BRCAA1 monoklonalt antistoff konjugert fluorescerende magnetiske nanopartikler for in vivo målrettet magnetofluorescent avbildning av magekreft

BRCAA1 monoklonalt antistoff konjugert fluorescerende magnetiske nanopartikler for in vivo
målrettet magnetofluorescent avbildning av magekreft
Abstract
Bakgrunn
Magekreft er med 2. vanligste kreft i Kina, og er fremdeles den nest vanligste årsaken til kreft -relatert død i verden. Hvordan gjenkjenne tidlige magekreftceller er fortsatt en stor utfordring for tidlig diagnostisering og behandling av pasienter med magekreft. Denne studien har som mål å utvikle en slags multifunksjonelle nanoprobes for in vivo
målrettet magnetofluorescent avbildning av magekreft.
Metoder
BRCAA1 monoklonalt antistoff ble utarbeidet, ble brukt som første antistoff å farge 50 par av prøver av mage kreft og kontrollere normale gastriske mukøse vev, og konjugert med fluorescerende magnetiske nanopartikler med 50 nm i diameter, ble de resulterende BRCAA1-konjugerte fluorescerende magnetiske nanoprobes karakterisert ved transmisjonselektronmikroskopi og photoluminescence spektrometri, ble så forberedt nanoprobes inkubert med magekreft MGC803 celler, og ble injisert i mus modell lastet med magekreft av 5 mm i diameter via halevenen, og deretter ble fotografert ved fluorescens optisk avbildning og magnetisk resonansavbildning, ble deres biodistribusjon undersøkt. De vevssnitt ble observert av fluorescerende mikroskopi, og de viktige organer som hjerte, lunge, nyre, hjerne og lever ble analysert med hematoxylin og eosin (HE) flekk metode.
Resultater
BRCAA1 monoklonalt antistoff ble med hell fremstilt, BRCAA1 protein utstilt over-uttrykk i 64% mage kreft vev, ingen uttrykk i kontroll normale mage slimete vev, det finnes statistisk forskjell mellom to grupper (P
< 0,01). Den BRCAA1-konjugert fluorescerende magnetisk nanoprobes utstillingen svært lav toksisitet, lavere magnetisk intensitet og lavere fluoriserende intensitet med peak-blå-shift enn rene FMNPs, kan endocytose av magekreft MGC803 celler, kunne målrette in vivo
mage kreft vev lastet av mus, og kan brukes til bilde mage kreft vev av fluorescerende bildebehandling og magnetic resonance imaging, og hovedsakelig i lokale mage kreft vev i 12 timer etter injeksjon. HE flekken analyse viste at ingen åpenbare skader ble observert i viktige organer.
Konklusjoner
Den høytytende BRCAA1 monoklonalt antistoff-konjugert fluorescerende magnetiske nanopartikler kan målrette in vivo
magekreftceller, kan brukes for samtidig magnetofluorescent bildebehandling, og kan ha et stort potensial i applikasjoner som dual-modell bildebehandling og lokal termisk behandling av tidlig magekreft i nær fremtid.
Bakgrunn
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP var en gang den nest vanligste kreftformen i ordet [1]. Opp til nå, i USA, er mage malignitet i dag den 14. vanligste kreft, og med 2. vanligste kreftformen i Kina [2, 3]. Magekreft er fortsatt den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden, og er fortsatt vanskelig å kurere fordi de fleste pasientene stede med avansert sykdom. Derfor, hvordan å gjenkjenne, spor eller drepe tidlig mage kreft celler er selve nøkkelen for tidlig diagnostisering og behandling av pasienter med magekreft.
