico THBS2-iperespressione mostrato AngiogenicIndexCh1 significativamente inferiori rispetto al controllo negativo (P
< 0,05 per MKN-45 cellule e P
< 0,001 per le cellule SGC-7901, rispettivamente). Collettivamente, i nostri risultati implicano che THBS2 sopprime l'angiogenesi delle cellule di cancro gastrico in vitro
.
Discussione
THBS2 è conosciuto come un naturale potente inibitore dell'angiogenesi e un modulatore del processo di rimodellamento [22, 23]. Tuttavia, nessuna delle precedenti ricerche discussi i ruoli di THBS2 e il suo significato clinico nel carcinoma gastrico.
In primo luogo, abbiamo scoperto che mRNA e di espressione proteica livelli di THBS2 sono stati down-regolati nella maggior parte dei campioni. Tuttavia, una ricerca precedente ha registrato livelli di espressione di mRNA THBS2 a cancro gastrico erano superiori normale controllo [24]. Considerando le dimensioni limitate del campione in questo studio, che ha ripreso solo 6 campioni di tessuto, è possibile che questa differenza a causa della eterogeneità del tumore per due coppie di nostra seconda coorte ha mostrato anche gli stessi modelli. Eppure nostra successiva risultato di TMA, di dimensioni del campione, era coerente con il risultato dalla seconda coorte. Nel loro insieme, abbiamo creduto che THBS2 era più probabilità di essere giù regolato in cella di cancro gastrico rispetto mucosa normale.
Inoltre, abbiamo anche notato che l'espressione relativa dei campioni esposti in modo diverso in mRNA e il livello di proteine. In mancanza di prove sufficienti, si deduce che la funzione di THBS2 all'interno di cellule di cancro gastrico può essere regolata da alcuni fattori intracellulari a monte di segnalazione, ubiquitinazione di proteine, e altri modi possibili, che possono influenzare i livelli di proteina di THBS2 e fenotipi di cellule di cancro gastrico. E inoltre l'accento può essere messo su questo interessante fenomeno. Tuttavia, la maggior parte dei campioni dalla nostra seconda coorte visualizzato gli stessi pattern di espressione tra mRNA e livelli di proteine.
In secondo luogo, i nostri dati hanno mostrato che THBS2 potrebbe promuovere l'apoptosi solo in SGC-7901 cellule ma non in MKN-45 cellule. Ex ricerche hanno dimostrato che un frammento ricombinante N-terminale del THBS2 potrebbe attivare CD36-mediata apoptosi delle cellule endoteliali [14], e la combinazione di CD36 e THBS2 potrebbe attivare il percorso di segnalazione caspasi [25]. Così, abbiamo ipotizzato che l'eterogeneità delle due linee di cellule utilizzate nel nostro studio, come le espressioni CD36 differenziati, potrebbe in parte essere la ragione dei diversi livelli di apoptosi indotta da THBS2, che ha chiesto ulteriori indagini.
In terzo luogo, i nostri risultati hanno mostrato che THBS2 potrebbe sopprimere l'angiogenesi del cancro gastrico. È noto che la proliferazione del tumore, l'invasione, o di metastasi dipendono angiogenesi [26]. E evidenze basate supportano la nostra scoperta e sottolineano che i possibili meccanismi che THBS2 inibisce l'angiogenesi: 1) un modo apoptosi indipendente inducendo endoteliali apoptosi cellulare, ciclo cellulare arrestando e la diminuzione della migrazione delle cellule endoteliali [27], 2) dipendente dalla segnalazione caspasi percorso attivato da CD36 [28]. 3) funzionare come co-recettori per la proteina recettore a bassa densità di lipoproteine ​​correlati (LRP1), che potrebbe cancellare i complessi di THBS2 con matrice metalloproteinasi-2, -9 o fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) dall'ambiente pericellulare di cellule mesenchimali [ ,,,0],29-32].
Infine, MVD è uno dei parametri più comunemente utilizzati per valutare il grado di angiogenesi tumorale e studi precedenti hanno trovato MVD potrebbe essere un fattore prognostico indipendente nel carcinoma gastrico e altri tumori [33-35]. Nel nostro studio, abbiamo riscontrato MVD è risultata significativamente correlata con l'espressione della proteina THBS2 (P
< 0,001) nel carcinoma gastrico, ma non con caratteristiche cliniche e la prognosi clinica. Questi risultati hanno dimostrato che THBS2 potrebbero influenzare l'angiogenesi nel carcinoma gastrico, tuttavia, a causa della correlazione tra MVD e la prognosi nei nostri campioni, abbiamo il sospetto che più alta espressione THBS2 indicando sopravvivenza più lunga non era semplicemente attraverso inibendo l'angiogenesi del cancro gastrico, altri meccanismi, come la regolazione ECM remoulding [23] e la proliferazione tasso di cellule di cancro gastrico potrebbe anche essere le ragioni che hanno bisogno di ulteriori ricerche per esplorare.
