anticorps monoclonal BRCAA1 conjugué nanoparticules magnétiques fluorescentes pour l'imagerie in vivo de magnetofluorescent ciblée du cancer gastrique

anticorps monoclonal BRCAA1 conjugué nanoparticules magnétiques fluorescentes pour in vivo
imagerie magnetofluorescent ciblée du cancer gastrique
Résumé de l'arrière-plan
cancer gastrique est 2ème cancer le plus fréquent en Chine, et est toujours la deuxième cause la plus courante de cancer la mort concernant la PI dans le monde. Comment reconnaître les cellules cancéreuses gastriques précoces est encore un grand défi pour le diagnostic et le traitement des patients atteints de cancer gastrique. Cette étude a pour but de développer une sorte de nanosondes multifonctionnels pour in vivo
imagerie magnetofluorescent du cancer gastrique ciblé.
Méthodes
anticorps monoclonal BRCAA1 a été préparé, a été utilisé comme premier anticorps pour colorer 50 paires de spécimens de l'estomac le cancer et contrôler les muqueuses gastriques normaux et conjugués à des nanoparticules magnétiques fluorescentes à 50 nm de diamètre, les nanosondes magnétiques fluorescentes BRCAA1 conjugués résultants ont été caractérisées par microscopie électronique à transmission et photoluminescence spectrométrie nanosondes que préparées ont été mises en incubation avec un cancer gastrique MGC803 cellules, et ont été injectés dans le modèle de souris chargé de cancer gastrique de 5 mm de diamètre par l'intermédiaire de veine de la queue, puis ont été imagées par imagerie optique de fluorescence et l'imagerie par résonance magnétique, on a étudié leur biodistribution. Les résultats des tranches de tissu ont été observées par microscopie à fluorescence, et les organes importants tels que le cœur, les poumons, les reins, le cerveau et le foie ont été analysées par hématoxyline et éosine (HE) méthode de coloration.
anticorps monoclonal BRCAA1 a été préparé avec succès, protéines BRCAA1 exposé sur-expression dans 64% des tissus de cancer gastrique, aucune expression dans les tissus des muqueuses gastriques normales de contrôle, il existe de différence statistique entre les deux groupes (P
< 0,01). Le fluorescent magnétique nanosondes exposition BRCAA1 conjuguée à une très faible toxicité, faible intensité magnétique et l'intensité de fluorescence inférieure avec un pic bleu-shift que FMNPs purs, pourrait être endocytose par gastriques cellules cancéreuses MGC803, pourraient cibler in vivo
tissus de cancer gastrique dans chargés par des souris, et pourrait être utilisé pour les tissus de cancer gastrique d'images par imagerie de fluorescence et l'imagerie par résonance magnétique, et principalement distribué dans les tissus du cancer gastrique locaux dans les 12 heures après l'injection. HE tache analyse a montré que pas de dommages évidents ont été observés dans des organes importants.
Conclusions
Les BRCAA1 monoclonaux nanoparticules magnétiques fluorescentes d'anticorps conjugués à haute performance peuvent cibler in vivo
cellules de cancer gastrique, peut être utilisé pour magnetofluorescent simultanée l'imagerie, et peut avoir un grand potentiel dans des applications telles que l'imagerie à double modèle et la thérapie thermique local du cancer gastrique dans le futur proche.
Contexte
cancer gastrique était une fois le deuxième cancer le plus commun dans le mot [1]. Jusqu'à ce jour, aux États-Unis, le cancer de l'estomac est actuellement le 14e cancer le plus fréquent, et 2ème cancer le plus fréquent en Chine [2, 3]. Le cancer gastrique est toujours la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde, et reste difficile à guérir, car la plupart des patients présentent une maladie avancée. Par conséquent, la façon de reconnaître, piste ou tuer les cellules de cancer gastrique précoce est très essentiel pour le diagnostic et le traitement des patients atteints de cancer gastrique précoce.
