BRCAA1 monoklonaalinen vasta-aine on konjugoitu fluoresoiva magneettisia nanohiukkasia in vivo kohdennettujen magnetofluorescent kuvantamiseen mahasyöpä

BRCAA1 monoklonaalinen vasta-aine on konjugoitu fluoresoiva magneettisia nanohiukkasia in vivo
kohdennettua magnetofluorescent kuvantaminen mahasyövän
tiivistelmä
tausta
Mahasyöpä on 2th yleisin syöpä Kiinassa, ja on edelleen toiseksi yleisin syy syövän -aiheiset kuoleman maailmassa. Kuinka tunnistaa varhain mahalaukun syöpäsoluja on edelleen suuri haaste varhaisen diagnoosin ja hoidon potilaiden mahalaukun syöpä. Tämän tutkimuksen tavoitteena on kehittää yhdenlaisen monimuotoisen nanoprobes in vivo
kohdennettua magnetofluorescent kuvantaminen mahasyövän.
Menetelmät
BRCAA1 monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin, käytettiin ensimmäisenä vasta-aine värjää 50 paria yksilöiden mahalaukun syöpä ja ohjata normaalin mahan limakalvojen, ja konjugoitu fluoresoiva magneettinen nanopartikkelien 50 nm halkaisijaltaan, tuloksena BRCAA1-konjugoitu fluoresoiva magneettinen nanoprobes karakterisoitiin transmissioelektronimikroskoopilla ja fotoluminesenssin spektrometria, kuten valmistettua nanoprobes inkuboitiin mahalaukun syövän MGC803 soluja, ja injektoitiin hiiriin malli ladattiin mahalaukun syöpä on 5 mm halkaisijaltaan häntälaskimon kautta, ja sitten oli kuvattu fluoresenssin optisen kuvantamisen ja magneettikuvaus, niiden biologisen jakautumisen tutkittiin. Kudos viipaleet havaittiin fluoresenssimikroskopialla ja tärkeitä elimiä, kuten sydän-, keuhko-, munuais-, aivo- ja maksa- analysoitiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) tahra menetelmällä.
Tulokset
BRCAA1 monoklonaalinen vasta onnistuneesti valmis, BRCAA1 proteiini esiintyi yli-ilmentymistä 64% mahasyövän kudoksissa, ei ilmentymistä ohjaus normaaleissa mahan limakalvojen, on olemassa tilastollinen ero kahden ryhmän välillä (P
< 0,01). BRCAA1 konjugoitu fluoresoiva magneettinen nanoprobes näytteille hyvin alhainen myrkyllisyys, alempi magneettinen voimakkuus ja alemman fluoresoiva intensiteetti huippu-blue-shift kuin puhdas FMNPs voitaisiin endosytoidut mahalaukun syövän MGC803 solut, voitaisiin kohdistaa in vivo
mahasyövän kudoksiin ladattu hiiret, ja voitaisiin käyttää kuvan mahasyövän kudoksista loisteputki kuvantaminen ja magneettikuvaus, ja jakautunut pääasiassa paikallisia mahasyövässä kudoksissa 12 tunnin sisällä injektion. HE tahra-analyysi osoitti, että ei ole selvää vauriot havaittiin tärkeitä elimiä.
Päätelmät
korkean suorituskyvyn BRCAA1 monoklonaalinen vasta-aine konjugoitu fluoresoiva magneettinen nanohiukkaset voivat kohdistaa in vivo
mahasyövän soluja, voidaan käyttää samanaikaisesti magnetofluorescent kuvantaminen, ja saattaa olla suuret mahdollisuudet, kuten dual-malli kuvantaminen ja paikallinen lämpö terapia varhaisen mahasyöpä lähitulevaisuudessa.
Tausta
mahasyöpää oli kerran toiseksi yleisin syöpä sana [1]. Ajan tasalla, Yhdysvalloissa, vatsa maligniteetti on tällä hetkellä 14. yleisin syöpä, ja 2th yleisin syöpä Kiinassa [2, 3]. Mahalaukun syöpä on edelleen toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman maailmassa, ja on edelleen vaikea parantaa, koska useimmilla potilailla esiintyy pitkälle edennyt tauti. Siksi miten tunnistaa, raita tai tappaa aikaisin mahalaukun syöpäsoluja on hyvin keskeinen varhaisen diagnosoinnin ja hoidon potilaiden mahalaukun syöpä.
