BRCAA1 anticorpo monoclonale coniugato nanoparticelle magnetiche fluorescenti per imaging in vivo magnetofluorescent mirata del cancro gastrico

BRCAA1 anticorpo monoclonale coniugato nanoparticelle magnetiche fluorescenti per l'imaging in vivo
magnetofluorescent mirata del cancro gastrico
Abstract
sfondo
cancro gastrico è 2 ° tumore più comune in Cina, ed è ancora la seconda causa più comune di cancro la morte -related nel mondo. Come riconoscere cellule di cancro gastrico precoce è ancora una grande sfida per la diagnosi precoce e la terapia dei pazienti con cancro gastrico. Questo studio ha lo scopo di sviluppare un tipo di nanosonde multifunzionali per in vivo
di mira l'imaging magnetofluorescent di cancro gastrico.
Metodi
BRCAA1 anticorpo monoclonale è stato preparato, è stato utilizzato come primo anticorpo per colorare 50 coppie di esemplari di gastrico cancro e controllare normali mucose gastriche, e coniugato con nanoparticelle magnetiche fluorescenti con 50 nm di diametro, le nanosonde magnetici fluorescenti BRCAA1 coniugato risultanti sono stati caratterizzati da microscopia elettronica a trasmissione e fotoluminescenza spettrometria, nanosonde come preparati sono state incubate con cancro gastrico MGC803 cellule, e sono state iniettate in topi modello caricato con cancro gastrico di 5 mm di diametro via vena della coda, e poi sono stati ripresi da imaging ottico a fluorescenza e la risonanza magnetica, la loro biodistribuzione è stata studiata. Le fette di tessuto sono stati osservati al microscopio a fluorescenza, e gli organi importanti come cuore, polmone, rene, cervello e il fegato sono stati analizzati con ematossilina e il metodo macchia eosina (HE).
Risultati
anticorpo monoclonale BRCAA1 è stato preparato con successo, proteine ​​BRCAA1 esposto sovra-espressione nel 64% dei tessuti di cancro gastrico, nessuna espressione nel controllo normali mucose gastriche, esiste differenza statistica tra due gruppi (P
< 0,01). La fluorescente magnetica nanosonde mostra BRCAA1 coniugato bassissima tossicità, minore intensità magnetica e l'intensità fluorescente inferiore con picco-blu-shift di FMNPs puri, potrebbe essere endocitato da cancro gastrico MGC803 cellule, potrebbe avere come bersaglio in vivo
gastrici tessuti tumorali caricati dai topi, e potrebbe essere utilizzato per immagini tessuti di cancro gastrico mediante imaging a fluorescenza e la risonanza magnetica, e distribuiti principalmente nei tessuti di cancro gastrico locali entro 12 ore dopo l'iniezione. HE macchia analisi ha mostrato che nessun danno evidenti sono stati osservati in organi importanti.
Conclusioni Aziende Il BRCAA1 monoclonali nanoparticelle magnetiche fluorescenti anticorpo-coniugato ad alte prestazioni può avere come bersaglio in vivo
cellule di cancro gastrico, può essere utilizzato per magnetofluorescent simultanea immagini, e può avere un grande potenziale in applicazioni quali l'imaging dual-modello e la terapia termica locale del cancro gastrico precoce nel prossimo futuro.
Sfondo
cancro gastrico era una volta il secondo tumore più comune nella parola [1]. Fino ad oggi, negli Stati Uniti, tumore maligno allo stomaco è attualmente il 14 ° tumore più comune, e 2 ° più comune di cancro in Cina [2, 3]. cancro gastrico è ancora la seconda causa più comune di morte per cancro nel mondo, e rimane difficile da curare perché la maggior parte dei pazienti si presentano con malattia avanzata. Pertanto, come riconoscere, traccia o uccidere le cellule di cancro gastrico precoce è molto fondamentale per la diagnosi precoce e la terapia dei pazienti con cancro gastrico.
