BRCAA1 monoklonal antikropp konjugerad fluorescerande magnetiska nanopartiklar för in vivo riktad magnetofluorescent avbildning av gastric cancer

BRCAA1 monoklonal antikropp konjugerad fluorescerande magnetiska nanopartiklar för in vivo
riktade magnetofluorescent avbildning av magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Gastric cancer är 2: a vanligaste cancerformen i Kina, och är fortfarande den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen. Hur man känner igen tidiga gastric cancerceller är fortfarande en stor utmaning för tidig diagnos och behandling av patienter med magsäckscancer. Denna studie syftar till att utveckla en typ av multifunktionella nanoprobes för in vivo
riktade magnetofluorescent avbildning av magcancer.
Metoder
BRCAA1 monoklonal antikropp framställdes, användes som första antikropp för att färga 50 par av exemplar av gastrisk cancer och styra normala gastriska mukösa vävnader, och konjugerade med fluorescerande magnetiska nanopartiklar med 50 nm i diameter, var de resulterande BRCAA1-konjugerad fluorescerande magnetiska nanoprobes kännetecknas av transmissionselektronmikroskopi och fotoluminiscens spektrometri, var såsom förberedda nanoprobes inkuberades med magcancer MGC803 celler, och injicerades i möss modell laddad med magcancer av 5 mm i diameter via svansvenen, och därefter avbildades genom fluorescens optisk avbildning och magnetisk resonanstomografi, var deras biofördelning undersöktes. Vävnads skivor observerades genom fluorescensmikroskopi, och de viktiga organ som hjärta, lungor, njurar, hjärna och lever analyserades med hematoxylin och eosin (HE) fläckmetoden.
Resultat
BRCAA1 monoklonal antikropp framställdes framgångsrikt, BRCAA1 protein uppvisade överexpression i 64% gastriska cancervävnader, ingen expression i kontroll normala gastriska mukösa vävnader föreligger statistisk skillnad mellan två grupper (P
< 0,01). Den BRCAA1-konjugerade fluorescerande magnet nanoprobes uppvisar mycket låg toxicitet, lägre magnetisk intensitet och lägre fluorescensintensitet med topp-blue-shift än rena FMNPs, kan endocytoseras av magcancer MGC803 celler, kan rikta in vivo
ventrikelcancer vävnader laddade av möss, och skulle kunna användas för att avbilda magsäckscancer vävnader genom fluorescerande avbildning och magnetisk resonanstomografi, och i huvudsak fördelat lokala magsäckscancer vävnader inom 12 timmar efter injektion. HAN fläckar analys visade att inga uppenbara skador observerades i viktiga organ.
Slutsatser sälja The högpresterande BRCAA1 monoklonala antikropps konjugerade fluorescerande magnetiska nanopartiklar kan rikta in vivo
gastric cancerceller, kan användas för samtidig magnetofluorescent avbildning, och kan ha en stor potential i tillämpningar såsom dubbla modell avbildning och lokal termisk behandling av magcancer tidig inom en snar framtid.
bakgrund
gastric cancer var en gång den näst vanligaste cancerformen hos ordet [1]. Hittills, i USA, är magen malignitet närvarande den 14: e vanligaste cancerformen, och 2: a vanligaste cancerformen i Kina [2, 3]. Gastric cancer är fortfarande den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen, och är fortfarande svårt att bota eftersom de flesta patienter närvarande med avancerad sjukdom. Därför hur man känner igen, spår eller döda tidiga gastric cancerceller är mycket nyckeln till tidig diagnos och behandling av patienter med magsäckscancer.