Opp til dato, på jakt etter biomarkører tett forbundet med magekreft er fortsatt en viktig oppgave. Siden 1998 har vi vært å være forsøkt å etablere en tidlig magekreft pre-varslingssystem [4], og håper å bruke denne pre-varslingssystem for å oppdage tidlig mage kreft celler til å gjenkjenne pasienter med tidlig magekreft. Selv om noen annerledes-uttrykte gener assosiert med tidlig mage kreft ble identifisert [5, 6], kan ingen gen bekreftes å være spesifikk biomarkør for magekreft. Derfor, for å gjenkjenne tidlige magekreftceller, velger vi kun potensielle biomarkører forbundet med magekreft, og kombinere nanopartikler og molekylær imaging teknikker, prøve å finne in vivo
tidlig mage kreft celler ved in vivo
svulst målrettet bildebehandling . I vårt tidligere arbeid, vi vist ut og klonet BRCAA1 gen (brystkreft assosiert antigen 1 genet) fra brystkreftcellelinje MCF-7cells [AF208045, også kalt ARID4B (AT-rik interaktiv domene som inneholder protein 4B)], og identifisert sitt antigen epitop peptid SSKKQKRSHK [7, 8]. Vi har også fremstilt BRCAA1 polyklonalt antistoff, og observert at BRCAA1 protein oppviste over-ekspresjon i nesten 65% kliniske prøver av magekreft vev [9-11]. Vi har også observert at BRCAA1 antigenet er over-uttrykt i mage cancer-cellelinjer så som MKN-1 MKN-74, SGC-7901, KATO-III og MGC803 celler. Derfor vi spår at BRCAA1 protein kan være en potensiell målgruppe molekyl for in vivo
magekreftceller.
I de senere årene har molekylær imaging teknologi basert på multi-funksjonelle nanoprobes gjort store fremskritt. For eksempel har nanopartikler som kvanteprikker, magnetiske nanopartikler og gull nanorods etc. blitt brukt i molekylær avbildning [12-19]. Så langt flere små dyr imaging teknologi har blitt utviklet som optisk imaging (OI) av bioluminesens (BLI), fluorescens (FLI) og intravital mikroskopi (IVM), micro-PET, MR og CT [20-26]. Blant alle disse teknologiene, hvordan å forbedre deres romlige oppløsning og vev dybde sensitivitet er en stor utfordring. Hittil in vivo
tumorvev med over 1 cm i diameter kan lett identifiseres ved CT, MRI, PET og bioluminescens avbildning, tumorer med mindre enn eller lik 5 mm i diameter er meget vanskelig å finne i kliniske pasienter. I våre tidligere rapporter, ble fotosensibilisator-konjugerte magnetiske nanopartikler med hell brukes for in vivo
samtidig magnetofluorescent avbildning og terapi målretting [27]. Men den måls evne nanoprobes var svært avhengig av magnetiske nanopartikler. Vi har også utarbeidet en multifunksjonell ribonuklease-A-konjugert CdTe quantum dot klynge nanosystem for synkron kreft bildebehandling og terapi [28], er rettet mot evnen som forberedt nanoprobes avhengig RGD peptid. Noen studier viser at HER-2 proteinet utviser unormal ekspresjon i 6-35% gastrisk cancer vev [29, 30], og har vært brukt som den terapeutisk mål for kliniske pasienter med magekreft [31], derfor, eier HER-2 proteinet stort potensial i bildebehandling og behandling av magekreft. Men, oppdatert, viser ingen rapport som målrettet bildebehandling og terapi av in vivo
magekreft er basert på biomarkører forbundet med magekreft.
I de senere årene har vi styr forberedt silika-belagt kvanteprikker og super-paramagnetisk nanopartikkel kompositter (FMNPs) med sterke fluorescerende signaler og gode magnetiske egenskaper, og har brukt dem for bio-merking, sporing stamceller, bio-separasjon, målretting bildebehandling og hypertermi av svulster [29-32], vi også observert at så forberedt nanopartikler eier god avlastning og stabilitet [33-38].
I denne artikkelen har vi fullt bruke fordelene ved FMNPs og BRCAA1 antigen, forberedt monoklonalt antistoff mot BRCAA1 protein, og forberedt BRCAA1 monoklonalt antistoff-konjugert fluorescerende magnetiske nanoprobes (BRCAA1- FMNPs), ansatt hårløse mus modell lastet med magekreft av 5 mm i diameter og IVIS Imaging system og Magnetic Resonance Imaging, undersøkte muligheten for så forberedt nanoprobes for ikke-invasiv in vivo
målrettet dual modal avbildning av magekreft. Resultatene viser at så forberedt nanoprobes kan brukes til in vivo
dual-modell avbildning av magekreft, og kan ha et stort potensial i applikasjoner som dual-modell bildebehandling og lokal termisk behandling av tidlig magekreft i nær fremtid.