Fino ad oggi, alla ricerca di biomarcatori strettamente legate con cancro gastrico è ancora un compito importante. Dal 1998, siamo stati in fase cercato di stabilire un sistema gastrico precoce del cancro pre-allarme [4], e la speranza di utilizzare questo sistema di pre-allarme per rilevare cellule di cancro gastrico primi a riconoscere i pazienti con cancro gastrico precoce. Anche se sono stati individuati alcuni geni espressi in modo diverso-associati al cancro gastrico precoce [5, 6], non un gene può essere confermata come biomarker specifico del cancro gastrico. Pertanto, al fine di riconoscere le cellule di cancro gastrico precoce, si sia scelto solo potenziali biomarcatori associati con il cancro gastrico, e combinare le nanoparticelle e le tecniche di imaging molecolare, cerchiamo di trovare in vivo
prime cellule di cancro gastrico in vivo
tumore mirato di imaging . Nel nostro precedente lavoro, abbiamo proiettato fuori e gene BRCAA1 clonato (cancro al seno associato antigene 1 gene) da linea di cellule di cancro al seno MCF-7cells [AF208045, chiamato anche ARID4B (interattivo 4B proteina dominio contenenti AT-ricchi)], e identificarono la sua antigene epitopo peptide SSKKQKRSHK [7, 8]. Abbiamo anche preparato BRCAA1 policlonale, e osservato che la proteina BRCAA1 esposto sovra-espressione in quasi il 65% campioni clinici di tessuti di cancro gastrico [9-11]. Abbiamo anche osservato che BRCAA1 antigene è sovra-espresso in linee cellulari di cancro gastrico, come MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO-III e MGC803 cellule. Pertanto, si prevede che la proteina BRCAA1 può essere una potenziale molecola di targeting per in vivo
cellule di cancro gastrico.
Negli ultimi anni, le tecnologie di imaging molecolare basate su nanosonde multifunzionali hanno fatto grandi progressi. Ad esempio, le nanoparticelle, quali punti quantici, nanoparticelle magnetiche e nanorods oro, ecc sono stati utilizzati per l'imaging molecolare [12-19]. Finora molti piccoli tecnologie di imaging animale sono stati sviluppati come l'imaging ottico (OI) di bioluminescenza (BLI), la fluorescenza (FLI) e della microscopia intravitale (IVM), micro-PET, risonanza magnetica e TC [20-26]. Tra tutte queste tecnologie, come migliorare la loro risoluzione spaziale e sensibilità la profondità dei tessuti è una grande sfida. Finora in vivo
tessuti tumorali con oltre 1 cm di diametro possono essere facilmente identificati da CT, MRI, PET e di imaging bioluminescenza, tumori con inferiore o uguale a 5 mm di diametro è molto difficile da trovare nei pazienti clinici. Nelle nostre precedenti relazioni, nanoparticelle magnetiche fotosensibilizzante coniugato sono stati utilizzati con successo per in vivo
simultanea magnetofluorescent l'imaging e il targeting terapia [27]. Tuttavia, la capacità selettiva di nanosonde era fortemente dipendente nanoparticelle magnetiche. Abbiamo anche preparato un multifunzionale ribonucleasi-A-coniugato CdTe quantum dot gruppo nanosistema per l'imaging del cancro sincrono e la terapia [28], la capacità di targeting di nanosonde come preparati dipende peptide RGD. Alcuni studi dimostrano che proteina HER-2 mostra l'espressione anormale in 6-35% tessuti tumorali gastrica [29, 30], ed è stato usato come bersaglio terapeutico per i pazienti con cancro gastrico clinici [31], di conseguenza, proteina HER-2 possiede un grande potenziale per l'imaging e la terapia del cancro gastrico. Tuttavia, fino ad oggi, nessun rapporto mostra che l'imaging e la terapia mirata dei vivo
cancro gastrico in si basa sui biomarcatori associati al cancro gastrico.
Negli ultimi anni, abbiamo preparato in modo controllabile punti quantici di silice rivestite e super-paramagnetica compositi nanoparticelle (FMNPs) con segnali fluorescenti forti ed eccellenti proprietà magnetiche, e li hanno utilizzati per la bio-etichettatura, il monitoraggio di cellule staminali, bio-separazione, il targeting imaging e ipertermia dei tumori [29-32], abbiamo anche osservato che, come preparata nanoparticelle possiedono una buona biocompatibilità e la stabilità [33-38].
In questo lavoro, utilizziamo pienamente i vantaggi di FMNPs e dell'antigene BRCAA1, preparato anticorpo monoclonale contro la proteina BRCAA1, e si preparò BRCAA1 monoclonali nanosonde magnetici fluorescenti anticorpo coniugato (BRCAA1- FMNPs), impiegato modello di topi nudi caricato con cancro gastrico di 5 mm di diametro e sistema di imaging IVIS e risonanza magnetica, ha studiato la fattibilità di nanosonde come preparati per non invasiva in vivo
mirato l'imaging a doppia modale del cancro gastrico. I risultati mostrano che nanosonde come preparati possono essere utilizzati per l'imaging in vivo
dual-modello del cancro gastrico, e possono avere un grande potenziale in applicazioni quali l'imaging dual-modello e la terapia termica locale del cancro gastrico precoce nel prossimo futuro.