Hittills, efter biomarkörer närstående magcancer är fortfarande en viktig uppgift. Sedan 1998 har vi varit prövas för att etablera en tidig gastric systemet cancer pre-varning [4], och hoppas kunna använda denna förvarningssystem för att upptäcka tidiga gastric cancerceller att känna igen patienter med magcancer tidigt. Även om vissa annorlunda uttryckta gener associerade med magcancer tidig identifierades [5, 6], kan ingen gen bekräftas att vara specifik biomarkör för magcancer. Därför, för att känna igen tidiga gastric cancerceller, bara vi väljer potentiella biomarkörer i samband med magcancer, och kombinera nanopartiklar och molekylära avbildningstekniker, försöka hitta in vivo
tidiga gastric cancerceller från in vivo
tumör riktad avbildning . I vårt tidigare arbete, vi screened ut och klonades BRCAA1 genen (bröstcancer associerad antigen 1-genen) från bröstcancercellinje MCF-7cells [AF208045, även kallad ARID4B (AT-rik interaktiv domän-innehållande protein 4B)], och identifierat sin antigen-epitop-peptid SSKKQKRSHK [7, 8]. Vi förberedde också BRCAA1 polyklonala antikroppar, och konstaterade att BRCAA1 proteinet uppvisade överuttryck i nästan 65% kliniska prover av magcancer vävnader [9-11]. Vi observerade också att BRCAA1 antigen är överuttryckt i magcancer cellinjer såsom MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO-III och MGC803 celler. Vi därför förutspår att BRCAA1 protein kan vara en potentiell målsökande molekyl för in vivo
gastriska cancerceller.
Under de senaste åren, har molekylavbildningstekniker baserade på multifunktionella nanoprobes gjort stora framsteg. Till exempel, har nanopartiklar såsom kvantprickar, magnetiska nanopartiklar och guld nanostavar, etc. använts för molecular imaging [12-19]. Hittills flera små djur avbildningstekniker har utvecklats såsom optisk avbildning (OI) av bioluminiscens (BLI), fluorescens (FLI) och intravital mikroskopi (IVM), mikro-PET, MRI och CT [20-26]. Bland alla dessa tekniker, hur man kan förbättra sin rumsliga upplösningen och vävnadsdjup känslighet är en stor utmaning. Hittills in vivo
tumörvävnader med över 1 cm i diameter kan lätt identifieras genom CT, MR, PET och mareld imaging, är mycket svårt att finna i kliniska patienter tumörer med mindre än eller lika med 5 mm i diameter. I våra tidigare rapporter har fotosensibiliserande-konjugerade magnetiska nanopartiklar framgångsrikt använts för in vivo
samtidig magnetofluorescent avbildning och inriktning terapi [27]. Emellertid var den målsökande förmågan hos nanoprobes mycket beroende av magnetiska nanopartiklar. Vi förberedde också en multifunktionell Ribonuclease-A-konjugerad CdTe quantum dot kluster nanosystem för synkron cancer imaging och terapi [28], är den målsökande förmåga som förberedda nanoprobes beroende RGD-peptid. Vissa studier visar att HER-2-protein uppvisar onormalt uttryck i 6-35% gastric cancervävnader [29, 30], och har använts som terapeutiskt mål för kliniska patienter med magcancer [31], därför äger HER-2-protein stor potential i avbildning och terapi av magcancer. Fram till dags dato visar ingen rapport som riktade avbildning och terapi av vivo
magcancer i är baserad på biomarkörer i samband med magcancer.
Under de senaste åren, vi kontrollerbart beredd kiselbelagda kvantprickar och superparamagnetiska nanopartiklar kompositer (FMNPs) med starka fluorescerande signaler och utmärkta magnetiska egenskaper, och har använt dem för bio-märkning, spårning stamceller, bio-separation, inriktning bildbehandling och hypertermi av tumörer [29-32], konstaterade vi också att så förberedda nanopartiklar äger god biokompatibilitet och stabilitet [33-38].
I denna uppsats använder vi till fullo fördelarna med FMNPs och BRCAA1 antigen, beredda monoklonal antikropp mot BRCAA1 protein och beredda BRCAA1 monoklonala antikropps konjugerade fluorescerande magnetiska nanoprobes (BRCAA1- FMNPs), anställd nakna möss modell laddad med magcancer av 5 mm i diameter och IVIS bildsystem och magnetisk resonanstomografi, undersökte möjligheten att så förberedda nanoprobes för icke-invasiv in vivo
riktade dubbla modal avbildning av magcancer. Resultaten visar att förberedda nanoprobes kan användas för in vivo
dubbla modell avbildning av magcancer, och kan ha en stor potential i tillämpningar såsom dubbla modell avbildning och lokal termisk behandling av magcancer tidig inom en snar framtid.