Jusqu'à ce jour, la recherche de biomarqueurs étroitement associés au cancer de l'estomac est encore une tâche importante. Depuis 1998, nous avons été tenté d'établir un système gastrique précoce du cancer pré-alerte [4], et nous espérons utiliser ce système de pré-alerte pour détecter les cellules de cancer gastrique précoce pour reconnaître les patients atteints de cancer gastrique. Bien que certains gènes différemment exprimés associés au cancer gastrique au début ont été identifiés [5, 6], pas un gène peut être confirmé comme biomarqueur spécifique de cancer gastrique. Par conséquent, afin de reconnaître les cellules cancéreuses gastriques début, nous ne sélectionnons que des biomarqueurs potentiels associés au cancer de l'estomac, et combinons des nanoparticules et des techniques d'imagerie moléculaire, essayons de trouver in vivo
précoces cellules cancéreuses gastriques par vivo
imagerie de la tumeur ciblée . Dans nos travaux précédents, nous avons projeté dehors et gène BRCAA1 cloné (cancer du sein associé antigène 1 gène) à partir de la lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7cells [AF208045, également appelé ARID4B (AT-riche interactive protéine 4B contenant de domaine)], et identifié son peptide épitope d'antigène SSKKQKRSHK [7, 8]. Nous avons également préparé un anticorps polyclonaux BRCAA1, et observé que la protéine BRCAA1 exposée sur-expression dans presque 65% des échantillons cliniques de tissus de cancer gastrique [9-11]. Nous avons également observé que l'antigène BRCAA1 est surexprimé dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, tels que MKN-1, MKN-74, CGS-7901, KATO-III et MGC803 cellules. Par conséquent, nous prévoyons que la protéine BRCAA1 peut être une molécule de ciblage potentiel in vivo
cellules de cancer gastrique.
Au cours des dernières années, les technologies d'imagerie moléculaire basé sur nanosondes multi-fonctionnels ont fait de grands progrès. Par exemple, des nanoparticules telles que des points quantiques, des nanoparticules magnétiques et des nanotiges d'or, etc., ont été utilisés pour l'imagerie moléculaire [12-19]. Jusqu'à présent, plusieurs technologies d'imagerie petits animaux ont été développés tels que l'imagerie optique (OI) de la bioluminescence (BLI), fluorescence (FLI) et de microscopie intravitale (IVM), micro-TEP, IRM et CT [20-26]. Parmi toutes ces technologies, comment améliorer leur résolution spatiale et la sensibilité de la profondeur des tissus est un grand défi. Jusqu'à présent in vivo
tissus tumoraux avec plus de 1 cm de diamètre peuvent être facilement identifiés par CT, IRM, TEP et l'imagerie par bioluminescence, les tumeurs de moins de ou égale à 5 mm de diamètre, il est très difficile à trouver chez les patients cliniques. Dans nos rapports précédents, des nanoparticules magnétiques photosensibilisateurs conjugués ont été utilisés avec succès pour vivo
simultanée magnetofluorescent imagerie et de ciblage thérapeutique dans [27]. Cependant, la capacité de ciblage nanosondes était fortement dépendante de nanoparticules magnétiques. Nous avons également préparé un CdTe quantique cluster dot nanosystèmes Ribonuclease-A-conjugué multifonctionnel pour l'imagerie du cancer synchrone et la thérapie [28], la capacité de ciblage des nanosondes comme préparés dépend de peptide RGD. Certaines études montrent que protéine HER-2 présente une expression anormale dans 6-35% des tissus du cancer gastrique [29, 30], et a été utilisé comme cible thérapeutique pour les patients atteints de cancer gastrique cliniques [31], par conséquent, protéine HER-2 possède un grand potentiel dans l'imagerie et la thérapie du cancer gastrique. Cependant, jusqu'à ce jour, aucun rapport montre que l'imagerie et la thérapie de vivo
cancer gastrique dans ciblé est basé sur les biomarqueurs associés au cancer gastrique.
Au cours des dernières années, nous avons préparé de façon contrôlable les points quantiques revêtus de silice et super-paramagnétique composites de nanoparticules (de FMNPs) avec des signaux fluorescents puissants et d'excellentes propriétés magnétiques, et les ont utilisés pour la bio-étiquetage, le suivi des cellules souches, la bio-séparation, ciblant l'imagerie et l'hyperthermie de tumeurs [29-32], nous avons également observé que préparé nanoparticules possèdent une bonne biocompatibilité et la stabilité [33-38].