Risultati e discussione
Caratterizzazione di anti-BRCAA1 anticorpo monoclonale
Come indicato nella tabella 1, abbiamo ottenuto con successo due positivi linee cellulari clone S-200-5 e S-335-5, i loro titoli erano diverse, finalmente abbiamo selezionato l'anticorpo monoclonale anti-BRCAA1 dalla linea cellulare S-200-5 come il primo anticorpo di macchiare gastrica tessuti tumorali e tessuti di controllo. Abbiamo scoperto che la proteina BRCAA1 esposto sovraespressione nel 64% dei tessuti di cancro gastrico, nessuna espressione nel controllo normale mucose gastriche, come mostrato in Figura 1, esiste differenza statistica tra due gruppi (P
< 0.01). Questo risultato è quasi identico al nostro precedente relazione [4, 9-11], che altamente suggeriscono che l'antigene BRCAA1 può essere selezionato come potenziale obiettivo per tumore più gastrico, se come preparati nanosonde possono riconoscere 64% pazienti con cancro gastrico precoce, sarà molto utile per la diagnosi e la terapia del cancro gastrico clinici patients.Table 1 I titoli di BRCAA1 anticorpi monoclonali in liquido ascitico indotta da cellule di ibridoma Clone da ELISA

titolo anticorpale *
Clone
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) -BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1.024.000 1.024.000

< 1.000
< 1.000
S-335- 5
128.000
512.000
< 1.000
< 1.000
* il reciproco di ascite diluizione del liquido, la prima diluizione del liquido ascitico è stato di 1: 1.000.
** Gli antigeni sono stati rivestiti sulla piastra ELISA.
figura 1 espressione della proteina BRCAA1 nei tessuti di cancro gastrico e di controllo normale mucose gastriche. A: tessuti di cancro gastrico, × 100; B: tessuti normali di controllo, × 50.
preparazione e caratterizzazione di BRCAA1- FMNPs nanosonde
Come mostrato nella Figura 2A, FMNPs preparati erano composte di CdTe e magnetici nanoparticelle di silice-avvolto, le loro dimensioni erano 50 nm o giù di lì a diametro. Come mostrato in figura 2D, dopo FMNPs stati coniugati con anticorpi anti-BRCAA1, fotoluminescenza nanosonde as-preparato »(PL) Intensità era inferiore a quello di FMNPs, esibendo sinistra-shift di 40 nm, dovuta alla diminuzione del tasso di polarizzazione delle molecole circostanti, e la conseguente diminuzione di spostamento Stokes, infine con conseguente spostamento verso il blu negli spettri di emissione. Allo stesso modo, intensità magnetica di nanosonde come preparati era anche inferiore FMNPs. Figura 2 Caratterizzazione di nanosonde anti-BRCAA1-FMNPs. A: foto HR-TEM di FMNPs; B: proprietà magnetica di nanosonde anti-BRCAA1-FMNPs; C: Zeta-potenziale di FMNPs con gruppo amminico, COOH, gruppo Si-O; D:. PL spettri di FMNPs coniugati con e senza anticorpi BRCAA1
Nel corso della preparazione BRCAA1-FMNPs nanosonde, abbiamo scoperto che funzionalizzazione superficiale di FMNPs era molto chiave per coniugare anticorpo anti-BRCAA1 con FMNPs tramite legame covalente. Come mostrato nella Figura 2C, diversi gruppi funzionali di FMNPs hanno differenti valori zeta-potenziale. FMNPs aveva negativo Si-O-gruppo, il loro valore zeta-potenziale è stato -34,05 mV, le FMNPs con gruppo amminico hanno valore positivo zeta-potenziale di 24.80 mV, FMNPs con gruppo carbossilico avuto valore zeta-potenziale negativo del -30,50 mV. Abbiamo osservato che i gruppi carbossilici sulla superficie del FMNPs coniugate con anticorpi anti-BRCAA1 facile di gruppi amminici sulla superficie FMNPs. Come mostrato nella tabella 2, il tasso medio di accoppiamento di anticorpo anti-BRCAA1 con FMNPs-COOH era .table misurazione della frequenza 2 Accoppiamento 80.28% di FMNPs-anti-BRCAA1 anticorpi