diskusjon
Karakterisering av anti-BRCAA1 monoklonalt antistoff
Resultater og Som vist i tabell 1, hell fikk vi to positive klone cellelinjer S-200-5 og S-335-5, deres titere var annerledes, endelig vi valgte anti-BRCAA1 monoklonalt antistoff fra S-200-5 cellelinje som den første antistoff å farge mage kreft vev og kontroll vev. Vi fant at BRCAA1 protein oppviste over-ekspresjon i 64% magekreft vev, ingen ekspresjon i normale kontroll gastriske mukøse vev, slik som vist i figur 1, foreligger det statistisk forskjell mellom to gruppe (P
< 0,01). Dette resultatet er nesten identisk med vår forrige rapport [4, 9-11], som anbefaler at BRCAA1 antigen kan velges som potensielt mål for de fleste magekreft, hvis så forberedt nanoprobes kan gjenkjenne 64% av pasienter med tidlig magekreft, det vil være svært nyttig for diagnostisering og behandling av kliniske magekreft patients.Table 1 titer av BRCAA1 monoklonale antistoffer i ascitesvæske indusert av hybrid Clone Celler med ELISA

antistofftiter *
Clone
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) -BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1.024.000
1.024.000
< 1000
< 1.000
S-335- 5
128000
512000
< 1000
< 1000 product: * den gjensidige ascitesvæske fortynning, den første fortynning av ascitesvæske var 1:. 1000
** Antigenene ble belagt på ELISA-plate.
Figur 1 Expression of BRCAA1 protein i magekreft vev og normal kontroll mage slimete vev. A: magekreft vev, x 100; B: normale kontroll vev, × 50.
Utarbeidelse og karakterisering av BRCAA1- FMNPs nanoprobes
Som vist i figur 2A, preparerte FMNPs var sammensatt av silika-innpakket CdTe og magnetiske nanopartikler, deres størrelse var 50 nm eller så i diameter. Som vist i figur 2D, etter FMNPs ble konjugert med anti-BRCAA1 antistoff, som preparerte nanoprobes 'photoluminescence (PL) intensitet var lavere enn den til FMNPs, oppviser venstre-forskyvning på 40 nm, noe som skyldes reduksjon av polarisasjonen hastighet av de omkringliggende molekylene, og som resulterer i reduksjon av Stokes forskyvning, til slutt resulterer i et blått skift i emisjonsspektra. Tilsvarende magnetisk intensitet som forberedt nanoprobes var også lavere enn FMNPs. Figur 2 Karakterisering av anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes. A: HR-TEM bilde av FMNPs; B: Magnetic eiendom av anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes; C: Zeta-potensialet av FMNPs med aminogruppen, COOH, Si-O-gruppe; D:. PL spektra av FMNPs konjugert med og uten BRCAA1 antistoff
I løpet av forbereder BRCAA1-FMNPs nanoprobes, fant vi at overflaten funksjonalisering av FMNPs var selve nøkkelen å bøye anti-BRCAA1 antistoff med FMNPs via kovalent binding. Som vist i figur 2C, forskjellige funksjonelle grupper i FMNPs har forskjellige zeta-potensial verdier. FMNPs hadde negativ Si-O-gruppen, deres Zeta-potensialet verdien var -34,05 mV, de FMNPs med amino gruppen hadde positiv zeta-potensial på 24,80 mV, FMNPs med karboksylgruppe hadde negativ zeta-potensial på -30,50 mV. Vi har observert at karboksylgrupper på overflaten av FMNPs konjugert med anti-antistoff BRCAA1 enklere enn aminogrupper på overflaten av FMNPs. Som vist i tabell 2, den gjennomsnittlige kobling frekvensen av anti-BRCAA1 antistoff med FMNPs-COOH var 80,28% .table 2 Kobling måling av FMNPs-anti-BRCAA1 antistoff