Dans cet article, nous utilisons pleinement les avantages de FMNPs et de l'antigène BRCAA1, anticorps monoclonal préparé contre la protéine de BRCAA1 et BRCAA1 préparé monoclonaux nanosondes magnétiques fluorescentes anticorps conjugué (BRCAA1- FMNPs), employé modèle de souris nude chargé de cancer gastrique de 5 mm de diamètre et IVIS système d'imagerie et imagerie par résonance magnétique, a étudié la faisabilité de nanosondes que préparés pour non-invasive in vivo
double imagerie du cancer gastrique modal ciblé. Les résultats montrent que nanosondes comme préparés peuvent être utilisés pour in vivo
double modèle imagerie du cancer gastrique, et peuvent avoir un grand potentiel dans des applications telles que l'imagerie à double modèle et la thérapie thermique local du cancer gastrique dans un proche avenir.
Résultats et discussion de la caractérisation des anticorps anti-anticorps monoclonal BRCAA1
Comme le montre le tableau 1, on a obtenu avec succès deux lignées cellulaires positives clone S-S-200-5 et 335-5, leurs titres étaient différents, enfin nous avons choisi l'anticorps monoclonal anti-BRCAA1 de S-200-5 lignée cellulaire comme le premier anticorps pour colorer des tissus du cancer gastrique et les tissus témoins. Nous avons trouvé que la protéine présentait BRCAA1 surexpression dans 64% des tissus de cancer gastrique, aucune expression dans les tissus normaux de contrôle des muqueuses gastriques, comme le montre la figure 1, il existe différence statistique entre les deux groupes (P
< 0,01). Ce résultat est presque identique à notre précédent rapport [4, 9-11], qui suggère fortement que l'antigène BRCAA1 peut être choisi comme cible potentielle pour le cancer gastrique plus, si, comme préparés nanosondes peuvent reconnaître 64% des patients atteints de cancer gastrique au début, il sera très utile pour le diagnostic et la thérapie des cliniques patients.Table de cancer gastrique 1 Les titres de BRCAA1 anticorps monoclonaux dans ascite Fluid induite par des cellules hybridomes Clone par ELISA

titre d'anticorps *
Clone
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) -SAB **
BSA **
OVA **
S-200-5
1024000
1024000
< 1,000
< 1000
S-335- 5
128.000
512.000
< 1,000
< 1,000
* l'inverse de l'ascite dilution du fluide, la première dilution du liquide d'ascite était de 1:. 1000
** les antigènes ont été revêtus sur une plaque ELISA.
Figure 1: expression de la protéine BRCAA1 dans les tissus cancéreux de l'estomac et les tissus normaux de contrôle des muqueuses gastriques. A: tissus de cancer gastrique, × 100; B: les tissus de contrôle normaux, × 50.
Préparation et caractérisation de BRCAA1- FMNPs nanosondes
Comme le montre la figure 2A, FMNPs préparés étaient composés de CdTe et magnétiques des nanoparticules de silice-enveloppé, leur taille était de 50 nm ou plus dans diamètre. Comme le montre la figure 2D, après FMNPs ont été conjugués avec un anticorps anti-BRCAA1, la photoluminescence de nanosondes as-préparés (PL) intensité était inférieure à celle de FMNPs, présentant de décalage à gauche de 40 nm, qui était due à une diminution du taux de polarisation des molécules environnantes, et aboutissant à la diminution de stokes déplacement, aboutissant finalement à un décalage vers le bleu dans les spectres d'émission. De même, l'intensité magnétique de nanosondes comme préparés était également inférieur à FMNPs. Figure 2 Caractérisation des nanosondes anti-BRCAA1-FMNPs. A: HR-TEM photo de FMNPs; B: la propriété magnétique des anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes; C: potentiel zêta de FMNPs avec un groupe amino, un groupe COOH, un groupe Si-O; D:. Spectres PL de FMNPs conjugués avec et sans anticorps BRCAA1