concentrazione totale di anticorpo anti-BRCAA1 (ng /mL)
la concentrazione di anticorpi anti-BRCAA1 in miscela di reazione residua (ng /mL)
tasso di accoppiamento (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Come preparato nanosonde per in vitro
mirati cellule di cancro gastrico
Targeting capacità di nanosonde come preparati in vitro
sono stati osservati al microscopio a fluorescenza e calcolati da FACSCalibur Citometro di flusso. Come mostrato in figura 3, FMNPs dispersi casualmente nel interno del citoplasma, e anti-BRCAA1-FMNPs nanosonde esistevano attorno al nucleolo. Entrambi FMNPs e preparati BRCAA1-FMNPs nanosonde possono entrare nel citoplasma delle cellule MGC803 dopo 4 ore di incubazione con MGC803 cellule, come mostrato in figura 4A, FMNPs potrebbero etichettare 25.23% MGC803 cellule, il rimangono 74.77% cellule non potevano essere etichettati. Come mostrato in Figura 4B, 45.92% MGC803 cellule potrebbe essere etichettato dai BRCAA1-FMNPs nanosonde. Quando FMNPs e anti-BRCAA1-FMNPs nanosonde sono stati rispettivamente incubati con MGC803 cellule e cellule di fibroblasti umani per 0,5 ore, abbiamo osservato un sacco di anti-BRCAA1-FMNPs nanosonde entrati in MGC803 cellule, pochi nanosonde inseriti in cellule di fibroblasti umani, pochi FMNPs potrebbe entrare in MGC803 cellule e cellule di fibroblasti umani, altamente suggeriscono che l'anti-BRCAA1-FMNPs nanosonde possono indirizzare MGC803 cellule specificamente. La risonanza magnetica di MGC803 cellule e cellule di fibroblasti umani incubati con anti-BRCAA1-FMNPs per 4 ore sono stati mostrati in figura 5, MGC803 cellule esposte forte segnale magnetico rispetto alle cellule di fibroblasti umani (HDF), che ha anche mostrato che le nanosonde preparati possono indirizzare MGC803 cellule in particolare. Figura 3 in vitro fluorescenza immagini di MGC 803 dopo trattamento con FMNPs e nanoparticelle FMNPs-BRCAA1 (ingrandimento = × 200). Il gruppo di testa di immagini illustrate FMNPs casuale distribuire nel citoplasma, il gruppo inferiore delle immagini esposte FMNPs-BRCAA1 disperso in tutto il nucleolo e aveva ben mira capacità al MGC803.
Figura 4 FACSCalibur Citometro di flusso di analisi dei MGC803 marcato con FMNPs e FMNPs-BRCAA1. A: il MGC803 trattato con 50 mg /mL di FMNPs per 24 h esposte 25.23 cella% è stato etichettato con FMNPs. B: il MGC803 trattato con 50 mg /mL di FMNPs-BRCAA1 per 24 ore illustrati fino a 45.92% delle cellule sono stati etichettati con FMNPs-BRCAA1
Figura 5 RM di MGC803 cellule e cellule HDF.. A: MGC803 cellule con anti-BRCAA1-FMNPs. B: cellule HDF con anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 cellule con solo FMNPs
nanosonde per l'imaging fluorescente in vivo
cellule di cancro gastrico
Per valutare tumorali proprietà mirate di nanosonde anti-BRCAA1-FMNPs, modelli di topi nudi carichi di MGC- As-preparato 803 cellule di cancro gastrico sono stati preparati e monitorati in modo non invasivo per 12 ore utilizzando il sistema di imaging di fluorescenza IVIS.