Ajan tasalla, etsivät biomarkkerit tiiviisti mahasyöpä on edelleen tärkeä tehtävä. Vuodesta 1998 olemme syytetään perustaa varhaisessa mahasyövässä pre-varoitusjärjestelmä [4], ja toivovat voivansa käyttää tätä ennalta varoitusjärjestelmä havaitsemiseksi aikaisin mahalaukun syöpäsoluja tunnistamaan potilaita, joilla aikaisin mahalaukun syöpä. Vaikka jotkut eri-ilmaisi liittyviä geenejä aikaisin mahalaukun syöpä todettiin [5, 6], ei yksi geeni voidaan vahvistaa olevan erityinen biomarkkereiden mahasyövän. Näin ollen, jotta tunnistaa varhain mahalaukun syöpäsoluja, me valita vain mahdollisia biomarkkereita liittyy mahasyövän ja yhdistää nanohiukkasia ja molekyylien kuvantamismenetelmiä, yritä löytää in vivo
alussa mahalaukun syöpäsolujen in vivo
kasvain suunnattu kuvantamisen . Aiemmissa työssä, me seulotaan pois ja kloonattu BRCAA1 geeni (rintasyöpä liittyvä antigeeni 1-geeni) rintasyöpään MCF-7cells [AF208045, jota kutsutaan myös ARID4B (AT-rikas interaktiivinen domain sisältävä proteiini 4B)], ja tunnistaa sen antigeeni-epitooppipeptidi SSKKQKRSHK [7, 8]. Olemme myös valmiita BRCAA1 polyklonaalinen vasta, ja havaittiin, että BRCAA1 proteiini esiintyi yli-ilmentyminen lähes 65% kliinisistä näytteistä mahasyövän kudosten [9-11]. Havaitsimme myös, että BRCAA1 antigeeni on yli-ilmentynyt mahasyövän solulinjoissa, kuten MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO III ja MGC803 soluja. Siksi me ennustaa, että BRCAA1 proteiini voi olla yksi potentiaalinen kohdistaminen molekyyli in vivo
mahalaukun syöpäsoluja.
Viime vuosina molekyylikuvantamisen perustuvan teknologian monikäyttöinen nanoprobes ovat edenneet. Esimerkiksi nanohiukkasten kuten kvanttipisteiden, magneettiset nanopartikkelit ja kulta nanorods jne on käytetty molekyylikuvantaminen [12-19]. Toistaiseksi useita pieniä eläin kuvantamisen tekniikoita on kehitetty, kuten optisen kuvantamisen (OI) bioluminenssin (BLI), fluoresenssi (FLI) ja Elintensisäistä mikroskopia (IVM), mikro-PET, MRI ja CT [20-26]. Kaikista näitä tekniikoita, miten parantaa niiden spatiaalinen resoluutio ja kudoksen syvyys herkkyys on suuri haaste. Toistaiseksi in vivo
tuumorikudoksissa yli 1 cm halkaisijaltaan voidaan helposti tunnistaa CT, MRI, PET ja bioluminesenssi kuvantamisen, kasvaimia, joissa on alle tai yhtä suuri kuin 5 mm halkaisijaltaan on erittäin vaikea löytää kliinisissä potilailla. Aiemmissa raporteissa, photosensitizer konjugoidun magneettinen nanohiukkasten käytettiin menestyksekkäästi in vivo
samanaikainen magnetofluorescent kuvantaminen ja kohdistaminen terapia [27]. Kuitenkin kohdistaminen kyky nanoprobes oli erittäin riippuvainen magneettisia nanohiukkasia. Olemme myös valmiita monitoiminen ribonukleaasi-A-konjugoidun CdTe kvanttipiste klusterin nanosystem Synkronointisäädön syövän kuvantamisessa ja hoidossa [28], kohdistamisen kyky kuin valmisteltu nanoprobes riippuu RGD-peptidin. Jotkut tutkimukset osoittavat, että HER-2-proteiini esiintyy epänormaalia ilmentymistä 6-35% mahasyövän kudoksissa [29, 30], ja sitä on käytetty terapeuttinen kohde kliinisen potilailla, joilla on mahalaukun syöpä [31], siis HER-2-proteiini omistaa suuria mahdollisuuksia kuvantamisessa ja hoidossa mahasyövän. Kuitenkin, ajan tasalla, ei raportti osoittaa, että kohdennettuja kuvantaminen ja terapia in vivo
mahasyövän perustuu biomarkkereita liittyy mahasyöpä.
Viime vuosina olemme hallitusti valmistettu piidioksidilla päällystettyä kvanttipisteiden ja super-paramagneettinen nanohiukkasten komposiitit (FMNPs) vahvojen fluoresoivia signaaleja ja erinomaiset magneettiset ominaisuudet, ja ovat myös bio-merkintää, seuranta kantasoluja, bio-erottelu, kohdistaminen kuvantaminen ja lämmönnousua kasvaimia [29-32], myös havaittu, että kun valmisteltu nanohiukkasten oma hyvä biologinen yhteensopivuus ja vakaus [33-38].