Total konsentrasjon av anti-BRCAA1 antistoff (ng /ul)
konsentrasjonen av anti-BRCAA1 antistoff i gjenværende reaksjonsblanding (ng /ul)
Coupling hastighet (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Som forberedt nanoprobes for in vitro
målrettet magekreftceller
målretting evne som forberedt nanoprobes in vitro
ble observert av fluorescens mikroskop og beregnet av FACSCalibur strømningscytometer. Som vist i figur 3, FMNPs tilfeldig dispergert i det indre av cytoplasma, og anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes eksisterte rundt kjerne. Begge FMNPs og oppkjørte BRCAA1-FMNPs nanoprobes kan gå inn i cytoplasma av MGC803 celler etter 4 timers inkubering med MGC803 celler, som vist i figur 4A, FMNPs kunne merke 25,23% MGC803 celler, forblir 74.77% celler kunne ikke merkes. Som vist i figur 4B, 45,92% MGC803 celler kunne merkes ved BRCAA1-FMNPs nanoprobes. Når FMNPs og anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes ble henholdsvis inkubert med MGC803 celler og menneskelige fibroblast celler for 0,5 time, observerte vi en masse anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes inngått MGC803 celler, noen nanoprobes inngått menneskelige fibroblast celler, noen FMNPs kunne inngå MGC803 celler og menneskelige fibroblast celler, som sterkt antyder at anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes kan målrette MGC803 celler spesielt. The Magnetic Resonance Imaging av MGC803 celler og menneskelige fibroblast celler inkubert med anti-BRCAA1-FMNPs for 4 h ble vist i figur 5, MGC803 celler viste sterk magnetisk signal enn menneskelige fibroblast celler (HDF), som også viste at de forberedte nanoprobes kan målrette MGC803 celler spesielt. Figur 3 In vitro fluorescens bilder av MGC 803 etter behandlet med FMNPs og FMNPs-BRCAA1 nanopartikler (Forstørrelse = × 200). Den øverste gruppe av bilder illustrert FMNPs tilfeldig fordele i cytoplasma, bunnen gruppe med bilder utstilt FMNPs-BRCAA1 spredt rundt kjerne og hadde vel målretting evne til MGC803.
Figur 4 FACSCalibur Flowcytometer analyse av MGC803 merket med FMNPs og FMNPs-BRCAA1. A: den MGC803 behandlet med 50 ug /ml av FMNPs i 24 timer utviste 25,23% celle ble merket med FMNPs. B: den MGC803 behandlet med 50 ug /ml av FMNPs-BRCAA1 i 24 timer illustrert opp til 45,92% celle ble merket med FMNPs-BRCAA1
Figur 5 MR avbildning av MGC803 celler og HDF-celler.. A: MGC803 celler med anti-BRCAA1-FMNPs. B: HDF celler med anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 celler med bare FMNPs
Som forberedt nanoprobes for fluorescerende avbildning av in vivo
magekreftceller
å evaluere tumor målrettede egenskapene til anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, nakne mus-modeller lastet med MGC- 803 magekreftceller ble utarbeidet og overvåkes under en ikke-invasiv måte i 12 timer ved hjelp av IVIS fluorescens imaging system.
