BRCAA1 моноклональное антитело, конъюгированное флуоресцентных магнитных наночастиц для целенаправленного magnetofluorescent визуализации в естественных условиях рака желудка

BRCAA1 моноклональное антитело, конъюгированное флуоресцентных магнитных наночастиц в естественных условиях для
целевых magnetofluorescent визуализации рака желудка
Аннотация
фон
рак желудка является 2th наиболее распространенной формой рака в Китае, и по-прежнему является второй наиболее распространенной причиной рака смерть в информации о связанных мире. Как распознать ранние желудочные раковые клетки по-прежнему является большой проблемой для ранней диагностики и лечения больных раком желудка. Данное исследование направлено на развитие одного вида многофункциональных нанозонды для в естественных условиях
целевых magnetofluorescent визуализации рака желудка.
Методы
BRCAA1 моноклональное антитело готовили, был использован в качестве первого антитела для окрашивания 50 пар образцов желудочного рак и контролировать нормальную слизистой желудка тканей, и конъюгированные с флуоресцентными магнитных наночастиц с 50 нм в диаметре, полученные в результате BRCAA1 конъюгированные с флуоресцентными магнитными нанозонды характеризовались с помощью просвечивающей электронной микроскопии и фотолюминесценции спектрометрии, а подготовленные нанозонды инкубировали с клетками рака желудка MGC803, и вводили в организм мышей модели нагруженной рака желудка 5 мм в диаметре через хвостовую вену, а затем были обследованы с помощью флуоресцентной оптической томографии и магнитно-резонансной томографии, их биораспределение исследовалась. Срезы ткани наблюдались методом флуоресцентной микроскопии, а также важные органы, такие как сердце, легкие, почки, мозг и печень анализировали с помощью гематоксилином и эозином (HE) метод окрашивания.
Результаты
BRCAA1 моноклональное антитело успешно подготовлен, BRCAA1 белка выставлены избыточная экспрессия в 64% раковых тканей желудка, никакой экспрессии в контрольных нормальных тканях слизистой оболочки желудка, не существует статистических различий между двумя группами (P &
л; 0,01). BRCAA1-конъюгированного люминесцентная магнитная нанозонды обладают очень низким уровнем токсичности, более низкая интенсивность магнитного поля и ниже интенсивность флуоресценции с пиком-синего сдвига, чем чистые FMNPs, может быть эндоцитированный путем рака желудка MGC803 клеток, могут быть ориентированы в естественных условиях
желудка тканей рака нагруженные мышами, и может быть использовано для получения изображений желудка тканей рака с помощью флуоресцентной визуализации и магнитно-резонансной томографии, и в основном распределены в местных желудочных раковых тканей в течение 12 ч после инъекции. Его испачкать анализ показал, что никаких видимых повреждений не наблюдалось важных органов.
Выводы
высокоэффективная BRCAA1 моноклональных антител конъюгированные с флуоресцентными магнитных наночастиц могут предназначаться в естественных условиях
Клетки рака желудка, могут быть использованы для одновременного magnetofluorescent изображения, и может иметь большой потенциал в таких приложениях, как двойной модели визуализации и локальной тепловой терапии ранних стадий рака желудка в ближайшем будущем.
фон
рака желудка когда-то был второй наиболее распространенной формой рака в слове [1]. До настоящего времени в Соединенных Штатах, желудок злокачественности в настоящее время 14-й наиболее распространенной формой рака, и 2th наиболее распространенных видов рака в Китае [2, 3]. Рак желудка по-прежнему является второй наиболее распространенной причиной, связанной с раком смерти в мире, и по-прежнему трудно вылечить, потому что у большинства пациентов, присутствующих с прогрессирующим заболеванием. Поэтому, как распознать, трек или убить ранних клеток рака желудка является очень ключевым для ранней диагностики и лечения больных раком желудка.
До настоящего времени, ищет биомаркеров, тесно связанных с раком желудка по-прежнему является важной задачей. Начиная с 1998 года мы судили установить раннюю желудочную систему рака предварительного предупреждения [4], и надеемся использовать эту систему предварительного предупреждения для выявления ранних клеток рака желудка распознавать больных с ранними стадиями рака желудка. Хотя некоторые по-разному выраженные гены, связанные с ранним раком желудка были идентифицированы [5, 6], не один ген не может быть подтверждена быть конкретными биомаркером рака желудка. Поэтому для того, чтобы распознавать ранние желудочные раковые клетки, мы только выбрать потенциальных биомаркеров, связанных с раком желудка, а также объединить наночастицы и методы молекулярной визуализации, попытайтесь найти в естественных
ранних клеток рака желудка от естественных