tässä artikkelissa olemme täysin käyttää etuja FMNPs ja BRCAA1 antigeeni, valmistetut monoklonaalinen vasta BRCAA1 proteiinia, ja valmis BRCAA1 monoklonaalinen vasta-konjugoitu fluoresoiva magneettinen nanoprobes (BRCAA1- FMNPs), palveluksessa nude-hiiriin malli täynnä mahasyövän 5 mm halkaisijaltaan ja IVIS kuvantamisjärjestelmä ja magneettikuvaus, tutkittiin mahdollisuutta kuin valmisteltu nanoprobes ei-invasiivisia in vivo
kohdistettuja dual modaalinen kuvantaminen mahasyövän. Tulokset osoittavat, että valmisteltu nanoprobes voidaan käyttää in vivo
dual-malli kuvantaminen mahasyövän, ja saattaa olla suuret mahdollisuudet, kuten dual-malli kuvantaminen ja paikallinen lämpö terapia varhaisen mahasyöpä lähitulevaisuudessa.
tulokset ja keskustelu
karakterisointi anti-BRCAA1 monoklonaalinen vasta-aine
Kuten taulukossa 1 on esitetty, olemme onnistuneesti saatu kaksi positiivista kloonia solulinjoja S-200-5 ja S-335-5, niiden tiitterit olivat erilaiset, lopulta valitsimme anti-BRCAA1 monoklonaalinen vasta-aine S-200-5 solulinja kuin ensimmäinen vasta-aine värjää mahasyövän kudosten ja valvonta kudoksiin. Olemme havainneet, että BRCAA1 proteiini esiintyi yli-ilmentymistä 64% mahasyövän kudoksissa, ei ilmentymistä normaalissa ohjaus mahan limakalvojen, kuten kuviossa 1 on esitetty, on olemassa tilastollinen ero kahden ryhmän (P
< 0,01). Tämä tulos on lähes sama kuin edellisessä raportissa [4, 9-11], joka erittäin ehdottaa, että BRCAA1 antigeeni voidaan valita mahdollinen tavoite useimmille mahasyövän, jos sillä valmisteltu nanoprobes tunnistanevat 64% potilaista, joilla aikaisin mahalaukun syöpä, se on erittäin hyödyllinen diagnosoinnin ja hoidon kliinisiä mahasyövän patients.Table 1 titterit BRCAA1 Monoclonal Antibodies askiittinesteessä aiheuttama hybridoomakloonilla Cells ELISA

Vasta-ainetiitteri *
Clone
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) -BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1024000
1024000
< 1,000
< 1,000
S-335- 5
128000
512000
< 1,000
< 1,000
* vastavuoroista askitesnesteen laimennus, ensimmäinen laimennus askitesnesteen oli 1: 1000.
** antigeenit päällystettiin ELISA-levyyn.
Kuvio 1 ilmentäminen BRCAA1 proteiinin mahasyövässä kudoksissa ja normaali valvonta mahan limakalvojen. V: mahasyöpä kudoksia, × 100; B: normaali kontrolli kudosten, x 50.
valmistus ja karakterisointi BRCAA1- FMNPs nanoprobes
Kuten kuviossa 2A on esitetty, valmis FMNPs koostuivat piidioksidi-kääritty CdTe ja magneettiset nanopartikkelit, niiden koko oli 50 nm tai niin halkaisija. Kuten kuviossa 2D on esitetty, sen jälkeen, kun FMNPs konjugoitiin anti-BRCAA1-vasta-aine, kuten valmistettua nanoprobes "fotoluminoivan (PL) voimakkuus oli pienempi kuin FMNPs, jolla vasen-muutos 40 nm, mikä johtui vähentää polarisaation määrä ympäröivän molekyylejä, ja tuloksena lasku Stokes siirtymä lopulta johtaa sinisiirtymä emissiospektrejä. Samoin magneettinen intensiteettiä kuin valmisteltu nanoprobes oli myös alempi kuin FMNPs. Kuvio 2 karakterisointi anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes. V: HR-TEM kuva FMNPs; B: Magnetic ominaisuus anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes; C: Zeta-potentiaali FMNPs kanssa aminoryhmän, COOH, Si-O-ryhmä; D: PL spektrit FMNPs konjugoitu ja ilman BRCAA1 vasta-ainetta.