monitorando intensità di fluorescenza in tempo reale in tutto il corpo, il carattere del tumore targeting del movimento anti-BRCAA1- sonda FMNPs era facilmente determinato nei topi nudi carichi di cancro gastrico MGC803 cellule. Come mostrato nella Figura 6A, gli animali interi prodotte segnali fluorescenti in 30 min di post-iniezione di nanosonde, tessuti tumorali sottocutaneo potrebbero essere delimitate chiaramente dal circostante sfondo tessuto tra 1 he 12 h dopo l'iniezione, con il massimo contrasto che si verificano a 6 ore dopo l'iniezione. Forte segnale di fluorescenza è stata ancora essere rilevato nel sito del tumore a 6 ore dopo l'iniezione, i quali hanno indicato che gli anti-BRCAA1-FMNPs nanosonde sono stati preferenzialmente accumulati nei tessuti tumorali. Infatti in base ai risultati della Figura 6B, maggiore tumore al valore del rapporto sfondo (TBR) altamente suggerito che nanosonde come preparato preferenzialmente accumula nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali di controllo. Ciò è stato confermato in immagini di fluorescenza, che hanno dimostrato che il segnale di fluorescenza di nanosonde come preparate nel sito del tumore era più forte tra tutti gli organi topi come illustrato nella Figura 6C. Inoltre, dopo 12 ore dopo l'iniezione di anti-BRCAA1-FMNPs nanosonde, intensità di fluorescenza nel tumore è stata ancora osservata chiaramente, mentre l'assorbimento di nanosonde preparati negli organi normali non era evidente. Questi dati suggeriscono che altamente nanosonde preparati possono indirizzare altamente efficiente tessuti tumorali all'interno topi nudi carichi di cancro gastrico. Abbiamo anche osservato che le nanosonde in tutto il corpo del mouse quasi completamente scomparsi a 12 ore dopo l'iniezione, abbiamo rilevato anche i nanosonde usciti fuori dal sistema colecisti (dati non riportati), il gioco colecisti tempo-dipendente di nanosonde altamente suggeriscono che, come nanosonde -Preparazioni non possono rimanere all'interno topi nudi per più tempo, in tal modo, come preparato nanosonde proprio bene bio-sicurezza. Figura 6 in vivo fluorescenza immagini di accumulazione tumore e distribuzione tissutale per le nanoparticelle FMNPs-BRCAA1 in MGC803 topi portatori di tumore gastrico umano atimici nudi. A, in vivo
fluorescenza immagini di topi nudi atimici cuscinetto. MGC803 tumore gastrico umano è stato ottenuto dopo l'iniezione di nanoparticelle FMNPs-BRCAA1 al diverso punto di tempo. La localizzazione del tumore viene specificato con una freccia. A-1: 0 h, A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 h, A-6: 12 h. B, TBR [tessuto di fondo (muscolare) Rapporto] Valore. Il valore TBR è stato determinato come segue: TBR = (Segnale-sfondo tumore) /(segnale di fondo). C, ex vivo
fluorescenza immagini di organi sezionati e tumore di topi con tumore gastrico MGC803 umana sacrificati a 12 ore dopo l'iniezione di nanoparticelle FMNPs-BRCAA1. Le immagini di fluorescenza di organi sezionati e tumore sono stati ottenuti utilizzando una tecnica di imaging di fluorescenza con un filtro di emissione 630 nm. D, Biodistribuzione di anti-BRCAA1 FMNPs nei topi dopo l'iniezione endovenosa. Diversi punti di tempo dopo l'iniezione, quantità di ferro in campioni di tessuto sono stati valutati mediante spettrometria di massa ICP (n = 3).
Analisi patologica di tumore e organi importanti
in vitro
valutazione dei grandi tessuti asportati, tra cui fegato, polmone , milza, rene e cuore, così come il tumore, indicato che l'anti-BRCAA1-FMNPs sonde erano principalmente up-presa dai tessuti tumorali, che esibivano forti segnali di fluorescenza, come mostrato in figura 7, mentre altri tessuti compresi fegato , polmone, milza e cuore up-prese anti-BRCAA1-FMNPs nanosonde molto meno, il che indica ulteriormente che, come preparato BRCAA1-FMNPs nanosonde possono indirizzare i tessuti di cancro gastrico. Abbiamo anche usato HE colorazione per controllare tutti gli organi, senza danni evidenti sono stati osservati in organi importanti [visualizzare ulteriori file di 1]. Figura 7 Risultato di Analisi di immunofluorescenza. A, tessuto tumorale. B, fegato. (Ingrandimento = × 200).