Resultat och Diskussion
Karaktärisering av anti-BRCAA1 monoklonal antikropp
Såsom visas i tabell 1, vi framgångsrikt erhölls två positiva klonen cellinjer S-200-5 och S-335-5, deras titrar var annorlunda, slutligen vi valde anti-BRCAA1 monoklonal antikropp från S-200-5 cellinje som den första antikroppen för att färga magcancer vävnader och kontrollvävnader. Vi fann att BRCAA1 protein uppvisade överexpression i 64% gastriska cancervävnader, ingen expression i normala kontrollgastriska mukösa vävnader, såsom visas i figur 1, existerar det statistisk skillnad mellan två grupp (P
< 0,01). Detta resultat är nästan identisk med vår tidigare rapport [4, 9-11], som i hög grad tyder på att BRCAA1 antigen kan väljas som potentiellt mål för de flesta magcancer, om så förberedda nanoprobes kan känna igen 64% av patienterna med magcancer tidig, det kommer att vara mycket användbart för diagnos och terapi av kliniska magcancer patients.Table 1 Titrar av BRCAA1 monoklonala antikroppar i ascitesfluidum inducerad av hybridomklon celler genom ELISA

Antikroppstiter *
Klon
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1.024.000
1.024.000 Hotel < 1000 Hotel < 1000
S-335- 5
128.000
512,000 Hotel < 1000 Hotel < 1000
* den ömsesidiga av ascitesvätska utspädning, var den första spädningen av ascitesvätska 1:. 1000
** Antigenerna belades på ELISA-plattan.
Figur 1 Expression av BRCAA1 protein i magcancer vävnader och normala kontrollgastriska slemhinnor. A: magcancer vävnader × 100; B: normala kontrollvävnader, × 50.
Framställning och karakterisering av BRCAA1- FMNPs nanoprobes
Såsom visas i fig 2A, preparerade FMNPs var sammansatta av kiseldioxid-inslaget CdTe och magnetiska nanopartiklar, deras storlek var 50 nm eller så i diameter. Som visas i figur 2D, efter FMNPs konjugerades med anti-BRCAA1 antikropp, intensitet som förberedda nanoprobes "fotoluminescens (PL) var lägre än FMNPs, uppvisar vänsterförskjutning av 40 nm, vilket berodde på minskad polariseringshastigheten av de omgivande molekylerna, och som resulterar i en minskning av stokes förskjutning, vilket slutligen resulterar i en blå förskjutning av emissionsspektra. På samma sätt, magnetisk intensitet som förberedda nanoprobes var också lägre än FMNPs. Figur 2 Karakterisering av anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes. A: HR-TEM bild av FMNPs; B: Magnetic egenskap av anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes; C: Zeta-potential FMNPs med aminogrupp, COOH, Si-O-grupp; D:. PL spektra av FMNPs konjugerade med och utan BRCAA1 antikropp
Under förbereda BRCAA1-FMNPs nanoprobes, fann vi att ytan funktionalisering av FMNPs var själva nyckeln till konjugera anti BRCAA1 antikropp med FMNPs via kovalent bindning. Såsom visas i fig 2C, olika funktionella grupper av FMNPs har olika zeta-potential värden. FMNPs hade negativ Si-O-grupp, var deras Zeta-potentialen värdet -34,05 mV, de FMNPs med aminogrupp hade positiv Zeta-potentialen värde av 24,80 mV, FMNPs med karboxylgrupp hade negativa Zeta-potentialen värde -30,50 mV. Vi observerade att karboxylgrupper på ytan av FMNPs konjugerade med anti-BRCAA1 antikropp lättare än aminogrupper på ytan av FMNPs. Såsom visas i tabell 2, var den genomsnittliga kopplingshastigheten för anti-BRCAA1 antikropp med FMNPs-COOH 80,28% .table 2 Koppling hastighet mätning av FMNPs-anti-BRCAA1 antikropp