Dans le cadre de la préparation BRCAA1-FMNPs nanosondes, nous avons constaté que la surface fonctionnalisation de FMNPs était très clé pour conjuguer l'anticorps anti-BRCAA1 avec FMNPs via une liaison covalente. Comme on le voit sur la figure 2C, les différents groupes fonctionnels de FMNPs ont différentes valeurs de potentiel zêta. FMNPs avait Si-O-groupe négatif, leur valeur de potentiel zêta était -34,05 mV, les FMNPs avec groupe amino avaient une valeur de potentiel zêta positif de 24,80 mV, FMNPs avec groupe carboxyle avait une valeur négative de potentiel zêta de -30,50 mV. Nous avons observé que les groupes carboxyle sur la surface de FMNPs conjugués avec un anticorps anti-BRCAA1 plus facile que les groupes amino sur la surface de FMNPs. Comme le montre le tableau 2, le taux de couplage moyen d'anticorps anti-BRCAA1 avec FMNPs-COOH était 80,28% .Table 2 Couplage mesure de taux de FMNPs-anti-BRCAA1 anticorps

concentration totale de l'anticorps anti-BRCAA1 (ng /ul)
la concentration d'anticorps anti-BRCAA1 dans le mélange réactionnel résiduel (ng /ul)
taux de couplage (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Comme préparé nanosondes pour in vitro
cible les cellules cancéreuses gastriques
Ciblage capacité des nanosondes comme préparés in vitro
ont été observées par microscope à fluorescence et calculées par cytomètre de flux FACSCalibur. Comme on le voit sur la figure 3, FMNPs dispersées de façon aléatoire dans l'intérieur du cytoplasme et anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes existaient dans le nucléole. Les deux FMNPs et BRCAA1-FMNPs préparés nanosondes peuvent entrer dans le cytoplasme des cellules MGC803 après 4 heures d'incubation avec MGC803 cellules, comme le montre la figure 4A, FMNPs pourraient étiqueter 25,23% MGC803 cellules, le reste 74,77% des cellules ne peuvent pas être étiquetés. Comme cela est représenté sur la figure 4B, 45,92% MGC803 cellules peut être marqué par les BRCAA1-FMNPs nanosondes. Lorsque FMNPs et anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes ont été respectivement incubées avec MGC803 et des cellules de fibroblastes humains pour 0,5 h, nous avons observé un grand nombre d'anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes entrée en MGC803 cellules, quelques nanosondes entrés dans les cellules de fibroblastes humains, quelques FMNPs pourrait entrer en MGC803 et des cellules de fibroblastes humains, qui suggère fortement que l'anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes peuvent cibler MGC803 cellules spécifiquement. L'imagerie par résonance magnétique des MGC803 et des cellules de fibroblastes humains incubés avec des anti-BRCAA1-FMNPs pour 4 h ont été montrés à la figure 5, MGC803 cellules exposées signal magnétique forte que les cellules de fibroblastes humains (HDF), qui a également montré que les nanosondes préparés peuvent cibler MGC803 cellules spécifiquement. Figure 3 In vitro images fluorescence de MGC 803 après traitement avec FMNPs et FMNPs-BRCAA1 nanoparticules (Grossissement = × 200). Le groupe de tête des images illustrées FMNPs aléatoire distribuent dans le cytoplasme, le groupe inférieur d'images exposées FMNPs-BRCAA1 dispersé autour du nucléole et avait bien cibler la capacité du MGC803.
Figure 4 cytomètre de flux FACSCalibur analyse de MGC803 marqué avec FMNPs et FMNPs-BRCAA1. A: la MGC803 traitée avec 50 pg /ml de FMNPs pendant 24 h 25,23% présentaient cellules ont été marquées avec FMNPs. B: MGC803 traité avec 50 ug /ml de FMNPs-BRCAA1 pendant 24 h illustrés à 45,92% cellules ont été marquées avec FMNPs-BRCAA1
Figure 5 IRM de MGC803 et des cellules HDF.. A: MGC803 cellules avec anti-BRCAA1-FMNPs. B: cellules HDF avec anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 cellules avec seulement FMNPs
nanosondes pour l'imagerie de fluorescence in vivo
cellules de cancer gastrique
Pour évaluer tumorales propriétés ciblées de nanosondes anti-BRCAA1-FMNPs, des modèles de souris nues chargés de MGC- Comme préparé 803 cellules de cancer de l'estomac ont été préparées et contrôlées en vertu d'une manière non invasive pendant 12 heures en utilisant SIIV système d'imagerie par fluorescence.