ved å overvåke i sanntid fluorescens intensitet i hele kroppen, svulst målretting karakter av anti-BRCAA1- FMNPs sonde ble lett bestemmes i det nakne mus lastet med magekreft MGC803 celler. Som vist i figur 6A, i hele dyr produsert fluorescente signalene innen 30 min post-injeksjon av nanoprobes, de subkutane tumorvev kunne klart avgrenset fra det omgivende bakgrunn vevet mellom 1 time og 12 timer etter injeksjon, med maksimal kontrast som forekommer ved 6 timer etter injeksjonen. Sterk fluorescens signal ble fortsatt påvises i tumorstedet på 6 timer etter injeksjon, noe som indikerte at anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes ble fortrinnsvis akkumulert i tumorvev. Faktisk basert på resultatene i figur 6B, jo høyere svulsten til bakgrunnen ratio (TBR) verdi svært foreslått at så forberedt nanoprobes fortrinnsvis akkumulert i tumorvev i forhold til normale kontroll vev. Dette ble bekreftet i fluorescens bilder, som viste at det fluorescens-signalet av as-fremstilt nanoprobes i tumorstedet var sterkest blant alle muse organer som vist i figur 6C. I tillegg, etter 12 timer etter injeksjon av anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, fluorescens intensitet i tumor ble likevel observert tydelig, mens opptaket av preparerte nanoprobes i normale organer var ikke opplagt. Disse dataene anbefaler at forberedt nanoprobes kan målrette svært effektivt tumorvev inne nakne mus lastet med magekreft. Vi har også observert at de nanoprobes i hele musa kroppen nesten helt forsvunnet i 12 timer etter injeksjon, vi også oppdaget de nanoprobes gått ut fra cholecyst system (data ikke vist), den tidsavhengige cholecyst clearance av nanoprobes svært foreslår at så som ble fremstilt nanoprobes kan ikke bo inne hårløse mus for lengre tid, og dermed, som forberedt nanoprobes eier god bio-sikkerhet. Figur 6 In vivo fluorescens bilder av svulsten opphopning og distribusjon vev for FMNPs-BRCAA1 nanopartikler i MGC803 menneskelige mage tumorbærende atymiske nakne mus. A, In vivo
fluorescens bilder av atymiske nakne mus med. MGC803 human gastrisk tumor ble oppnådd etter injeksjon av FMNPs-BRCAA1 nanopartikler ved forskjellig tidspunkt. Svulsten plassering er angitt med en pil. A-1: 0 t, A-2: 0,5 t, A-3: 1 t, A-4: 3 t, A-5: 6 timer, A-6: 12 timer. B, TBR [Tissue til bakgrunnen (muskel) ratio] verdi. Den TBR-verdien ble bestemt som følger: TBR = (Tumor signal-bakgrunnssignal) /(bakgrunnssignal). C, Ex vivo
fluorescens bilder av dissekerte organer og svulst i mus med MGC803 human mage tumor ofret på 12 timer etter injeksjon av FMNPs-BRCAA1 nanopartikler. Fluorescens bilder av dissekert organer og tumor ble oppnådd ved anvendelse av en fluorescens avbildningsteknikk med et 630 nm emisjonsfilter. D, Biofordeling av anti BRCAA1-FMNPs hos mus etter intravenøs injeksjon. Flere tidspunkter etter injeksjonen, ble jernmengder i vevsprøver evaluert ved ICP massespektrometri (n = 3).
Patologisk analyse av tumor og viktige organer
In vitro-evalueringen av
utskårende store vev innbefattende lever, lunge , milt, nyre og hjerte, samt tumoren, viste at anti-BRCAA1-FMNPs prober var hovedsakelig opp-tas av tumorvev som utviste sterk fluorescens-signaler, slik det er vist på figur 7, mens det andre vev, inkludert leveren , lunge, milt og hjerte up-tok anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes meget mindre, noe som furtherly indikerer at så forberedt BRCAA1-FMNPs nanoprobes kan målrette mage kreft vev. Vi har også brukt HE flekker å sjekke alle organer, ble ingen åpenbare skader observert i viktige organer [se ekstra fil 1]. Figur 7 Resultat av Immunofluorescensanalyse. A, svulstvev. B, leveren. (Forstørrelse = × 200).
Som forberedt nanoprobes for MR avbildning av hårløse mus lastet med magekreft
In vivo
MR ble utført på hårløse mus lastet med subkutan magekreft på 12 timer etter injeksjon . Representative bilder av T2 kart er vist i figur 8, etter å injisere nanoprobes, ble en betydelig endring av signalintensiteten observert i noen regioner av tumorer, noe som indikerer at det forelå opphopning av nanoprobes i tumorsetet, som vist i figur 8B, som pilen viste. Som en kontroll, etter at musene modell med magekreft ble injisert FMNPs i 12 timer, ble musene utført MR-avbildning, som ikke viste intensiv signal i tumorområdet (figur 8A). Figur 8 MR-bilde av mus. A, FMNPs uten kobling BRCAA1 B, FMNPs kombinert med BRCAA1
mulig mekanisme for målretting bildebehandling
I de senere år, molekylære imaging teknologi har blitt brukt i sanntid og ikke-invasiv avbildning av in vivo
tumorvev [39-43]. For eksempel, kvanteprikker, på grunn av deres unike lysende egenskaper, har vært brukt i bio-merking og fluorescerende bildebehandling [11-13, 33, 43], men kvanteprikker 'toksisitet begrenset deres anvendelse i menneskekroppen, så langt noen trygg quantum prikker er under utvikling. Magnetiske nanopartikler er også blitt anvendt som kontrast reagens for MR-avbildning [15, 33, 36]. På samme tid, kombinasjon av to bildediagnostikk gir fordelene ved både å bruke en fremgangsmåte som ville gi fullstendig informasjon om tumorlokalisering, miljø, og status.