Collettivamente, i nostri risultati hanno sottolineato i ruoli importanti di THBS2 a significati prognostici e proliferazione del tumore e l'angiogenesi in gastrica cancro. Questi dati suggeriscono THBS2 potrebbe essere un importante indicatore prognostico per i malati di cancro gastrico. Inoltre, sulla base degli effetti della THBS2 sullo sviluppo del tumore e l'angiogenesi, le nostre ricerche forniscono indizi preziosi per le pratiche cliniche per lo sviluppo di terapie molecolari inibizione in base a obiettivi dedotte dalla conoscenza biologica fornita dalla firma THBS2.
Conclusione
i nostri regali di studio la prima linea di evidenze che l'espressione THBS2 è down-regolato, sia a livello di mRNA che di proteine ​​e una diminuzione THBS2 espressione è associata con i poveri grado istologico di cancro gastrico. Fondamentalmente, la sovraespressione di THBS2 ha una correlazione significativa con prognosi favorevole dei pazienti affetti da cancro gastrico. D'altra parte, THBS2 influenzato la prognosi nel cancro gastrico può non solo attraverso la regolazione dell'angiogenesi, ma in altri modi, come regolazione ECM rimodellamento e inibendo la proliferazione delle cellule di cancro gastrico. Questi risultati suggeriscono che THBS2 potrebbe essere un ruolo potenzialmente critico nella patogenesi e nella progressione del cancro gastrico. Confermiamo che, con gli studi di profondità graduale di THBS2, può essere un biomarker utile e semplice promettente per prevedere l'esito clinico per i pazienti affetti da cancro gastrico.
Metodi
Pazienti e campioni di tessuto
Nel presente studio, abbiamo incorporato due coorti di esemplari. La prima coorte conteneva 129 fissati in formalina, inclusi in paraffina cancro gastrico umano e 24 tessuti gastrici normali scelti a caso. Sono stati reclutati consecutivamente tra dicembre 2006 e maggio 2008 dal Dipartimento di Chirurgia Generale, il Primo Ospedale Affiliato di Anhui Medical University, Hefei, in Cina. Questi campioni sono stati incorporati nella TMA per la colorazione immunoistochimica. caratteristiche istologiche di questi campioni sono stati confermati dai patologi. Patologica stadiazione TNM è stata valutata in base ai criteri di 2010 di The Joint Committee on Cancer (AJCC). La seconda coorte era composta da 14 pazienti affetti da cancro gastrico che sottoposti a terapia di resezione del tumore presso il Dipartimento di Chirurgia Generale Ottavo, il Primo Ospedale Affiliato di Anhui Medical University. Il fresco gastrico tessuto tumorale e corrispondente mucosa normale (almeno 5 cm di distanza dal bordo del tumore) sono stati immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino utilizzando for Quantitative real-time PCR ed analisi Western blot. I pazienti in entrambe le coorti non hanno ricevuto chemioterapia e /o radioterapia preoperatoria. consenso informato scritto è stato fornito da tutti i partecipanti. Tutti i campioni sono stati trattati in forma anonima secondo gli standard etici. Questo studio è stato condotto con l'approvazione del Comitato Etico dell'ospedale Review.