Vuoden valmistamiseksi BRCAA1-FMNPs nanoprobes, olemme havainneet, että pinta funktionalisointi FMNPs oli hyvin keskeinen konjugoida anti-BRCAA1 vasta-FMNPs kautta kovalenttisella sidoksella. Kuten kuviossa 2C on esitetty, eri funktionaaliset ryhmät FMNPs on eri zeta-potentiaali arvoihin. FMNPs oli negatiivinen Si-O-ryhmää, niiden zeta-potentiaali arvo oli -34,05 mV, The FMNPs jossa aminoryhmä oli positiivinen zeta-potentiaali arvoon 24,80 mV, FMNPs karboksyyliryhmällä oli negatiivinen zeta-potentiaali arvo -30,50 mV. Havaitsimme, että karboksyyliryhmiä pinnalla FMNPs on konjugoitu anti-BRCAA1 vasta-aineen helpompaa kuin aminoryhmiä pinnalla FMNPs. Kuten taulukossa 2 on esitetty, keskimääräinen kytkennän määrä anti-BRCAA1 vasta-aineen FMNPs-COOH oli 80,28% .table 2 kytkentä nopeudella mittaus FMNPs-anti-BRCAA1 vasta-aineen

Yhteensä konsentraatio anti-BRCAA1-vasta-aine (ng /ul)
pitoisuus anti-BRCAA1 vasta-aineen jäljellä reaktioseoksessa (ng /ul)
Kytkimen rate (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Kuten valmisteltu nanoprobes in vitro
kohdennettua mahasyövän solujen
kohdistaminen kyky kuin valmisteltu nanoprobes in vitro
havaittiin fluoresenssin mikroskoopilla ja lasketaan FACSCalibur virtaussytometrillä. Kuten kuviossa 3 on esitetty, FMNPs satunnaisesti hajallaan sisemmän sytoplasman, ja anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes olemassa ympäri nucleolus. Sekä FMNPs ja valmis BRCAA1-FMNPs nanoprobes voi tulla sytoplasmaan MGC803 soluissa, sen jälkeen 4 h inkubaation MGC803 soluja, kuten on esitetty kuviossa 4A, FMNPs voisi merkitä 25,23% MGC803 solujen pysyvät 74,77% soluja ei merkitä. Kuten on esitetty kuviossa 4B, 45,92% MGC803 soluja voidaan leimattiin BRCAA1-FMNPs nanoprobes. Kun FMNPs ja anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes olivat vastaavasti inkuboitiin MGC803-solujen ja ihmisen fibroblastisoluja 0,5 tuntia, havaitsimme paljon anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes tuli MGC803 soluihin, muutaman nanoprobes tuli ihmisen fibroblastisoluja, muutaman FMNPs voisi solmia MGC803 soluihin ja ihmisen fibroblastisoluja, mikä erittäin ehdottaa, että anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes voi kohdistaa MGC803 soluja erikseen. Magneettikuvauksessa ja MGC803 solujen ja ihmisen fibroblastisolujen inkuboitiin anti-BRCAA1-FMNPs 4 h oli kuviossa 5 on esitetty, MGC803 solut osoittivat voimakkaan magneettikentän signaalin kuin ihmisen fibroblastisoluja (HDF), joka osoitti myös, että valmis nanoprobes voidaan kohdistaa MGC803 soluja erikseen. Kuvio 3 In vitro fluoresenssikuvia MGC 803 jälkeen käsitelty FMNPs ja FMNPs-BRCAA1 nanohiukkasten (suurennus = x 200). Top kuvaryhmään kuvitettu FMNPs satunnainen jakaa sytoplasmassa, pohja kuvien ryhmän näytteillä FMNPs-BRCAA1 hajallaan ympäri nucleolus ja olivat hyvin kohdistaminen kyky on MGC803.
Kuva 4 FACSCalibur virtaussytometrissasi analyysi MGC803 leimattu FMNPs ja FMNPs-BRCAA1. V: MGC803 käsiteltiin 50 ug /ml FMNPs 24 tuntia osoitti 25,23% cell leimattiin FMNPs. B: MGC803 käsiteltiin 50 ug /ml FMNPs-BRCAA1 24 tuntia kuvattu jopa 45,92% cell leimattiin FMNPs-BRCAA1.
Kuvio 5 MR kuvantaminen MGC803 solujen ja HDF-soluja. V: MGC803 solut anti-BRCAA1-FMNPs. B: HDF-solut anti-BRCAA1-FMNPs. C: MGC803 solujen vain FMNPs.
As-valmisteltu nanoprobes fluoresoiviin kuvantaminen in vivo
mahasyövässä solujen
arvioimiseksi kasvain suunnattu ominaisuuksia anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes nude-hiiret malleja täynnä MGC- 803 mahasyövän solut valmistettiin ja valvotaan ei-invasiivisia tavalla 12 h käyttämällä IVIS fluoresenssikuvantamisella järjestelmä.