I denne studien vi utformet og fremstilt en ny avbildning sonde, som var sammensatt av silisium innpakket kvanteprikker og magnetiske nanopartikler med sikte på å øke deres biokompatibilitet. Våre resultater viser at oppkjørte silisium innpakket kvanteprikker og magnetiske nanopartikler er veldig stabil, og egne sterke fluorescerende signaler og magnetisk intensitet. Ved hjelp av de sterke fluorescente signalene av as-fremstilt nanoprobes, vi med hell oppnådd de fluorescerende bilder av in vivo-
magekreft vev med 5 mm i diameter i nakne mus-modellen. Ved hjelp av sterke magnetiske signaler om så forberedt nanoprobes, vi også med hell oppnådd MR-bilder av in vivo-
magekreft vev med 5 mm i diameter i nakne mus-modellen. Sammenlignet med tidligere rapporter, større størrelse av tumorvev (mer enn 5 mm) kan lett bli fotografert ved hjelp av fluorescerende avbildning og MR-avbildning, som en kontrast, våre resultater viste at ubearbeidede nanoprobes kan oppdage mindre størrelse på tumorvev (mindre 5 mm i diameter), som markert forbedret sensitiviteten av påvisningsmetoden. Vårt resultat er også første gang til å rapportere dual-modal målretting avbildning av in vivo
mage kreft vev.
Hvordan målrette in vivo
mage kreft vev er også en challenge problem. Opp til nå, ble ingen spesifikke magekreft biomarkører rapportert. Selv om HER-2 protein ble bekreftet å ha positiv ekspresjon i 6-35% av magekreft vev [28-31], HER-2-proteinet oppviser også over-ekspresjon i mange tumorvev som brystkreft, lungekreft, tykktarmskreft, etc, derfor HER-2 bør ikke være spesifikk biomarkør for magekreft. Våre resultater viste at BRCAA1 antigenet er bare overuttrykt i 64% eller så av magekreft vev fra pasienter med kliniske kirurgi, vi også bekreftet at BRCAA1 antigen er overuttrykt i noen gastrisk cancer-cellelinjer så som MKN-1 MKN-74 , SGC-7901, KATO-III og MGC803 [6-9]. Vi brukte MGC803 celler til å forberede hårløse mus modell lastet med magekreft, og hell observert at så forberedt nanoprobes fortrinnsvis akkumulert i tumorvev sammenlignet med normale kontroll vev, og som etter injeksjonen tid økt. Vi observerte også at injisert nanoprobes i hele kroppen viste den tidsavhengige klaring og de fluorescente signalene gradvis reduseres etter hvert som den tiden som har gått på grunn av leveren-cholecyst utskillelse system og nyre klarhet som preparerte nanoprobes. Flere rapporter viste at nyre kun klare nanopartikler med 5 nm i diameter, i vår studie, observerte vi at så forberedt nanoprobes med 50 nm i diameter også kunne bli slettet innen 12 timer. Denne konkrete mekanismen er i gang.
Nanoprobe biosikkerhet er også et viktig problem [44], som avgjør søknaden utsiktene som forberedt nanoprobes. Våre resultater fullt viste at så forberedt nanoprobes ikke skade viktige organer, inkludert lever, nyre, hjerte, lunge, etc, også viste ikke langsiktig bor i viktige organer, som sterkt antyder at så forberedt nanoprobes eier god biokompatibilitet, og har stort potensial i applikasjoner som dual modell bildebehandling og selektiv behandling av tidlig magekreft.