опухоли целевой визуализации в , В нашей предыдущей работе мы отсеивают и клонированный ген BRCAA1 (рак молочной железы антиген, ассоциированный с 1 ген) из клеток рака молочной железы линии MCF-7cells [AF208045, называемый также ARID4B (AT-богатый интерактивный домен, содержащий 4B белка)], и определил его антиген эпитоп пептида SSKKQKRSHK [7, 8]. Мы также подготовили BRCAA1 поликлональные антитела, и наблюдали, что белок BRCAA1 выставлены избыточная экспрессия в почти 65% клинических образцов желудочного раковых тканей [9-11]. Мы также наблюдали, что BRCAA1 антиген сверхвыражен в желудочном линиях раковых клеток, таких как MKN-1, MKN-74, SGC-7901, КАТО-III и MGC803 клетки. Таким образом, мы полагаем, что BRCAA1 белок может быть одним из потенциальных молекулы нацеливание для в естественных условиях
Клетки рака желудка.
В последние годы технологии молекулярной визуализации на основе многофункциональных нанозонды добились большого прогресса. Например, наночастицы, такие как квантовые точки, магнитные наночастицы золота и наностержни и т.д., были использованы для молекулярной визуализации [12-19]. До сих пор несколько небольших технологий обработки изображений животных были разработаны такие как оптическая томография (OI) биолюминесценции (BLI), флюоресценции (FLI) и прижизненной микроскопии (IVM), микро-ПЭТ, МРТ и КТ [20-26]. Среди всех этих технологий, как улучшить их пространственное разрешение и чувствительность глубины ткани является большой проблемой. До сих пор в естественных условиях
опухолевые ткани с более 1 см в диаметре могут быть легко идентифицированы с помощью КТ, МРТ, ПЭТ и визуализации биолюминесценции, опухоли с меньшим или равным 5 мм в диаметре, очень трудно найти в клинических больных. В наших предыдущих докладах, фотосенсибилизаторов-конъюгированные магнитные наночастицы были успешно использованы для в естественных условиях
одновременного magnetofluorescent визуализации и ориентации терапии [27]. Тем не менее, нацеливание способность нанозонды была сильно зависит от магнитных наночастиц. Мы также подготовили многофункциональный Рибонуклеаза-A-сопряженную CdTe квантовая точка кластера наносистему для синхронной визуализации и лечения рака [28], адресность способность, как подготовленных нанозонды зависит от RGD пептида. Некоторые исследования показывают, что HER-2 белок проявляет ненормальное выражение в 6-35% тканей рака желудка [29, 30], и был использован в качестве терапевтической мишени для клинических больных раком желудка [31] Таким образом, HER-2 белка владеет большой потенциал в визуализации и терапии рака желудка. Тем не менее, до настоящего времени не сообщалось показывает, что целенаправленная визуализация и терапия в естественных условиях
рака желудка основан на биомаркеров, связанных с раком желудка.
В последние годы мы контролируемо готовили покрытого диоксидом кремния квантовыми точками и супер-парамагнитного наночастицами композиционные материалы (FMNPs) с сильными флуоресцентных сигналов и превосходными магнитными свойствами, и использовали их для био-маркировки, отслеживания стволовых клеток, био-разделения, ориентации изображений и гипертермии опухолей [29-32], мы также отметили, что в подготовленных наночастицы владеют хорошей биосовместимостью и стабильности [33-38].
В данной работе, мы в полной мере использовать преимущества FMNPs и BRCAA1 антигена, приготовленного моноклональных антител против BRCAA1 белка и приготовился BRCAA1 моноклональных антител конъюгированные с флуоресцентными магнитными нанозонды (BRCAA1- FMNPs), использовали обнаженная модель мышей загружены с раком желудка 5 мм в диаметре и системы визуализации ИВИС и магнитно-резонансная томография, исследовали возможность в качестве подготовленных нанозонды для неинвазивного в естественных условиях
целевой двойной модальный визуализации рака желудка. Результаты показывают, что, как подготовленные нанозонды могут быть использованы для в естественных условиях
двойной модели визуализации рака желудка, а также может иметь большой потенциал в таких приложениях, как двойной модели визуализации и локальной тепловой терапии ранних стадий рака желудка в ближайшем будущем.
Результаты и обсуждение
Характеристика анти-BRCAA1 моноклональное антитело
Как показано в таблице 1, мы успешно получили два положительных клона клеточные линии S-200-5 и S-335-5, их титры были разные, в конце концов мы выбрали анти-BRCAA1 моноклональные антитела из клеточной линии S-200-5 в качестве первого антитела окрашивать желудка раковые ткани и ткани контроля. Мы обнаружили, что белок BRCAA1 выставлены сверхэкспрессии в 64% желудочных раковых тканей, никакой экспрессии в нормальных контрольных желудочной слизистой ткани, как показано на рисунке 1, не существует статистических различий между двумя группой (Р &
л; 0,01). Этот результат практически идентичен нашему предыдущему докладу [4, 9-11], что в значительной степени позволяют предположить, что BRCAA1 антиген может быть выбран в качестве потенциальной мишенью для рака желудка наиболее, если в подготовленный нанозонды может признать 64% больных с ранними стадиями рака желудка, это будет очень полезно для диагностики и терапии клинических желудка patients.Table рака 1 титрами BRCAA1 моноклональных антител в асцитной жидкости, индуцированный клон гибридомы клеток с помощью ELISA
<й>
титр антител *