Total koncentration av anti-BRCAA1 antikropp (ng /mikroliter)
koncentrationen av anti-BRCAA1 antikropp i restreaktionsblandning (ng /mikroliter)
Koppling hastighet (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Som förberedda nanoprobes för in vitro
riktade gastric cancerceller
inriktning förmåga som förberedda nanoprobes in vitro
observerades av fluorescensmikroskop och beräknade av FACSCalibur flödescytometer. Såsom visas i fig 3, FMNPs slumpvis dispergerat i det inre av cytoplasman, och anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes existerade runt kärnsystemet. Båda FMNPs och beredda BRCAA1-FMNPs nanoprobes kan träda in i cytoplasman av MGC803 celler efter 4 h inkubation med MGC803 celler, såsom visas i figur 4A, kunde FMNPs märka 25,23% MGC803 celler, den förblir 74,77% celler kunde inte märkas. Såsom visas i figur 4B, 45,92% MGC803 celler kunde märkas genom de BRCAA1-FMNPs nanoprobes. När FMNPs och anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes var respektive odlades med MGC803 celler och humana fibroblastceller för 0,5 timmar, observerade vi en hel del anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes ingått MGC803 celler, några nanoprobes ingått humana fibroblastceller, några FMNPs kunde ingå MGC803 celler och humana fibroblastceller, som i hög grad tyder på att anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes kan rikta MGC803 celler specifikt. Magnetic Resonance avbildning av MGC803 celler och humana fibroblastceller inkuberades med anti-BRCAA1-FMNPs för 4 h visades i figur 5, MGC803 celler uppvisade stark magnetisk signal än humana fibroblastceller (HDF), som också visade att de framställda nanoprobes kan rikta MGC803 celler specifikt. Figur 3 In vitro-fluorescensbilder av MGC 803 efter behandling med FMNPs och FMNPs-BRCAA1 nanopartiklar (Förstoring = x 200). Den övre grupp av bilder illustreras FMNPs slumpvis distribuera i cytoplasman, den andra gruppen av bilder uppvisade FMNPs-BRCAA1 spridda runt kärnsystemet och hade väl rikta förmåga till MGC803.
Figur 4 FACSCalibur flödescytometer analys av MGC803 märkt med FMNPs och FMNPs-BRCAA1. A: den MGC803 behandlades med 50 ^ g /ml FMNPs under 24 h uppvisade 25,23% cell märktes med FMNPs. B: den MGC803 behandlades med 50 ^ g /ml FMNPs-BRCAA1 under 24 h illustreras upp till 45,92% cell märktes med FMNPs-BRCAA1
Figur 5 MR-avbildning av MGC803 celler och HDF-celler.. A: MGC803 celler med anti-BRCAA1-FMNPs. B: HDF-celler med anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 celler med endast FMNPs
Som förberedda nanoprobes för fluorescerande avbildning av in vivo
gastric cancerceller
att utvärdera tumör riktade egenskaper hos anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, nakna möss modeller laddade med MGC- 803 gastric cancerceller framställdes och övervakas i enlighet med ett icke-invasivt sätt under 12 timmar med hjälp av IVIS fluorescens avbildningssystemet.