Konklusjon
Vi lykkes utarbeidet en roman anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, som kan brukes for in vivo
to modal bildebehandling slik som fluorescerende bildebehandling og magnetisk resonans imaging, og eier en åpenbart bestemt målgruppe evne mot en mage kreft vev med 5 mm i diameter under 0,5 timer og 12 timer av post-injeksjon, og eget beste biokompatibilitet. Dette bør være første rapporten. De som forberedt multifunksjonelle nanoprobes også kan brukes til hypertermi behandling av magekreft i henhold til in vitro
vekslende magnetfelt bestråling, og har stort potensial i applikasjoner som samtidig bildebehandling og målretting behandling av klinisk magekreft i nær fremtid.
Materiale og metode
Utarbeidelse av anti-BRCAA1 monoklonale antistoffer
Dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjer for Animal Care og bruk Committee, Shanghai Jiao Tong University. Monoklonale antistoffer ble fremstilt mot et renset fusjonsprotein BRCAA1. BALB /c hunnmus, 4-6 uker gamle, ble kjøpt fra Shanghai LAC Forsøksdyr Co Ltd, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Musene ble immunisert ved intraperitoneal injeksjon med 50 ug renset BRCAA1 protein som ble emulgert med et likt volum av Freunds fullstendige adjuvans. Tre ytterligere injeksjoner ble administrert ved hjelp av ufullstendige adjuvans annenhver uke. Tre dager etter siste injeksjon, ble miltceller fra musene høstet og smeltet sammen med den Sp 2/0 musemyelom-cellelinje. Etter 10-14 dager ble kultursupernatantene undersøkt med en ELISA-test, hvor den faste fase ble belagt med det rekombinante BRCAA1 protein (2 mg /ml) anvendt for immunisering. I screening prosessen, til de monoklonale antistoffer bindes med belagt BRCAA1 protein, ble utvalgt. Ved to ganger begrensende fortynning, ble positive kolonier subklonet. Ascitisfluider ble høstet fra mus primet med en 0,5 ml intraperitoneal injeksjon av Pristane og deretter injisert med 10 6 hybridomceller. Klasse og underklasse av hvert mAb ble bestemt ved hjelp av et monoklonalt antistoff isotyping kit (Hy Cult Bioteknologi B.V., Nederland). De mAb ble renset fra muse asket fluider ved anvendelse av en protein G-Sepharose 4FF (Pharmacia, Uppsala, Sverige) kolonne i henhold til produsentens instruksjoner for å fjerne komponenter som kan interferere med biopanning eksperimenter. De antistoff-titere ble bestemt ved ELISA-metoder [45]. Endelig en av preparerte anti-BRCAA1 monoklonale antistoffer ble brukt som første antistoff å farge 50 eksemplarer av magekreft og kontrollere mage slimete vev, som ble samlet inn fra Changzheng Hospital og No.1 People Hospital i Shanghai og identifisert ved patologisk undersøkelse.
Utarbeidelse og Surface funksjon av FMNPs
Utarbeidelse av Fe 3o 4 nanopartikler var basert på co-utfelling av jern og treverdig ion løsninger (1: 2 molar ratio) [46-49]. CdTe nanokrystaller ble syntetisert som følger i henhold til vår tidligere rapport: CdCl 2 (5 mmol) ble oppløst i 110 ml vann, og 12 mmol av TGA ble tilsatt under omrøring, etterfulgt av justering av pH til 11 ved dråpevis tilsetning av 1 M NaOH-løsning. Den blandede løsning ble plassert i en tre-halset kolbe luftes ved N 2 bobling i 30 min. Under omrøring ble 2,5 mmol av oksygenfritt NaHTe oppløsningen ble injisert inn i tre-halset kolbe, som var nyfremstilt fra tellur pulver og NaBH 4 (molar hastighet på 1: 2) i vann ved 0 ° C. Den resulterende løsning var ca. 4 mg /ml, og 3,5 nm diameter produkt slippes ut med et maksimum rundt 630 nm. Fluorescent magnetiske nanopartikler (FMNPs) ble fremstilt ved bruk av omvendt mikroemulsjon tilnærming. Før kobling av FMNPs med BRCAA1, vi først funksjonalisert overflate funksjonell gruppe av FMNPs som karboksylgruppe. 95 ml etanol og 2 ml 3-aminopropyltriethoxysilan (APS) ble tilsatt for å danne en blandet oppløsning og tillatt å reagere ved romtemperatur i 24 timer. Aminosilanen-modifiserte FMNPs ble separert ved permanent magnet og ble vasket med deionisert vann tre ganger. Deretter redispergert den FMNPs-NH 2 i 100 ml dimetylformamid (DMF), tilsettes overdreven ravsyreanhydrid for å danne en blandet oppløsning og reagere ved romtemperatur i 24 timer. De karboksyl-modifiserte FMNPs ble separert ved permanent magnet på nytt og vasket med deionisert vann tre ganger.