en contrôlant l'intensité de fluorescence en temps réel dans tout le corps, le caractère tumoral ciblant des anticorps anti-BRCAA1- sonde FMNPs a été facilement déterminée dans les souris nues chargés de cancer gastrique MGC803 cellules. Comme le montre la figure 6A, les animaux entiers ont produit des signaux fluorescents dans les 30 minutes après l'injection de nanosondes, les tissus tumoraux sous-cutanées peuvent être clairement délimitées à partir du tissu de fond entourant entre 1 h et 12 h post-injection, avec un contraste maximal se produisant à 6 h post-injection. signal de fluorescence forte encore être détecté dans le site de la tumeur à 6 h post-injection, qui a indiqué que les anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes ont été préférentiellement accumulés dans les tissus tumoraux. En effet, sur la base des résultats de la figure 6B, la tumeur supérieur au bruit de fond (TBR) la valeur fortement suggéré que nanosondes telle qu'elle est préparée de manière préférentielle accumulée dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus témoins normaux. Ceci a été confirmé dans des images de fluorescence, ce qui montre que le signal de fluorescence de nanosondes telle que préparée dans le site tumoral était le plus fort parmi tous les organes de la souris, comme indiqué sur la figure 6C. En outre, après 12 h post-injection d'anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes, l'intensité de fluorescence dans la tumeur était encore clairement observé, tandis que l'absorption de nanosondes préparés dans les organes normaux n'a pas été évident. Ces données suggèrent que très nanosondes préparées peuvent cibler très efficacement les tissus tumoraux à l'intérieur des souris nues chargés de cancer gastrique. Nous avons également observé que ces nanosondes dans tout le corps de la souris presque complètement disparu à 12 h post-injection, nous avons également détecté les nanosondes sont sortis à partir du système de cholecyst (données non présentées), le jeu en fonction du temps cholecyst de nanosondes suggère fortement que nanosondes -Préparations ne peuvent pas rester à l'intérieur de la souris nude pour plus de temps, ainsi, comme préparé nanosondes possèdent une bonne bio-sécurité. La figure 6 fluorescence in vivo de l'accumulation des images de la tumeur et la distribution tissulaire pour les nanoparticules FMNPs-BRCAA1 dans MGC803 souris gastriques humains porteurs de tumeurs athymiques nude. A, In vivo
fluorescence images de souris nues athymiques portant. MGC803 tumeur gastrique humaine a été obtenue après injection de nanoparticules FMNPs-BRCAA1 à différents points de temps. La localisation de la tumeur est indiquée par une flèche. A-1: 0 h A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 h, A-6: 12 h. B, TBR [Tissue à fond (muscle) Ratio] valeur. La valeur TBR a été déterminée comme suit: TBR = (Tumor Signal-fond) /(signal d'arrière-plan). images C, Ex vivo
fluorescence des organes disséqués et tumeurs des souris portant MGC803 tumeur gastrique humaine sacrifiés à 12 h après l'injection de nanoparticules FMNPs-BRCAA1. Les images de fluorescence des organes disséqués et les tumeurs ont été obtenues en utilisant une technique d'imagerie par fluorescence avec un filtre d'émission de 630 nm. D, biodistribution de BRCAA1-FMNPs anti chez la souris après injection intraveineuse. Plusieurs points de temps après l'injection, les quantités de fer dans des échantillons de tissus ont été évalués par spectrométrie de masse ICP (n = 3).
Analyse pathologique de la tumeur et des organes importants
in vitro
évaluation des principaux tissus excisés y compris le foie, les poumons , de la rate, les reins et le cœur, ainsi que la tumeur, ont indiqué que l'anticorps anti-BRCAA1-FMNPs sondes sont principalement mises prises par les tissus tumoraux, qui présentaient des signaux de fluorescence forte, comme le montre la figure 7, tandis que d'autres tissus, y compris le foie , du poumon, de la rate et le coeur mis a pris anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes très moins, ce qui indique que furtherly préparé BRCAA1-FMNPs nanosondes peuvent cibler les tissus de cancer gastrique. Nous avons également utilisé coloration HE pour vérifier tous les organes, aucun dommage évident n'a été observé dans les organes importants [voir fichier supplémentaire 1]. Figure 7 Résultat de l'analyse d'immunofluorescence. Un tissu tumoral. B, le foie. (Grossissement = × 200).