genom att övervaka realtidsfluorescensintensiteten i hela kroppen, tumören inriktning karaktär anti-BRCAA1- FMNPs prob lätt bestämmas i nakenmöss laddade med magcancer MGC803 celler. Såsom visas i fig 6A, producerade de hela djur fluorescerande signaler inom 30 min av post-injektion av nanoprobes, de subkutana tumörvävnader kunde tydligt avgränsade från den omgivande bakgrunden vävnad mellan 1 h och 12 h efter injektion, med maximal kontrast inträffar vid 6 timmar efter injektion. Stark fluorescens signal fortfarande detekteras i tumörstället vid sex timmar efter injektion, vilket indikerade att anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes företrädesvis ackumulerades i tumörvävnad. Faktiskt baserat på resultaten i figur 6B, desto högre tumör till bakgrundsförhållande (TBR) värde som föreslås starkt att sådan den framställts nanoprobes preferentiellt ackumuleras i tumörvävnader jämfört med normala kontrollvävnader. Detta bekräftades i fluorescensbilder, som visade att fluorescenssignalen av så framställda nanoprobes i tumörstället var starkast bland alla möss organ som visas i figur 6C. Dessutom, efter 12 timmar efter injektion av anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, fluorescensintensiteten i tumören observerades fortfarande tydligt, under det att upptag av beredda nanoprobes i normala organ var inte självklart. Dessa data antyder starkt att förberedda nanoprobes kan rikta mycket effektivt tumörvävnad inuti nakna möss laddade med magcancer. Vi observerade också att dessa nanoprobes i hela musen kroppen nästan helt försvunnit vid 12 timmar efter injektion, upptäckte vi också nanoprobes lämnat ut från cholecyst systemet (data visas ej), den tidsberoende cholecyst clearance av nanoprobes mycket tyder på att så -Beredda nanoprobes kan inte stanna inne nakna möss för längre tid, alltså som förberedda nanoprobes äger god biosäkerhet. Figur 6 In vivo fluorescens bilder av tumör anhopning och vävnadsfördelning för FMNPs-BRCAA1 nanopartiklar i MGC803 humana gastriska tumörbärande atymiska nakna möss. A In vivo
fluorescens bilder av atymiska nakna möss med. MGC803 mänsklig gastric tumör erhölls efter injektion av FMNPs-BRCAA1 nanopartiklar vid olika tidpunkt. Tumören läge anges med en pil. A-1: 0 h, A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 h, A-6: 12 h. B, TBR [Tissue till bakgrunden (muskel) förhållandet] värde. TBR värdet bestämdes enligt följande: TBD = (Tumor signalbakgrundssignal) /(bakgrundssignal). C, ex vivo
fluorescensbilder av dissekerade organ och tumörer hos möss med MGC803 mänsklig gastric tumör avlivades vid 12 timmar efter injektion av FMNPs-BRCAA1 nanopartiklar. Fluorescens bilder av dissekerade organ och tumör erhölls med användning av en fluorescens bildteknik med en 630 nm emissionsfilter. D, biofördelningen av anti- BRCAA1-FMNPs hos möss efter intravenös injektion. Flera tidpunkter efter injektion, var järn mängder i vävnadsprover utvärderades med ICP-masspektrometri (n = 3).
Patologisk analys av tumör och viktiga organ
In vitro
utvärdering av exciderade större vävnader inkluderande lever, lunga , mjälte, njure och hjärta, såväl som tumören, visade att den anti-BRCAA1-FMNPs prober var huvudsakligen upp-fattas av tumörvävnaderna, som uppvisade starka fluorescenssignaler, såsom visas i figur 7, medan andra vävnader inkluderande lever , lunga, mjälte och hjärta upp-tog anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes mycket mindre, vilket furtherly tyder på att så förberedd BRCAA1-FMNPs nanoprobes kan rikta magcancer vävnader. Vi använde också HE-färgning för att kontrollera alla organ, har inga uppenbara skador observerades i viktiga organ [se ytterligare en fil 1]. Figur 7 Resultat av immunofluorescensanalys. A, tumörvävnad. B, lever. (Förstoring = × 200).
Som förberedda nanoprobes för MR-avbildning av nakna möss laddade med magcancer
In vivo
MR-avbildning utfördes på nakna möss laddad med subkutan gastric cancer vid 12 timmar efter injektion . Representativa bilder av kartor T2 visades i figur 8, efter injicering av nanoprobes ades en betydande förändring i signalintensitet observerades i vissa regioner av tumörer, vilket tyder på att det fanns ackumulering av nanoprobes i tumörstället som visas i figur 8B, som pilen visade. Som en kontroll, efter att mössen modell med magcancer injicerades FMNPs under 12 h, fick mössen utfördes MR-avbildning, som inte uppvisade intensiv signal i tumörområdet (figur 8A). Figur 8 MRI-bild av möss. A, FMNPs utan kopplings BRCAA1 B, FMNPs kombination med BRCAA1
potentiell mekanism för att rikta avbildnings
Under de senaste åren, molekylära avbildningstekniker har använts för realtids- och icke-invasiv avbildning av in vivo
tumörvävnader [39-43]. Till exempel, kvantprickar, på grund av sina unika självlysande egenskaper, använts för bio-märkning och fluorescerande imaging [11-13, 33, 43], men kvantprickar "toxicitet begränsat deras tillämpning i människokroppen, så långt någon säker kvant punkter utvecklas. Magnetiska nanopartiklar har också använts som kontrastreagens för MR-avbildning [15, 33, 36]. Samtidigt, en kombination av två avbildningsmetoder ger fördelar både än att använda en metod som skulle ge fullständig information om tumörlokalisering, miljö och status.