by reaaliaikaisen fluoresenssin intensiteetin koko kehon, kasvaimeen kohdistaminen luonne anti-BRCAA1- FMNPs koetin helposti määritettiin nude-hiirissä ladattu mahasyövässä MGC803 soluja. Kuten on esitetty kuviossa 6A, koko eläimet tuotettu fluoresoivat signaalit 30 min injektion jälkeen ja nanoprobes, ihonalainen kasvain kudoksia voidaan selvästi rajattu ympäröivästä tausta kudoksen välillä 1 tunti ja 12 tuntia injektion jälkeen, jossa on suurin kontrasti esiintyvät 6 h injektion jälkeen. Vahva fluoresenssisignaali on yhä havaita kasvaimen 6 h injektion jälkeen, mikä osoitti, että anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes oli edullisesti kertynyt kasvainkudoksessa. Itse tulosten perusteella kuviossa 6B, korkeammat kasvaimen suhde taustaan ​​(TBR) arvo erittäin suositeltavaa, että valmisteltu nanoprobes ensisijaisesti kertyneet tuumorikudoksissa verrattuna normaaliin kontrollisilkkipaperia. Tämä vahvistettiin fluoresenssi kuvia, jotka osoittivat, että fluoresenssi signaali kuin valmisteltu nanoprobes kasvain sivusto oli voimakkainta kaikkien hiirten elimet kuten kuvassa 6C. Lisäksi kuluttua 12 h injektion jälkeen anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, fluoresenssin intensiteetti kasvaimen havaittiin vielä selvästi, kun taas otto valmis nanoprobes normaalissa elimissä ei ollut ilmeinen. Nämä tiedot erittäin ehdottaa, että valmis nanoprobes voi kohdistaa erittäin tehokkaasti tuumorikudoksista sisällä nude-hiirissä täynnä mahasyöpä. Havaitsimme myös, että ne nanoprobes koko hiiren kehon lähes kokonaan hävinnyt 12 tuntia injektion jälkeen, myös havaittu nanoprobes poistui pois cholecyst järjestelmä (tuloksia ei ole esitetty), ajasta riippuvia cholecyst puhdistumaan nanoprobes erittäin ehdottaa, että -paahtamattomista nanoprobes voi pysyä sisällä nude-hiirissä kauemmin, näin, koska valmistettua nanoprobes oma hyvä bioturvallisuutta. Kuva 6 In vivo fluoresenssi kuvaa kasvaimen kertymisen ja kudosten jakelu FMNPs-BRCAA1 nanohiukkasten MGC803 ihmisen mahalaukun kasvain, joilta puuttuu kateenkorva nude-hiiriin. A, In vivo
fluoresenssi kuvaa Kateenkorvattomien kantavien nude-hiirten. MGC803 ihmisen mahakasvaimen saatiin injektion jälkeen FMNPs-BRCAA1 nanohiukkasten eri ajankohtana. Kasvain sijainti on määritelty nuolella. A-1: 0 h, A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 h, A-6: 12 h. B, TBR [Tissue tausta (lihas) suhde] arvo. Kaupan esteitä koskeva arvo määritettiin seuraavasti: TBR = (Tumor signaali-tausta signaali) /(taustan signaali). C, Ex vivo
fluoresenssi kuvia leikeltiin elinten ja kasvaimen kantavien hiirten MGC803 ihmisen mahakasvaimen tapettiin 12 h injektion jälkeen FMNPs-BRCAA1 nanohiukkasia. Fluoresenssin kuvia leikeltiin elinten ja kasvaimen saatiin käyttäen fluoresenssikuvannustekniikkaa kanssa 630 nm: n emissiosuodatin. D, bioleviäminen anti- BRCAA1-FMNPs hiirissä laskimoon annetun injektion jälkeen. Useat ajankohtina injektion jälkeen, raudan määrät kudosnäytteet arvioitiin ICP massaspektrometrialla (n = 3).
Patologinen analyysi kasvaimen ja tärkeitä elimiä
In vitro
arviointi leikatun suurten kudoksissa, mukaan lukien maksa, keuhkot , perna, munuainen ja sydän, sekä kasvain, osoitti, että anti-BRCAA1-FMNPs koettimet olivat lähinnä ajan ottanut kasvainkudoksessa, joka osoitti vahvaa fluoresenssisignaalit, kuten on esitetty kuviossa 7, kun taas muissa kudoksissa, kuten maksa , keuhko, perna ja sydän ajan otti anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes erittäin vähemmän, mikä furtherly osoittaa, että koska valmisteltu BRCAA1-FMNPs nanoprobes voi kohdistaa mahasyövän kudoksiin. Käytimme myös HE värjäys tarkistaa kaikki elimet, mitään ilmeistä vahinkoja havaittu tärkeitä elimiä [katso ylimääräisen tiedoston 1]. Kuva 7 tulos Immunofluoresenssianalyysi. A, kasvain kudos. B, maksa. (Suurennus = x 200).
Kuten valmisteltu nanoprobes MR Imaging nude-hiirten ladattu mahasyöpä
In vivo
MR kuvantaminen suoritettiin nude-hiirissä ladattu ihonalainen mahasyöpä 12 h injektion . Edustavat kuvat T2 kartat on esitetty kuviossa 8, kun injektoimalla nanoprobes, merkittävä muutos signaalin voimakkuuden havaittiin joillakin alueilla kasvaimia, mikä osoittaa, että oli olemassa kertyminen nanoprobes kasvaimen päällä, kuten on esitetty kuviossa 8B, kuten nuoli osoitti. Kontrollina, kun hiiret malli mahasyöpä injektoitiin FMNPs 12 tuntia, hiiret tehtiin MR imaging, joissa ei ole ilmennyt intensiivinen signaali kasvaimen alueella (kuvio 8A). Kuva 8 MRI kuva hiirillä. A, FMNPs ilman kytkentä BRCAA1 B, FMNPs yhdistettynä BRCAA1
mahdollinen mekanismi kohdistaminen kuvantamisen
Viime vuosina mole- kuvantamisen tekniikoita on käytetty reaaliaikaista ja ei-invasiiviset in vivo
kasvainkudoksissa [39-43]. Esimerkiksi kvanttipisteiden, koska niiden ainutlaatuinen jälkivalaiseva ominaisuuksia, on käytetty bio-merkintää ja loisteputki kuvantaminen [11-13, 33, 43], mutta kvanttipisteiden "myrkyllisyys rajoitetaan niiden soveltamista ihmiskehossa, toistaiseksi jotkut turvallinen kvantti pisteitä kehitetään. Magneettiset nanohiukkaset on myös käytetty vastoin reagenssi MR imaging [15, 33, 36]. Samalla, kahden kuvantamismodaliteettien tarjoaa molempien edut kuin yhdellä menetelmällä, joka tarjoaisi kattavaa tietoa kasvainpaikantumisen, ympäristö, ja tila.