Nanosondes pour MR Imaging de souris nude chargés de cancer gastrique Comme préparé
In vivo
IRM a été réalisée sur des souris nues chargé de cancer gastrique sous-cutanée à 12 h post-injection . Des images représentatives de cartes T2 ont été représentés sur la figure 8, après l'injection des nanosondes, une variation significative de l'intensité du signal a été observé dans certaines régions de tumeurs, ce qui indique qu'il existe une accumulation des nanosondes dans le site de la tumeur, comme illustré sur la figure 8B, que la flèche montré. En tant que témoin, d'après le modèle de souris avec un cancer gastrique ont été injectés FMNPs pendant 12 h, les souris ont été réalisées imagerie par résonance magnétique, qui ne montrent pas de signal intense dans la zone de la tumeur (figure 8A). Figure 8 image IRM de souris. A, FMNPs sans couplage BRCAA1 B, FMNPs couplé avec un mécanisme potentiel de BRCAA1 de cibler l'imagerie
Au cours des dernières années, les technologies d'imagerie moléculaire ont été utilisées en temps réel et de l'imagerie non-invasive du vivo
tissus tumoraux [39-43]. Par exemple, les points quantiques, en raison de leurs propriétés photoluminescentes uniques, ont été utilisées pour la bio-étiquetage et l'imagerie de fluorescence [11-13, 33, 43], mais les points quantiques de toxicité 'limité leur application dans le corps humain, à ce jour un certain quantique sûr les points sont en cours d'élaboration. des nanoparticules magnétiques ont également été utilisés en tant que réactif de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique [15, 33, 36]. Dans le même temps, la combinaison de deux modalités d'imagerie fournit les avantages des deux à l'aide d'une méthode, qui fournit des informations complètes sur la localisation de la tumeur, l'environnement et l'état.
Dans cette étude, nous avons conçu et préparé une nouvelle sonde d'imagerie, qui était composée de points quantiques de silicium enveloppés et des nanoparticules magnétiques dans le but d'améliorer leur biocompatibilité. Nos résultats montrent que préparés points quantiques de silicium enveloppé et nanoparticules magnétiques sont des signaux fluorescents forts et intensité magnétique très stable et propre. En utilisant les forts signaux fluorescents de nanosondes que préparés, nous avons réussi à obtenir les images fluorescentes de vivo
tissus de cancer gastrique dans de 5 mm de diamètre dans le modèle de souris nude. En utilisant les signaux magnétiques forts de nanosondes que préparés, nous avons également obtenu avec succès les images IRM de vivo
tissus de cancer gastrique dans de 5 mm de diamètre dans le modèle de souris nude. Par rapport aux précédents rapports, plus grande taille des tissus tumoraux (> 5 mm) pourrait être facilement imagées en utilisant l'imagerie de fluorescence et de l'imagerie IRM, en revanche, nos résultats ont montré que, préparé nanosondes peuvent détecter plus petite taille des tissus tumoraux (moins 5 mm de diamètre), ce qui améliore nettement la sensibilité du procédé de détection. Notre résultat est également la première fois pour signaler l'imagerie de ciblage double modale in vivo
tissus de cancer gastrique dans.
Comment cibler in vivo
tissus de cancer gastrique en est aussi un problème attaquable. Jusqu'à ce jour, aucun des biomarqueurs spécifiques de cancer gastrique ont été rapportés. Bien que la protéine HER-2 a été confirmée avoir une expression positive de 6 à 35% des tissus de cancer gastrique [28-31], protéine HER-2 présente également une sur-expression dans les tissus tumoraux de nombreux tels que le cancer du sein, le cancer du poumon, le cancer du côlon, etc, donc HER-2 ne devrait pas être biomarqueur spécifique pour le cancer gastrique. Nos résultats ont montré que l'antigène BRCAA1 est uniquement surexprimé dans les 64%, ou de tissus de cancer gastrique chez des patients de chirurgie clinique, on a également confirmé que l'antigène BRCAA1 est surexprimé dans certaines lignées cellulaires de cancer gastrique, tels que MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III et MGC803 [6-9]. Nous avons utilisé des cellules MGC803 pour préparer un modèle de souris nude chargé avec le cancer gastrique, et avec succès observé que nanosondes telle qu'elle est préparée de manière préférentielle accumulée dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus témoins normaux, et que le temps de post-injection a augmenté. Nous avons également observé que injectés nanosondes dans le corps entier ont présenté le jeu en fonction du temps et les signaux fluorescents ont diminué progressivement à mesure que le temps écoulé en raison du système d'excrétion du foie et des reins cholecyst clarté de nanosondes comme préparés. Plusieurs rapports ont montré que les reins seulement nanoparticules claires avec 5 nm de diamètre, dans notre étude, nous avons observé que nanosondes comme préparé avec 50 nm de diamètre pourrait également être autorisé dans les 12 h. Ce mécanisme concret est en cours.
Nanoprobe biosécurité est aussi un problème important [44], qui décide de la perspective de nanosondes comme préparés application. Nos résultats pleinement montré que nanosondes comme préparés ne pas endommager les organes importants, y compris le foie, les reins, le cœur, le poumon, etc, aussi ne pas présenter à long terme rester dans des organes importants, ce qui suggère fortement que comme préparé nanosondes possèdent une bonne biocompatibilité, et ont un grand potentiel dans des applications telles que l'imagerie modèle double et le traitement sélectif du cancer gastrique précoce.