I denna studie vi utformat och utarbetat en ny avbildningssonden, som bestod av kisel-inslaget kvantprickar och magnetiska nanopartiklar i syfte att förbättra deras biokompatibilitet. Våra resultat visar att förberedda kisel lindade kvantprickar och magnetiska nanopartiklar är mycket stabil och egen starka fluorescerande signaler och magnetisk intensitet. Genom att använda de starka fluorescenta signaler av as-framställda nanoprobes, vi framgångsrikt erhållit de fluorescerande bilder av in vivo-
gastriska cancervävnader med 5 mm i diameter i nakna möss modell. Med användning av de starka magnetiska signaler av as-framställda nanoprobes, vi också framgångsrikt fått MR-bilder av in vivo-
gastriska cancervävnader med 5 mm i diameter i nakna möss modell. Jämfört med tidigare rapporter, större storlek av tumörvävnad (> 5 mm) kan lätt avbildas med hjälp av fluorescerande avbildning och MRI, som en kontrast, våra resultat visade att som förberedda nanoprobes kan upptäcka mindre storlek av tumörvävnad (minus 5 mm i diameter), som markant förbättrade känsligheten hos detekteringsmetoden. Vårt resultat är också första gången att rapportera dubbla modal inriktning avbildning av in vivo
gastric cancervävnader.
Hur man rikta in vivo
gastric cancervävnader är också en talan problem. Hittills har inga specifika magcancer biomarkörer rapporterats. Även HER-2-protein bekräftades ha positiva uttryck i 6-35% av magcancer vävnader [28-31], HER-2-proteinet uppvisar även överuttryck i många tumörvävnad såsom bröstcancer, lungcancer, tjocktarmscancer, etc, därför HER-2 inte bör vara specifika biomarkörer för magcancer. Våra resultat visar att BRCAA1 antigen är endast överuttryckt i 64% eller så av magcancer vävnader från kliniska kirurgipatienter, bekräftade vi också att BRCAA1 antigen är överuttryckt i vissa magcancer cellinjer såsom MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III och MGC803 [6-9]. Vi använde MGC803 celler för att framställa nakna möss modell laddad med magcancer, och framgångsrikt observerat att sådan den framställts nanoprobes preferentiellt ackumuleras i tumörvävnader jämfört med normala kontrollvävnader, och som efterinsprutningstiden ökas. Vi observerade också att injiceras nanoprobes i hela kroppen uppvisade tidsberoende clearance och de fluorescerande signalerna minskade gradvis när den tid som förflutit på grund av lever cholecyst utsöndring systemet och njur klarhet som förberedda nanoprobes. Flera rapporter har visat att njur endast klar nanopartiklar med 5 nm i diameter, i vår studie observerade vi att så förberedda nanoprobes med 50 nm i diameter också kan raderas inom 12 timmar. Denna betong mekanism pågår.
Nanoprobe biosäkerhet är också ett viktigt problem [44], som avgör ansökan utsikterna för som förberedda nanoprobes. Våra resultat visade fullständigt att som förberedda nanoprobes inte skada viktiga organ, inklusive lever, njure, hjärta, lunga, etc, också uppvisade inte långsiktigt vistas i viktiga organ, som i hög grad tyder på att så förberedda nanoprobes äger god biokompatibilitet, och har stor potential i tillämpningar såsom dubbel modell avbildning och selektiv behandling av magcancer tidig.