Tässä tutkimuksessa suunnittelimme ja valmis romaani kuvantamisen koetin, joka koostui piitä kääritty kvanttipisteiden ja magneettiset nanopartikkelit, jonka tarkoituksena on parantaa niiden biologinen yhteensopivuus. Tuloksemme osoittavat, että valmis pii-kääritty kvanttipisteiden ja magneettiset nanopartikkelit ovat hyvin vakaa, ja oma vahva fluoresoivat signaalit ja magneettinen intensiteettiä. Käyttämällä voimakas fluoresoivat signaalit kuten valmisteltu nanoprobes olemme onnistuneesti saatu fluoresoiva kuvat in vivo
mahasyövän kudoksiin 5 millimetriä nude-hiirissä mallissa. Käyttämällä voimakkaan magneettikentän signaalit kuten valmisteltu nanoprobes, myös onnistuneesti saatu MR kuvia in vivo
mahasyövän kudoksiin 5 millimetriä nude-hiirissä mallissa. Verrattuna aiempien raporttien isompia kasvaimen kudokset (> 5 mm) voitaisiin helposti kuvantaa käyttämällä fluoresoivia kuvantaminen ja MRI kuvantaminen, kuten kontrasti, meidän tulokset osoittivat, että kun valmisteltu nanoprobes voi havaita pienempiä kasvainkudosnäytteet (vähemmän 5 mm halkaisijaltaan), joka parani huomattavasti herkkyyttä havaitsemismenetelmä. Tuloksemme on myös ensimmäinen kerta ilmoittaa dual-modaalinen kohdistaminen kuvantaminen in vivo
mahasyövässä kudoksiin.
Miten kohdistaa in vivo
mahasyövässä kudoksiin on myös kannekelpoinen ongelma. Ajan tasalla, mitään erityistä mahasyövän biomarkkereiden raportoitu. Vaikka HER-2-proteiinin varmistettiin olevan positiivisia ilmaisun 6-35% mahasyövän kudosten [28-31], HER-2-proteiinilla on myös yli-ilmentymistä monissa tuumorikudoksissa, kuten rintasyövän, keuhkosyövän, paksusuolen syövän, jne, siksi HER-2 pitäisi olla erityinen biomarkkereiden mahasyövän. Tuloksemme osoittivat, että BRCAA1 antigeeni on vain yli-ilmentynyt 64% tai niin mahasyövän kudosten kliininen kirurgian potilailla, myös vahvistanut, että BRCAA1 antigeeni on yli-ilmentynyt joissakin mahasyövän solulinjat, kuten MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III ja MGC803 [6-9]. Käytimme MGC803 solujen valmistamiseksi nude hiirimallissa ladattu mahasyövän ja onnistuneesti havaittu, että valmisteltu nanoprobes ensisijaisesti kertyneet tuumorikudoksissa verrattuna normaaliin kontrollisilkkipaperia, ja koska injektion lisääntyi. Havaitsimme myös, että ruiskutetaan nanoprobes koko kehon osoitti ajasta riippuvaa puhdistumaa ja fluoresoivat signaalit vähitellen laski kuluneen ajan takia maksa-cholecyst erittymistä järjestelmä ja munuaisten selkeys kuin valmisteltu nanoprobes. Useat raportit osoittivat, että munuaisten vain kirkasta nanopartikkelien 5 nm halkaisijaltaan, tutkimuksessamme havaitsimme, että valmisteltu nanoprobes 50 nm halkaisijaltaan myös voisi tyhjentää 12 tunnin sisällä. Tämä konkreettinen mekanismi on parhaillaan käynnissä.
Nanoprobe bioturvallisuus on myös tärkeä ongelma [44], joka päättää soveltaminen mahdollisuus kuin valmisteltu nanoprobes. Tuloksemme täysin osoittivat, että koska valmisteltu nanoprobes ei vahingoita tärkeitä elimiä kuten maksa, munuainen, sydän, keuhko, jne, myös ei esiintynyt pitkäaikaista oleskelevat tärkeitä elimiä, jotka erittäin ehdottaa, että valmisteltu nanoprobes omistaa hyvä biologinen yhteensopivuus, ja on suuret mahdollisuudet, kuten Duaalimallista kuvantaminen ja selektiivinen hoito varhaisen mahasyöpä.