Nanosonde per MR Imaging di topi nudi carichi di cancro gastrico As-preparato
in vivo
RM è stato condotto su topi nudi caricato con cancro gastrico per via sottocutanea a 12 ore dopo l'iniezione . Immagini rappresentative di mappe T2 sono stati mostrati in figura 8, dopo aver iniettato i nanosonde, un cambiamento significativo dell'intensità di segnale è stato osservato in alcune regioni di tumori, indicando che esisteva accumulo dei nanosonde in sito tumorale come mostrato in Figura 8B, come la freccia ha mostrato. Come controllo, dopo il modello topi con carcinoma gastrico sono stati iniettati FMNPs per 12 h, i topi sono stati eseguiti RM, che non mostrano segnale intensivo dell'area tumorale (Figura 8A). Figura 8 immagine MRI di topi. A, FMNPs senza accoppiamento BRCAA1 B, FMNPs accoppiato con BRCAA1
potenziale meccanismo di colpire l'imaging
Negli ultimi anni, le tecnologie di imaging molecolare sono stati utilizzati in tempo reale e di imaging non invasivo in vivo
tessuti tumorali [39-43]. Ad esempio, i punti quantici, grazie alle loro proprietà fotoluminescenti uniche, sono stati utilizzati per la bio-etichettatura e l'imaging fluorescente [11-13, 33, 43], ma tossicità punti quantici 'limitato l'applicazione nel corpo umano, finora alcuni quantum sicuro punti sono in fase di sviluppo. nanoparticelle magnetiche sono state utilizzate anche come reagente di contrasto per RM [15, 33, 36]. Allo stesso tempo, combinazione di due modalità di imaging offre i vantaggi di entrambi rispetto all'utilizzo di un metodo, che avrebbe fornito informazioni complete sulla localizzazione del tumore, l'ambiente e lo stato.
In questo studio, abbiamo progettato e preparato una sonda di imaging romanzo, che era composta di punti quantici di silicio-avvolto e nanoparticelle magnetiche con l'obiettivo di migliorare la loro biocompatibilità. I nostri risultati mostrano che preparati punti quantici di silicio-avvolto e nanoparticelle magnetiche sono molto stabili, e proprio i segnali fluorescenti forti e intensità magnetica. Utilizzando i segnali forti fluorescenti di nanosonde come preparati, abbiamo ottenuto con successo le immagini fluorescenti in vivo
tessuti di cancro gastrico con 5 mm di diametro nel modello di topi nudi. Utilizzando i forti segnali magnetici di nanosonde come preparati, abbiamo anche ottenuto con successo immagini RM in vivo
tessuti di cancro gastrico con 5 mm di diametro nel modello di topi nudi. Rispetto alle precedenti relazioni, più grande dimensione di tessuti tumorali (> 5 mm) potrebbe essere facilmente immaginati utilizzando immagini a fluorescenza e di imaging MRI, come contrasto, i nostri risultati hanno dimostrato che, come preparati nanosonde in grado di rilevare più piccolo formato di tessuti tumorali (meno 5 mm di diametro), che notevolmente migliorata la sensibilità del metodo di rilevazione. Il nostro risultato è anche la prima volta a segnalare immagini di targeting dual-modale in vivo
tessuti di cancro gastrico.
Come bersaglio in vivo
tessuti di cancro gastrico è anche un problema impugnabile. Fino ad oggi, non sono stati segnalati specifici biomarcatori del cancro gastrico. Anche se proteina HER-2 è stato confermato di avere espressione positiva nel 6-35% dei tessuti di cancro gastrico [28-31], proteina HER-2 presenta anche over-espressione in molti tessuti tumorali come il cancro al seno, il cancro del polmone, cancro del colon, ecc, quindi HER-2 non deve essere biomarker specifico per il cancro gastrico. I nostri risultati hanno dimostrato che BRCAA1 antigene è solo sovraespresso nel 64% circa di tessuti di cancro gastrico da pazienti sottoposti a chirurgia clinica, abbiamo anche confermato che BRCAA1 antigene è sovra-espresso in alcune linee di cellule di cancro gastrico, come MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III e MGC803 [6-9]. Abbiamo usato MGC803 cellule per preparare modello di topi nudi caricato con cancro gastrico, e con successo osservato che nanosonde come preparato preferenzialmente accumula nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali di controllo, e come il tempo di post-iniezione aumentato. Abbiamo anche osservato che iniettato nanosonde in tutto il corpo esposte la clearance tempo-dipendente e segnali fluorescenti gradualmente diminuiti come il tempo trascorso a causa del sistema di escrezione fegato cholecyst e chiarezza reni di nanosonde come preparati. Diversi rapporti hanno mostrato che le nanoparticelle di rene solo chiare con 5 nm di diametro, nel nostro studio, abbiamo osservato che nanosonde come preparato con 50 nm di diametro potrebbe anche essere cancellata entro 12 h. Questo meccanismo di cemento è in corso.
Nanoprobe biosicurezza è anche un problema importante [44], che decide la prospettiva applicazione di nanosonde come preparati. I nostri risultati pienamente dimostrato che nanosonde come preparati non danneggiare gli organi importanti, tra cui il fegato, reni, cuore, polmoni, ecc, anche non esporre a lungo termine soggiorno in organi importanti, quali altamente suggeriscono che i preparati nanosonde possiedono buona biocompatibilità, e hanno un grande potenziale in applicazioni quali l'imaging modello duale e la terapia selettiva del cancro gastrico precoce.