Клон

BRCAA1 (C) -OVA **

BRCAA1 (C) -BSA **

БСА **

OVA **

S-200-5
1024000
1024000
&л; 1000
&л; 1000
S-335- 5
128000
512000
&л; 1000
&л; 1000
* взаимное асцита разбавления жидкости, первое разведение асцитной жидкости составляло 1: 1000.
** антигены наносили на ELISA пластины. Рисунок 1
выражение BRCAA1 белка в раковых тканях желудка и нормального управления слизистой оболочки желудка тканей. A: желудочные раковые ткани, × 100; B: нормальные ткани управления, × 50.
Получение и определение характеристик BRCAA1- FMNPs нанозонды
Как показано на рисунке 2А, ​​подготовленные FMNPs состояли из CdTe и магнитных наночастиц диоксида кремния, завернутые, их размер составил 50 нм или так в диаметр. Как показано на рисунке 2D, после того, как FMNPs конъюгировали с анти-BRCAA1 антителом, интенсивность фотолюминесценции приготовлени нанозонды '(PL) был ниже, чем у FMNPs, показывая левого сдвига 40 нм, что было связано с уменьшением скорости поляризации окружающих молекул, и приводит к уменьшению смещения Стоукс, наконец, в результате чего коротковолновый сдвиг в спектрах излучения. Аналогичным образом, напряженность магнитного поля как подготовленных нанозонды был также ниже, чем FMNPs. Рисунок 2 Характеристика анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды. A: HR-ТЭМ изображение FMNPs; B: Магнитные свойства анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды; С: Дзета-потенциал FMNPs с аминогруппой, СООН, группу Si-O; D:. Спектры ФЛ FMNPs конъюгированных с и без BRCAA1 антитела
В процессе подготовки BRCAA1-FMNPs нанозонды, мы обнаружили, что поверхность функционализации FMNPs была очень ключ к сопряженным анти-BRCAA1 антитело с FMNPs с помощью ковалентной связи. Как показано на фиг.2С, различные функциональные группы FMNPs имеют разные дзета-потенциал значения. FMNPs имел отрицательное Si-O-группу, их дзета-потенциал значение составило -34,05 мВ, то FMNPs с аминогруппой имели положительный дзета-потенциал значение 24.80 мВ, FMNPs с карбоксильной группой имели отрицательный дзета-потенциал значение -30.50 мВ. Мы наблюдали, что карбоксильные группы на поверхности FMNPs, конъюгированных с анти-антителом BRCAA1 легче, чем аминогрупп на поверхности FMNPs. Как показано в таблице 2, средняя скорость связи анти-BRCAA1 антитела с FMNPs-СООН 80,28% .table 2 Муфта измерения скорости FMNPs-анти-BRCAA1 антитела
<й>
общая концентрация анти-BRCAA1 антитела (нг /мкл)