Johtopäätös
onnistuneesti valmistettu uudenlainen anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, jota voidaan käyttää in vivo
kaksi modaalinen kuvantaminen kuten fluoresoiva kuvantamisen ja magneettikuvaus, ja omistat ilmeisesti erityinen kohdentamiskykyä kohti mahasyövän kudoksiin 5 mm halkaisijaltaan 0,5 tunnin aikana ja 12 h injektion jälkeen, ja oma hyvä biologinen yhteensopivuus. Tämän pitäisi olla ensimmäinen raportti. Sellaisenaan valmisteltu monitoiminen nanoprobes myös voidaan käyttää hypertermiaan terapiassa mahasyövän in vitro
vuorotellen magneettikentän säteilytys, ja on suuret mahdollisuudet, kuten samanaikainen kuvantamisen ja kohdistaminen terapia kliinisten mahasyövän lähitulevaisuudessa.
Materiaalit ja menetelmät
anti-BRCAA1 monoklonaalinen vasta-
Eläinkokeet suoritettiin mukaan suuntaviivat Animal Care ja käyttö komitea, Shanghai Jiao Tong University. Monoklonaaliset vasta-aineet valmistettiin vastaan ​​puhdistettua fuusioproteiinia BRCAA1. BALB /c-naarashiiret, 4-6 viikon ikäisiä, ostettiin Shanghai LAC Laboratory Animal Co Ltd, Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina). Hiiret immunisoitiin ruiskuttamalla niiden vatsaonteloon 50 ug puhdistettua BRCAA1-proteiinia, joka oli emulgoitu yhtä suurella tilavuudella Freundin täydellistä adjuvanttia. Kolme muuta injektiota annettiin käyttäen epätäydellistä adjuvanttia kahden viikon välein. Kolme päivää viimeisen injektion jälkeen, pernasolut hiiristä kerättiin ja fuusioitiin Sp 2/0 hiiren myeloomasolulinjaan. Jälkeen 10-14 päivä, viljelmän supernatantit seulottiin ELISA-testi, jossa kiinteä faasi on päällystetty rekombinantti BRCAA1 proteiini (2 ug /ml), jota käytetään immunisoinnissa. Seulonnassa prosessissa, monoklonaaliset vasta-aineet sitomaan päällystetyn BRCAA1 proteiini valittiin. Kaksinkertaisena rajoittavan laimennuksen, pesäkkeet subkloonattiin. Askitesneste kerättiin hiiristä esikäsitelty 0,5 ml: vatsaonteloon Pristane ja ruiskutettiin sitten 10 6 hybridoomasoluja. Luokka ja alaluokka kunkin mAb määritettiin käyttäen hiiren monoklonaalista vasta-ainetta isotyypitysvälineistöä (Hy Cult Biotechnology B.V., Alankomaat). MAb-molekyylit puhdistettiin hiiren askeettinen nesteitä käyttäen proteiini G-Sepharose 4FF (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) mukaisen kolonnin valmistajan ohjeiden poistaa komponentteja, jotka saattavat häiritä biopanning kokeissa. Vasta-ainetiitterit määritettiin ELISA: lla menetelmillä [45]. Lopulta yksi valmis anti-BRCAA1 monoklonaalisia vasta-aineita käytettiin ensimmäisenä vasta-tahraa 50 yksilöt mahasyövän ja hallita mahan limakalvojen, joka kerättiin Changzheng Hospital ja No.1 People sairaala Shanghaissa ja tunnistaa patologiset tutkimukset.
valmistelu ja Surface funktionalisointi FMNPs
valmistelu Fe 3 O 4 nanohiukkasten perustui rasaostamalla rauta- ja ferri-ionin ratkaisut (1: 2 moolisuhde) [46-49]. CdTe nanocrystals syntetisoitiin seuraavalla mukaan edellisessä report: CDCI 2 (5 mmol) liuotettiin 110 ml: aan vettä, ja 12 mmol TGA lisättiin samalla sekoittaen, minkä jälkeen säätämällä pH arvoon 11 lisäämällä tipoittain 1 M NaOH-liuosta. Sekoitettu liuos laitettiin kolmikaulakolviin, joka ilma N 2 kuplivaa 30 min. Sekoittaen, 2,5 mmol hapetonta NaHTe liuosta ruiskutettiin: n kolmikaulakolviin, joka oli juuri valmistettu telluuria jauhe ja NaBH 4 (molaarinen määrä 1: 2) vedessä, 0 ° C: ssa. Saatu liuos oli noin 4 mg /ml, ja 3,5 nm: n halkaisija tuote pääsee enintään noin 630 nm. Fluoresoiva magneettiset nanopartikkelit (FMNPs) valmistettiin käyttämällä käänteisen mikroemulsion lähestymistapaa. Ennen kytketään FMNPs kanssa BRCAA1, ensin funktionalisoidun pinnan funktionaalinen ryhmä FMNPs kuten karboksyyliryhmän. 95 ml etanolia ja 2 ml 3-aminopropyylitrietoksisilaania (APS) lisättiin muodostamiseksi sekoitetun liuoksen ja annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Aminosilaanin-modifioitu FMNPs erotettiin kestomagneetti ja pestiin deionisoidulla vedellä kolme kertaa. Dispergoidaan sitten uudelleen FMNPs-NH 2 100 ml: aan dimetyyliformamidia (DMF), lisättiin liiallisen sukkiinianhydridiä muodostamiseksi sekoitetun liuoksen ja reagoida huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Karboksyyli-modifioitu FMNPs erotettiin kestomagneetti uudelleen ja pestiin deionisoidulla vedellä kolme kertaa.