Slutsats
Vi förberedde framgångsrikt en roman anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, som kan användas för in vivo
två modal avbildning såsom fluorescerande avbildning och magnetisk resonanstomografi, och äger en uppenbart specifik inriktning förmåga mot en magcancer vävnader med 5 mm i diameter under 0,5 h och 12 h efter injektion, och egen god biokompatibilitet. Detta bör vara första rapport. De som framställda multifunktionella nanoprobes också kan användas för hypertermi behandling av magcancer enligt in vitro
alternerande magnetfält bestrålning, och har en stor potential i tillämpningar såsom samtidig avbildning och målsökande terapi av klinisk magcancer inom snar framtid.
Material och metoder
Framställning av anti-BRCAA1 monoklonala antikroppar
Djurförsök utfördes enligt riktlinjer för Animal Care och användning kommittén, Shanghai Jiao Tong University. Monoklonala antikroppar framställdes mot ett renat fusionsprotein BRCAA1. BALB /c honmöss, 4-6 veckor gamla, köptes från Shanghai LAC Laboratory Animal Co. Ltd., Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Mössen immuniserades genom intraperitoneal injektion med 50 ^ g av renat BRCAA1 protein som emulgerades med en lika stor volym av Freunds fullständiga adjuvans. Ytterligare tre injektioner gavs med hjälp av ofullständiga adjuvans varannan vecka. Tre dagar efter den sista injektionen togs mjältcellerna från mössen skördas och fuseras med Sp 2/0 musmyelomcellinje. Efter 10-14 dagar överfördes odlingssupernatanterna screenas med ett ELISA-test, i vilken den fasta fasen belades med det rekombinanta BRCAA1 proteinet (2 | ig /ml) som används för immunisering. I screeningsprocessen, för att de monoklonala antikropparna binder med belagt BRCAA1 protein valdes ut. Två gånger begränsande utspädning, var positiva kolonier klon. Ascitiska vätskor skördades från mössen vaccinerats med en 0,5 ml intraperitoneal injektion av Pristane och injiceras sedan med 10 6 hybridomceller. Klassen och underklassen för varje mAb bestämdes med användning av en monoklonal musantikropp Isotypning kit (Hy Cult Biotechnology B.V., Nederländerna). De mAbs renades från mus asketiska vätskor med hjälp av ett protein G-Sepharose 4 ff-kolonn (Pharmacia, Uppsala, Sverige) enligt tillverkarens instruktioner för att ta bort komponenter som kan störa biopanning experiment. Antikroppstitrarna bestämdes genom ELISA-metoder [45]. Slutligen en preparerade anti-BRCAA1 monoklonala antikroppar användes som första antikropp för att färga 50 exemplar av magcancer och styra gastriska slemhinnor, som samlades in från Chang Hospital och No.1 People sjukhus i Shanghai och identifieras genom patologisk undersökning.
Upprättande och ytfunktionalisering av FMNPs
Framställning av Fe 3O 4 nanopartiklar baserades på samutfällning av järn och ferrijon lösningar (1: 2 molförhållande) [46-49]. CdTe nanokristaller syntetiserades på följande sätt i enlighet med vår tidigare rapport: CdCl 2 (5 mmol) löstes i 110 ml vatten, och 12 mmol av TGA tillsattes under omröring, följt av justering av pH till 11 genom droppvis tillsats av 1 M NaOH-lösning. Den blandade lösningen placerades i en trehalskolv avluftas av N 2 bubblande under 30 minuter. Under omrörning tillsattes 2,5 mmol av syrefri sömmar lösning injicerades i tre-halsad kolv, som var nyberedda från tellur pulver och NaBH 4 (molärt hastighet av 1: 2) i vatten vid 0 ° C. Den resulterande lösningen var ca 4 mg /ml, och produkt den 3,5 nm diameter som avges med ett maximum runt 630 nm. Fluorescerande magnetiska nanopartiklar (FMNPs) framställdes med användning av omvänd mikroemulsion strategi. Innan koppling av FMNPs med BRCAA1, först funktion vi ytan funktionella gruppen FMNPs som karboxylgrupp. 95 ml etanol och 2 ml 3-aminopropyltrietoxisilan (APS) tillsattes för att bilda en blandad lösning, och fick reagera vid rumstemperatur under 24 h. Aminosilanen modifierade FMNPs separerades genom permanentmagnet och tvättades med avjoniserat vatten tre gånger. Sedan återdispergerades den FMNPs-NH 2 i 100 ml dimetylformamid (DMF), sattes driven bärnstenssyraanhydrid till att bilda en blandad lösning och reagera vid rumstemperatur under 24 h. Karboxyl-modifierade FMNPs separerades genom permanentmagnet igen och tvättades med avjoniserat vatten tre gånger.