Conclusion
Nous avons préparé avec succès un roman anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes, qui peuvent être utilisés pour vivo
deux imagerie modale tels que l'imagerie fluorescente et l'imagerie par résonance magnétique, et de posséder une capacité de ciblage spécifique de toute évidence vers un tissus de cancer gastrique avec 5 mm de diamètre pendant 0,5 h et 12 h de post-injection, et propre bonne biocompatibilité. Cela devrait être le premier rapport. Les nanosondes multifonctionnels comme préparés peuvent également être utilisés pour la thérapie hyperthermie du cancer gastrique sous in vitro
alternant irradiation de champ magnétique, et ont un grand potentiel dans des applications telles que l'imagerie simultanée et le ciblage thérapeutique du cancer gastrique clinique dans un avenir proche.
Matériel et méthodes de préparation d'anticorps monoclonaux anti-BRCAA1
expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices pour le soin des animaux et l'utilisation Comité, Shanghai Jiao Tong University. Les anticorps monoclonaux ont été préparés contre une BRCAA1 protéine de fusion purifiée. BALB /c femelles, âgées de 4-6 semaines, ont été achetés dans le Shanghai LAC des animaux de laboratoire Co. Ltd., Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). Les souris ont été immunisées par injection intraperitoneale avec 50 ug de protéine purifiée BRCAA1 qui a été émulsionnée avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund. Trois autres injections ont été administrées en utilisant un adjuvant incomplet toutes les deux semaines. Trois jours après la dernière injection, les cellules de rate des souris ont été récoltés et fusionnés avec la lignée de souris 2/0 de cellules de myélome Sp. Après 10-14 jours, les surnageants de culture ont été criblés par un test ELISA dans lequel la phase solide est revêtue avec la protéine recombinante BRCAA1 (2 pg /ml) utilisée pour l'immunisation. Dans le processus de sélection, les anticorps monoclonaux de se lier avec une protéine BRCAA1 revêtue ont été sélectionnés. En limitant le double dilution, les colonies positives ont été sous-clonés. les fluides ascitiques ont été récoltés à partir des souris sensibilisées par une injection intraperitoneale de 0,5 ml de pristane, puis injectés avec 10 6 cellules d'hybridome. La classe et la sous-classe de chaque mAb ont été déterminées en utilisant un kit anticorps monoclonal de souris de isotypage (Hy Cult Biotechnology B.V., Pays-Bas). Les mAb ont été purifiés à partir des fluides ascétiques de souris en utilisant une protéine G-Sepharose 4FF (Pharmacia, Uppsala, Suède) colonne selon les instructions du fabricant pour éliminer les composants qui pourraient interférer avec les expériences de biopanning. Les titres d'anticorps ont été déterminés par les méthodes ELISA [45]. Enfin, un des anticorps monoclonaux anti-BRCAA1 préparés a été utilisé comme premier anticorps pour colorer 50 spécimens de cancer de l'estomac et de contrôler les muqueuses gastriques, qui ont été recueillies à partir de l'hôpital Changzheng et l'Hôpital populaire N ° 1 de Shanghai et identifiés par un examen pathologique.
Préparation et surface fonctionnalisation de FMNPs de Préparation de Fe 3O 4 nanoparticules a été basée sur la co-précipitation de solutions ferreux et ferriques ion (rapport 1: 2 molaire) [46-49]. nanocristaux CdTe ont été synthétisés comme suit selon le rapport précédent: CdCl 2 (5 mmol) a été dissous dans 110 ml d'eau et 12 mmol de TGA ont été ajoutés sous agitation, puis on ajuste le pH à 11 par addition goutte à goutte d' 1 M de solution de NaOH. La solution mélangée a été placée dans un ballon à trois cols désaéré par N 2 barbotage pendant 30 min. Sous agitation, 2,5 mmol de solution de Nähte exempte d'oxygène a été injecté dans le flacon à trois cols, qui a été fraîchement préparée à partir de poudre de tellure et NaBH 4 (taux molaire de 1: 2) dans l'eau à 0 ° C. La solution résultante était d'environ 4 mg /ml, et le produit 3,5 nm de diamètre émis avec un maximum d'environ 630 nm. nanoparticules magnétiques fluorescentes (FMNPs) ont été préparés en utilisant l'approche de microémulsion inverse. Avant de coupler les FMNPs avec le BRCAA1, nous avons fonctionnalisé le groupe fonctionnel de surface de FMNPs comme groupe carboxyle. 95 ml d'éthanol et 2 ml de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APS) ont été ajoutés pour former une solution mélangée et on laisse réagir à température ambiante pendant 24 h. Les FMNPs d'aminosilane modifiée ont été séparés par un aimant permanent et ont été lavés avec de l'eau désionisée trois fois. Ensuite redispersé le FMNPs-NH 2 dans 100 ml de diméthylformamide (DMF), ajouté de l'anhydride succinique excessive pour former une solution mixte et réagir à la température ambiante pendant 24 h. Les FMNPs carboxyle modifié ont été séparés par aimant permanent à nouveau et on les lave avec de l'eau déminéralisée à trois reprises.