Estrazione di RNA e quantitativa real-time PCR
RNA totale è stato estratto dalla seconda coorte utilizzando Trizol reagente (Invitrogen) secondo il protocollo del produttore. cDNA è stato sintetizzato da primer casuali e Superscript II trascrittasi inversa (Toyobo, Osaka, Giappone). I primer utilizzati per l'amplificazione per THBS2: forward primer 5'-CGTGGACAATGACCTTGTTG-3 'e reverse innesco 5'-GCCATCGTTGTCATCATCAG-3'. Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stato amplificato nella stessa q-PCR come controllo interno utilizzando primer: primer forward 5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3 'e di primer 5'-GCCCAATACGACCAAATCC-3 retro'. La reazione correva sul 7900HT Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems, CA, USA) in presenza di colorante SYBR-Green (Toyobo, Osaka, Giappone). La condizione di reazione era un programma denaturazione (95 ° C per 5 min), e un programma di amplificazione e quantificazione per 40 cicli (95 ° C per 15 s e 60 ° C per 45 s). Ogni campione è stato testato in triplicato, e l'analisi della curva di fusione di ogni campione è stato utilizzato per verificare la specificità dell'amplificazione. Il livello di espressione è stato determinato come rapporto tra THBS2 e GAPDH controllo interno delle quantità di mRNA calcolati con il metodo CT comparativo. Estrazione
proteine ​​e Western Blot
proteine ​​totali sono stati estratti da 14 cancro gastrico congelato e il suo corrispondente normale tessuti della mucosa dal ghiaccio nel saggio della radio immunoprecipitazione Lysis Buffer (RIPA; Beyotime istituto di Biotecnologie, Jiangsu, Cina), e misurata utilizzando un kit di analisi delle proteine ​​BCA (Beyotime istituto di Biotecnologie, Jiangsu, Cina). Il lisato è stato centrifugato a 12000 rpm per 5 minuti, e il supernatante è stato riscaldato a 100 ° C per 5 minuti. Poi proteine ​​equivalenti di ciascuna coppia campioni sono stati separati su 8% di sodio dodecil solfato gel di poliacrilamide e elettrotrasferite membrane polivinilidene fluoruro (Millipore, Billerica, MA). Dopo La bloccato con TBST contenente 5% di latte scremato in a temperatura ambiente per un'ora, le membrane sono state asciugate con anticorpo anti-THBS2 (1: 1500; Novus) e anti-Flag (1: 3000; Sigma). Seguito membrane incubazione con perossidasi di rafano marcato anti-coniglio e anti-IgG di topo, come l'anticorpo secondario (Beyotime Institute of Biotechnology). Anti-GAPDH anticorpi (1: 4000; Aogma) è stato utilizzato come anticorpo di controllo di carico. Gli anticorpi legati sono stati rilevati con il metodo chemiluminescenza potenziata.
Immunoistochimica e TMA analisi
cancro gastrico e normali campioni di mucosa gastrica sono stati fissati in formalina, inclusi in paraffina e sono stati utilizzati per la costruzione di un tessuto TMA. H & vetrini colorati con EE sono stati sottoposti a screening per identificare il tessuto intratumorale ottimale per l'analisi. 4-micron sezioni spesse sono stati cotti a 60 ° C per 1 ora, deparaffinised con xileni e reidratate in etanolo graduata di acqua distillata. Antigen recupero è stato ottenuto con l'immissione sezioni con tampone citrato in un vapore riso per 30 minuti. Per placare l'attività della perossidasi endogena, le sezioni sono state trattate con il 3% H 2O 2 in metanolo. Poi abbiamo usato 1% di albumina sierica bovina per bloccare il legame non specifico. L'anticorpo anti-THBS2 (Novus, 1: 2000) e anti-CD34 (Abcam, 1: 250) sono stati incubati con le sezioni a 37 ° C per una notte, poi incubate con rafano perossidasi IgG anti-coniglio come l'anticorpo secondario (Vita Technologies). Alla fine, i vetrini sono stati posti su uno strumento collegamento Autostainer e procedere con colorazione. Per i controlli negativi, gli anticorpi primari sono stati sostituiti con siero di coniglio normale. La colorazione immunoistochimica efficace finale è stata valutata da due patologi indipendenti senza conoscere le informazioni dei pazienti secondo l'intensità di colorazione e la portata della colorazione. sezione di tessuto è stato segnato come la percentuale di citoplasma colorato in cellule della ghiandola cancro gastrico e normali cellule della ghiandola (0 punti per non cellule colorate, 1 punto per < 25%, 2 punti per 25-75%, e 3 punti per > 75 % di cellule colorate), e l'intensità di colorazione di immunoreattività è stata classificata su una scala da 0 a 3. il punteggio immunoreattività (IRS) è stato derivato dalla moltiplicazione di entrambi i parametri. I campioni sono stati segnati come segue: negativo (IRS = 0 ~ 2), positivo (IRS = 3 ~ 9)
MVD conteggio
colorazione immunoistochimica di CD34 e criteri generalmente accettati eseguite da Weidner et al.. [36] sono stati utilizzati per il conteggio MVD. Eventuali cellule endoteliali macchiate o cluster di cellule endoteliali sono state separate da microrecipienti adiacenti, e lo spessore di ogni parete del vaso oltre 2,75 micron sarebbero esclusi. Tre sezioni separate contenenti hot-spot (dove era macchiato il maggior numero di microvasi discreti) in ciascun campione di TMA sono stati scelti in ingrandimenti bassi (100 ×) sotto un microscopio ottico (Leica, Germania). Successivamente, microvasi sono stati contati in ogni sezione in alto ingrandimento (200 ×). P
< Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto.

• funzioni LNC RNA Hotair come un RNA endogene competizione per regolare l'espressione di HER2 con spugnature miR-331-3p nel cancro gastrico
• alterazione proteomica in adenocarcinomi gastic da pazienti giapponesi