Framställning och karakterisering av BRCAA1 antikropps konjugerade FMNPs
Vi använt två-stegsförfarande för att erhålla en stabil anti-BRCAA1-FMNPs konjugering [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg FMNPs-COOH lösning dispergerades i 2 ml pH 7 PBS-buffert, och sonikerades under 10 min. Sedan vi blandades 1 ml av färskt 400 mM EDC och 100 mM NHSS i pH 6,0 MES-buffert och roterades den vid rumstemperatur under 15 min. Efter detta, var den resulterande lösningen separerades genom magnetfält och ett mg /ml BRCAA1 monoklonal antikropp tillsattes till blandningen ovan, omrörs i mörk plats i 2 h. För att avlägsna fri BRCAA1, resterande reaktionsblandningen separerades genom magnetfältet och det fasta kvarvarande tvättades med 1 ml PBS-buffert tre gånger. Slutligen 1 ml 0,05% Tween-20 /PBS tillsattes till BRCAA1-FMNPs konjugering och den slutliga bio-konjugering vid 4 ° C lagrades. När vi använde, bör denna BRCAA1-FMNPs konjugering spädas med PBS /0,05% Tween-20. Då vi använde Nano Drop-enheten att kvantifiera kopplingshastigheten för BRCAA1 antikropp med FMNPs-COOH. Innan kopplingsreaktionen, mätte vi den totala koncentrationen av BRCAA1 antikropp. Efter koppling reaktion, mätt vi koncentrationen BRCAA1 antikropp i restreaktionsblandningen och beräknas kopplingshastighet enligt ekvationen:
Koppling (%) = (1-Koncentration av BRCAA1 antikropp i restreaktionsblandning /totala koncentrationen av BRCAA1 antikropp) × 100. sälja The som förberedda nanoprobes och rena FMNPs präglades av transmissionselektronmikroskopi och fotoluminiscens (PL) spektrometri, och Zeta potential analysator.
nanoprobes för in vitro
inriktning avbildning av gastric cancerceller
magcancer-cellinjen MGC803 celler med överuttryckt BRCAA1 proteinet användes som målceller, humana fibroblastceller utan uttryckt BRCAA1 protein användes som kontroll, odlades och samlas in, och sedan behandlades med 50 | ig /ml BRCAA1-FMNPs nanoprobes och odlades i en fuktad 5% CO 2 balanserad luft inkubator vid 37 ° C under 4 h, under tiden den MGC803 och humana fibroblastceller behandlades med FMNPs som kontrollgruppen. Efteråt sköljdes cellerna med PBS tre gånger, och sedan fixerade celler med 2,5% glutaraldehydlösning under 30 min. För kärn motfärgning var MGC803 inkuberades med 1 mM Hoechst 33258 i PBS under 5 min. Cellerna observerades av fluorescensmikroskop (Nikon TS100-F), och avbildas av GE HDX 3.0T MR instrument utrustad med ParaVision 3,0 programvara.
Vi använde också flödescytometern för att utvärdera magcancer cellmålsökningsförmåga BRCAA1- FMNPs nanoprobes.

• Djup sekvensering av magcancer avslöjar somatiska mutationer som är relevanta för personlig medicin
• BariSurg prov: Sleeve gastrektomi kontra Roux-en-Y gastric bypass hos överviktiga patienter med BMI 35-60 kg /m2 - en multicenter randomiserad patienten och observatören blinda non-inferiority trial