Fremstilling og karakterisering av BRCAA1 antistoff-konjugert FMNPs
Vi brukte to-trinns prosess for å oppnå stabil anti-BRCAA1-FMNPs konjugasjon [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg FMNPs-COOH oppløsning ble dispergert i 2 ml pH 7 PBS-buffer, og ble sonikert i 10 min. Deretter blandet vi 1 ml av frisk 400 mM EDC og 100 mM NHSS i pH 6,0 MES-buffer og roteres den ved romtemperatur i 15 min. Etter dette, ble den resulterende oppløsningen fraskilt ved magnetiske felt og 1 mg /mL BRCAA1 monoklonalt antistoff ble tilsatt til blandingen ovenfor, omrørt i mørkt sted i 2 timer. For å fjerne fritt BRCAA1, ble den gjenværende reaksjonsblandingen separert ved magnetfelt og den gjenværende faste stoff ble vasket med 1 ml PBS-buffer tre ganger. Til slutt, 1 ml 0,05% Tween-20 /PBS ble tilsatt til BRCAA1-FMNPs konjugering og den endelige bio-konjugering ble lagret ved 4 ° C. Når vi brukes, bør dette BRCAA1-FMNPs konjugering fortynnes med PBS /0,05% Tween-20. Så vi brukte Nano Drop-enheten for å kvantifisere koblingen frekvensen av BRCAA1 antistoff med FMNPs-COOH. Før koblingsreaksjon, målte vi den totale konsentrasjon av BRCAA1 antistoff. Etter kobling reaksjon, målte vi BRCAA1 antistoff-konsentrasjonen i restreaksjonsblandingen og beregnet koblingshastigheten i henhold til ligning:
Coupling (%) = (1-Konsentrasjon av BRCAA1 antistoff i gjenværende reaksjonsblanding /Total konsentrasjon av BRCAA1 antistoff) x 100. Bedrifter Den som forberedt nanoprobes og rene FMNPs ble preget av transmisjonselektronmikroskopi og photoluminescence (PL) spektrometri, og Zeta potensial analysator.
nanoprobes for in vitro
rettet mot avbildning av magekreftceller
gastrisk kreft cellelinje MGC803 celler med over-uttrykte BRCAA1 protein, ble anvendt som målceller, humane fibroblastceller uten uttrykte BRCAA1 protein ble anvendt som kontroll, ble dyrket og oppsamles, og deretter ble behandlet med 50 ug /ml BRCAA1-FMNPs nanoprobes og dyrket i en fuktet 5% CO to balanserte luftinkubator ved 37 ° C i 4 timer, i mellomtiden den MGC803 og humane fibroblast-celler ble behandlet med FMNPs som kontrollgruppen. Etterpå ble cellene renset med PBS tre ganger, og deretter fikserte celler med 2,5% glutaraldehyd-løsning i 30 min. For atomkontra, ble MGC803 inkubert med 1 mM Hoechst 33258 i PBS i 5 min. Cellene ble observert av fluorescens mikroskop (NIKON TS100-F), og avbildes ved GE HDX 3.0T MR instrument utstyrt med ParaVision 3.0-programvaren.
Vi brukte også strømningscytometeret å vurdere magekreft celle målretting evne BRCAA1- FMNPs nanoprobes.

• Deep sekvensering av magekreft avslører somatiske mutasjoner som er relevante for personlig medicine
• BariSurg prøve: Sleeve gastrektomi versus Roux-en-Y gastrisk bypass hos overvektige pasienter med BMI 35-60 kg /m2 - en multisenter, randomisert pasient og observatør blind non-inferiority trial