Préparation et caractérisation de BRCAA1 FMNPs d'anticorps conjugué
Nous avons utilisé deux étapes pour obtenir la conjugaison stable anti-BRCAA1-FMNPs [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg d'une solution FMNPs-COOH a été dispersé dans du tampon pH7 2 ml de PBS et a été traité par ultrasons pendant 10 min. Ensuite, nous avons mélangé 1 ml de frais mM EDC 400 mM et NHSS 100 dans le tampon pH 6,0 MES et tourné à la température ambiante pendant 15 min. Après cela, la solution résultante a été séparée par le champ magnétique et 1 mg /ml d'anticorps monoclonal BRCAA1 ont été ajoutés au mélange ci-dessus, on a agité dans l'obscurité pendant 2 h. Pour éliminer BRCAA1 libre, le mélange réactionnel résiduel a été séparé par le champ magnétique et le solide restant a été lavé avec 1 ml de tampon PBS à trois reprises. Enfin, 1 ml de 0,05% de Tween-20 /PBS a été ajouté à la conjugaison BRCAA1-FMNPs et la bio-conjugaison finale a été stockée à 4 ° C. Lorsque nous avons utilisé, cette conjugaison BRCAA1-FMNPs doit être dilué avec du PBS /0,05% de Tween-20. Ensuite, nous avons utilisé l'appareil Nano Chute de quantifier le taux de couplage d'anticorps BRCAA1 avec FMNPs-COOH. Avant la réaction de couplage, on a mesuré la concentration totale d'anticorps BRCAA1. Après la réaction de couplage, on a mesuré la concentration en anticorps BRCAA1 dans le mélange réactionnel résiduel et calculé le taux de couplage selon l'équation: Location de couplage (%) = (1-concentration d'anticorps BRCAA1 dans le mélange réactionnel résiduel /Concentration totale d'anticorps BRCAA1) × 100. Les
nanosondes que préparé et FMNPs pures ont été caractérisées par microscopie électronique à transmission et de photoluminescence (PL) spectrométrie et Zeta analyseur potentiel. Le plus nanosondes pour l'imagerie in vitro
ciblage des cellules cancéreuses gastriques
ligne gastrique de cancer des cellules MGC803 cellules avec surexpression de protéine BRCAA1 ont été utilisées comme cellules cibles, les cellules de fibroblastes humains sans protéines BRCAA1 exprimée a été utilisé comme témoin, ont été cultivés et recueilli, puis ont été traités avec 50 ug /BRCAA1-FMNPs mL nanosondes et culture dans un humidifié à 5% de CO 2 incubateur à air équilibré à 37 ° C pendant 4 heures, en attendant l'MGC803 et les cellules de fibroblastes humains ont été traités avec FMNPs que le groupe témoin. Ensuite, les cellules ont été rincées avec du PBS trois fois et ensuite les cellules fixées avec une solution de glutaraldéhyde à 2,5% pendant 30 min. Pour la contre-coloration nucléaire, MGC803 ont été incubées avec 1 mM de Hoechst 33258 dans du PBS pendant 5 min. Les cellules ont été observées par microscopie à fluorescence (Nikon TS100-F) et imagés par GE 3.0T MR HDX instrument d'imagerie doté d'un logiciel ParaVision 3.0.
Nous avons également utilisé le cytomètre en flux pour évaluer la cellule cancéreuse gastrique capacité de ciblage de BRCAA1- FMNPs nanosondes.

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