Conclusione
Abbiamo preparato con successo un romanzo anti-BRCAA1-FMNPs-nanosonde, che possono essere utilizzati per in vivo
due immagini modale come ad esempio l'imaging a fluorescenza e la risonanza magnetica, e possedere una capacità mira ovviamente specifico verso un gastrici tessuti tumorali con 5 mm di diametro durante 0,5 ore e 12 ore di post-iniezione, e proprio buona biocompatibilità. Questo dovrebbe essere il primo rapporto. I nanosonde multifunzionali come preparati può anche essere utilizzato per la terapia di ipertermia del cancro gastrico in in vitro
campo magnetico alternato di irradiazione, e hanno un grande potenziale in applicazioni quali l'imaging simultaneo e il targeting la terapia del cancro gastrico clinica nel prossimo futuro.
Materiali e metodi
Preparazione di anticorpi monoclonali anti-BRCAA1
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida per la cura degli animali e del Comitato Usa, Shanghai Jiao Tong University. Gli anticorpi monoclonali sono stati preparati contro una proteina di fusione BRCAA1 purificata. BALB /c femmine di topo, 4-6 settimane di età, sono stati acquistati dalla Shanghai LAC animali da laboratorio Co. Ltd., Accademia Cinese delle Scienze (Shanghai, Cina). I topi sono stati immunizzati mediante iniezione intraperitoneale con 50 ug di proteina purificata BRCAA1 che è stato emulsionato con un volume uguale di adiuvante completo di Freund. Tre ulteriori iniezioni sono state somministrate con adiuvante incompleto ogni due settimane. Tre giorni dopo l'ultima iniezione, le cellule della milza di topi sono state raccolte e fuse con il 2/0 del mouse linea cellulare di mieloma Sp. Dopo 10-14 giorni, i sovranatanti sono stati esaminati con un test ELISA in cui la fase solida è stata rivestita con la proteina ricombinante BRCAA1 (2 mg /ml) utilizzato per l'immunizzazione. Nel processo di selezione, gli anticorpi monoclonali di legarsi con le proteine ​​BRCAA1 rivestito sono stati selezionati. Limitando il doppio di diluizione, colonie positivi sono stati subclonati. fluidi ascitico sono state raccolte dai topi vaccinati con un 0,5 ml iniezione intraperitoneale di pristano e poi iniettato con 10 6 cellule di ibridoma. La classe e sottoclasse di ogni mAb sono stati determinati utilizzando un kit di mouse anticorpo monoclonale isotyping (Hy Cult Biotecnologie B.V., Paesi Bassi). Gli anticorpi monoclonali sono stati purificati da fluidi ascetiche del mouse utilizzando una proteina G-Sepharose 4FF colonna (Pharmacia, Uppsala, Svezia) secondo le istruzioni del produttore per rimuovere i componenti che potrebbero interferire con gli esperimenti biopanning. I titoli anticorpali sono stati determinati con metodi ELISA [45]. Infine uno dei preparati anticorpi monoclonali anti-BRCAA1 è stato usato come primo anticorpo per colorare 50 esemplari di cancro gastrico e controllare mucose gastriche, che sono stati raccolti da Changzheng Hospital e No.1 Persone Hospital di Shanghai e identificati con l'esame patologico.