Valmistus ja karakterisointi BRCAA1 vasta-ainetta konjugoituna FMNPs
Käytimme kahdessa vaiheessa, jolloin saadaan stabiileja anti-BRCAA1-FMNPs konjugaatio [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg FMNPs-COOH liuosta dispergoitiin 2 ml: ssa pH 7 PBS-puskuria, ja sonikoitiin 10 minuuttia. Sitten sekoitetaan 1 ml: lla tuoretta 400 mM EDC: n ja 100 mM NHSS pH 6,0 MES-puskuria ja pyöritetään sitä huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen saatu liuos erotettiin magneettikentän ja 1 mg /ml BRCAA1 monoklonaalinen vasta-aine lisättiin edellä olevaan seokseen, sekoitettiin pimeässä 2 tuntia. Poistaa vapaa BRCAA1, jäljelle jäänyt reaktioseos erotettiin magneettikentän ja Jäljelle jäänyt kiinteä aine pestiin 1 ml: lla PBS-puskurilla, kolme kertaa. Lopuksi, 1 ml 0,05% Tween-20 /PBS lisättiin BRCAA1-FMNPs konjugaatio ja lopullinen bio-konjugointi säilytettiin 4 ° C: ssa. Kun käytimme, tämä BRCAA1-FMNPs konjugaation laimennetaan PBS /0,05% Tween-20. Sitten käytimme Nano Drop laite määrittää kytkimen nopeus BRCAA1 vasta-aineen FMNPs-COOH. Ennen Kytkentäreaktio, mittasimme kokonaispitoisuus BRCAA1 vasta-ainetta. Kytkemisen jälkeen reaktio, mittasimme BRCAA1 vasta-aineen pitoisuus jäljellä reaktioseoksessa, ja lasketaan kytkimen nopeuden mukaan yhtälön:
kytkin (%) = (1-pitoisuus BRCAA1 vasta-aineen jäljellä reaktioseoksessa /yhteensä pitoisuus BRCAA1 vasta-aineen) × 100.
kuten valmisteltu nanoprobes ja puhdas FMNPs karakterisoitiin transmissioelektronimikroskoopilla ja fotoluminoivan (PL) spektrometriaa, ja zeta-potentiaali analysaattorin.
Nanoprobes in vitro
kohdistaminen kuvantaminen mahalaukun syövän solujen
mahasyöpä solulinja MGC803 solut yli-ilmentynyt BRCAA1-proteiinia käytettiin kohdesoluina, ihmisen sidekudosemosoluja ilman ilmaistuna BRCAA1-proteiinia käytettiin kontrollina, viljeltiin ja kerättiin, ja sitten käsiteltiin 50 ug /ml BRCAA1-FMNPs nanoprobes ja viljeltiin kostutetussa 5% CO 2 tasapainoisen ilmaa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 4 h, välin MGC803 ja ihmisen fibroblastisoluja käsiteltiin FMNPs kuin kontrolliryhmässä. Sen jälkeen solut huuhdeltiin PBS: lla kolme kertaa, ja sitten kiinteät solut 2,5% glutaraldehydiliuosta 30 minuuttia. Ydin- counterstaining, MGC803 inkuboitiin 1 mM Hoechst 33258 PBS: ssä 5 min. Solut noudatettava fluoresenssimikroskooppia (NIKON TS100-F), ja kuvantaa GE HDX 3.0T MR kuvantamisen väline varustettu ParaVision 3.0 -ohjelmiston.
Käytimme myös virtaussytometri arvioida mahasyövän solun kohdistaminen kyky BRCAA1- FMNPs nanoprobes.

• Syvä sekvensointi mahakarsinooman paljastaa somaattiset mutaatiot liittyvät henkilökohtaista medicine
• BariSurg tutkimus: Hiha gastrectomy versus Roux-en-Y mahalaukun ohitusleikkaus lihavilla potilailla, joilla on BMI 35-60 kg /m2 - Monikeskustutkimusta satunnaistettu potilas ja tarkkailija sokea yhden…