концентрация анти-BRCAA1 антитела в остаточной реакционной смеси (нг /мкл)

скорости Сцепление (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
В подготовленных нанозонды для в пробирке
мишенью Клетки рака желудка
способность как подготовленные нанозонды в пробирке
наблюдались с помощью флуоресцентной микроскопии и вычисленных FACSCalibur проточном цитометре Таргетинг. Как показано на рисунке 3, FMNPs рассредоточено во внутреннем цитоплазмы, и анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды существовали вокруг ядрышка. Оба FMNPs и подготовленные BRCAA1-FMNPs нанозонды может войти в цитоплазме MGC803 клеток после 4 ч инкубации с MGC803 клеток, как показано на рисунке 4A, FMNPs может маркировать 25,23% MGC803 клетки, то остаются 74.77% клеток не могут быть помечены. Как показано на фиг.4В, 45,92% MGC803 клетки могут быть помечены с помощью BRCAA1-FMNPs нанозонды. Когда FMNPs и анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды были соответственно инкубировали с MGC803 клетками и клетками фибробластов человека в течение 0,5 ч, мы наблюдали много анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды вступившие в MGC803 клетки, несколько нанозонды вошли в клетки фибробластов человека, несколько FMNPs мог вступают в MGC803 клетки и клетки фибробластов человека, которые высоко предполагают, что анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды можно ориентировать MGC803 клетки специфически. Магнитно-резонансная томография MGC803 клеток и клеток фибробластов человека инкубировали с анти-BRCAA1-FMNPs в течение 4 ч было показано на рисунке 5, MGC803 клетки выставлены сильный магнитный сигнал, чем клетки фибробластов человека (HDF), которые также показали, что подготовленные нанозонды можно ориентировать MGC803 клетки в частности. Рисунок 3 В пробирке флуоресценции изображения MGC 803 после обрабатывают FMNPs и наночастиц FMNPs-BRCAA1 (увеличение = × 200). Верхняя группа изображений проиллюстрирована FMNPs случайным образом распределяют в цитоплазме, нижняя группа изображений выставлены FMNPs-BRCAA1 разбросаны по всему ядрышек и имели хорошо нацеливание способность к MGC803.
Рисунок 4 FACSCalibur проточном цитометре анализа MGC803, помеченный FMNPs и FMNPs-BRCAA1. А: MGC803 обрабатывали 50 мкг /мл FMNPs в течение 24 ч выставлены 25,23% клеток были помечены FMNPs. В: MGC803 обрабатывали 50 мкг /мл FMNPs-BRCAA1 в течение 24 ч показано до 45,92% клетки метили FMNPs-BRCAA1 Рисунок 5
МР томографии MGC803 клеток и клеток HDF.. A: MGC803 клетки с анти-BRCAA1-FMNPs. B: HDF клетки с анти-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 клеток только с FMNPs
В подготовленных нанозонды для флуоресцентной визуализации в естественных условиях
Клетки рака желудка
Для оценки опухоли целевые свойства анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды, обнаженных моделей мышей, загруженных с MGC- 803 клетки рака желудка получали и контролировали под неинвазивным способом в течение 12 часов с помощью флуоресцентной системы визуализации ИВИС.