Preparazione e Surface Funzionalizzazione di FMNPs
Preparazione di Fe 3O 4 nanoparticelle è basata sulla co-precipitazione di soluzioni ferrosi e ferrici ioni (rapporto 1: 2 molare) [46-49]. nanocristalli CdTe sono stati sintetizzati come segue secondo la nostra precedente relazione: CdCl 2 (5 mmoli) è stato sciolto in 110 ml di acqua, e 12 mmoli di TGA sono stati aggiunti sotto agitazione, seguita regolando il pH a 11 mediante aggiunta a gocce di soluzione 1 M di NaOH. La soluzione mista è stata posta in un pallone a tre colli da disaerato N 2 gorgogliamento per 30 min. Sotto agitazione, 2,5 mmoli di soluzione NaHTe senza ossigeno è stato iniettato nel pallone a tre colli, che è stata preparata da polvere di tellurio e NaBH 4 (tasso molare di 1: 2) in acqua a 0 ° C. La soluzione risultante era circa 4 mg /ml, e il prodotto diametro di 3,5 nm emessa con un massimo circa 630 nm. nanoparticelle magnetiche fluorescenti (FMNPs) sono stati preparati utilizzando l'approccio microemulsione inversa. Prima di collegare le FMNPs con la BRCAA1, abbiamo prima funzionalizzati al gruppo funzionale superficie FMNPs come gruppo carbossilico. 95 mL di etanolo e 2 mL 3-Aminopropyltriethoxysilane (APS) sono stati aggiunti per formare una soluzione mista e lasciata reagire a temperatura ambiente per 24 h. I FMNPs aminosilane modificati sono stati separati dal magnete permanente e sono stati lavati con acqua deionizzata per tre volte. Poi ridisperso il FMNPs-NH 2 in 100 mL Dimetilformammide (DMF), aggiunto eccessiva anidride succinica per formare una soluzione mista e reagire a temperatura ambiente per 24 h. I FMNPs carbossilici modificati erano separate da magneti permanenti di nuovo e lavati con acqua deionizzata per tre volte.
Preparazione e caratterizzazione di BRCAA1 FMNPs anticorpo-coniugato
Abbiamo usato processo in due fasi per ottenere stabile coniugazione anti-BRCAA1-FMNPs [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg soluzione FMNPs-COOH è stato disperso in 2 mL di tampone PBS pH 7, ed è stato sonicato per 10 min. Poi abbiamo mescolato 1 ml di fresco da 400 mm e 100 mm EDC NHSs a pH 6.0 MES buffer e ruotato a temperatura ambiente per 15 min. Dopo questo, la soluzione risultante è stata separata dal campo magnetico e 1 mg /mL BRCAA1 anticorpo monoclonale sono stati aggiunti alla miscela di cui sopra, agitata in luogo buio per 2 h. Per rimuovere BRCAA1 libera, la miscela di reazione residuo è stato separato dal campo magnetico e il solido rimanente è stato lavato con 1 ml di tampone PBS tre volte. Infine, 1 mL 0,05% Tween-20 /PBS è stato aggiunto alla coniugazione BRCAA1-FMNPs e bio-coniugazione finale è stato conservato a 4 ° C. Quando abbiamo usato, questa coniugazione BRCAA1-FMNPs deve essere diluito con PBS /0,05% Tween-20. Poi abbiamo usato il dispositivo Nano goccia di quantificare il tasso di accoppiamento di anticorpo BRCAA1 con FMNPs-COOH. Prima di accoppiare reazione, abbiamo misurato la concentrazione totale di anticorpo BRCAA1. Dopo l'accoppiamento reazione, abbiamo misurato la concentrazione di anticorpi BRCAA1 nella miscela di reazione residuo e calcolato il tasso di accoppiamento secondo l'equazione:
Coupling (%) = (1-concentrazione di anticorpi BRCAA1 in miscela di reazione residuo /concentrazione totale di anticorpi BRCAA1) × 100. Le
nanosonde come preparati e FMNPs puri sono stati caratterizzati da microscopia elettronica a trasmissione e fotoluminescenza spettrometria (PL), e Zeta potenziale analizzatore.
nanosonde per l'imaging in vitro
mira delle cellule di cancro gastrico
linea di cancro gastrico cellule MGC803 cellule con over-espresso proteina BRCAA1 sono state usate come cellule bersaglio, cellule di fibroblasti umani senza proteine ​​BRCAA1 espresso è stato utilizzato come controllo, sono stati coltivati ​​e raccolti, e poi sono stati trattati con 50 mg /ml BRCAA1-FMNPs nanosonde e colto in un umidificata al 5% CO 2 equilibrata incubatore aria a 37 ° C per 4 ore, nel frattempo il MGC803 e fibroblasti umani sono stati trattati con FMNPs come il gruppo di controllo. In seguito, le cellule sono state lavate con PBS per tre volte, e poi le cellule fissate con soluzione di glutaraldeide al 2,5% per 30 min. Per di contrasto nucleare, MGC803 sono stati incubati con 1 mM Hoechst 33258 in PBS per 5 min. Le cellule sono state osservate dal microscopio a fluorescenza (Nikon TS100-F), e ripreso da GE HDX 3.0T MR strumento di imaging dotato di software ParaVision 3.0.
Abbiamo usato anche la Citometro di flusso per valutare la cellula cancro gastrico mira capacità di BRCAA1- FMNPs nanosonde.

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