путем мониторинга интенсивности флуоресценции в режиме реального времени во всем теле, опухоль таргетирования характер анти-BRCAA1- FMNPs зонд легко определить в голых мышей, нагруженных раком желудка MGC803 клеток. Как показано на фиг.6А, целые животные получают флуоресцентные сигналы в течение 30 мин после инъекции нанозонды, подкожные ткани опухоли может быть четко очерченными от окружающего фона ткани от 1 часа до 12 ч после инъекции, с максимальный контраст происходит при 6 ч после инъекции. Сильный сигнал флуоресценции еще быть обнаружен в месте опухоли в 6 ч после инъекции, в котором указано, что анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды были преимущественно накапливаются в тканях опухоли. На самом деле на основании результатов на фиг.6В, тем выше опухоли к значению фону (TBR) высоко предположил, что, как подготовленные нанозонды преимущественно накапливается в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями управления. Это было подтверждено в флуоресцентных изображениях, которые показали, что сигнал флуоресценции как подготовленных нанозонды в месте опухоли был наиболее сильным среди всех органах мышей, как показано на фиг.6С. Кроме того, через 12 ч после инъекции анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды, интенсивность флуоресценции в опухоли была по-прежнему наблюдается четко, в то время как поглощение подготовленных нанозонды в нормальных органах не было очевидным. Эти данные позволяют предположить, что высоко подготовленные нанозонды можно ориентировать с высокой эффективностью опухолевых тканей внутри голых мышей, нагруженных раком желудка. Мы также отметили, что эти нанозонды во всем теле мыши почти полностью исчезли в 12 ч после инъекции, мы также обнаружили, что нанозонды вышли из системы желчного пузыря (данные не показаны), зависящих от времени желчного пузыря клиренс нанозонды настоятельно рекомендуем, как -prepared нанозонды не может оставаться внутри голых мышей в течение более длительного времени, при этом, как подготовленные нанозонды владеют хорошей биологической безопасности. Рисунок 6 В естественных условиях флуоресцентного изображения накопления в опухоли и распределения тканей для наночастиц FMNPs-BRCAA1 в MGC803 желудочных-опухоленосителей бестимусных голых мышей человека. А, В естественных условиях
флуоресценцию изображения бестимусных голых мышей, несущих. MGC803 опухоли человека желудка была получена после введения наночастиц FMNPs-BRCAA1 в другой точке времени. Местоположение опухоли указано стрелкой. А-1: 0 ч, А-2: 0,5 ч, А-3: 1 ч, А-4: 3 ч, А-5: 6 ч, А-6: 12 ч. B, TBR [ткань для фона (соотношение мышц)] значение. Значение ТБР определяли следующим образом: ВБС = (Опухоль сигнал фонового сигнала) /(фоновый сигнал). C, Ex естественных условиях
флуоресцентные изображения рассеченных органов и опухоли мышей с MGC803 человека опухоль желудка умерщвляли через 12 ч после введения наночастиц FMNPs-BRCAA1. Флуоресцентные изображения рассеченных органов и опухоли были получены с использованием метода флуоресцентной визуализации с фильтром эмиссии на длине волны 630 нм. D, Биораспределение анти- BRCAA1-FMNPs у мышей после внутривенной инъекции. Несколько моменты времени после инъекции, железа количества в образцах ткани оценивали с помощью масс-спектрометрии ICP (п = 3).
Патологический анализ опухоли и важных органов
В пробирке
оценка отсеченных основных тканей, включая печень, легкие , селезенку, почки, и сердце, а также опухоли, показали, что анти-BRCAA1-FMNPs зонды были в основном вверх приняты опухолевых тканей, которые выставляются сильные сигналы флуоресценции, как показано на рисунке 7, в то время как другие ткани, в том числе печени , легких, селезенке и сердце вверх взял анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды очень меньше, что указывает на то, что furtherly, как подготовленный BRCAA1-FMNPs нанозонды может предназначаться желудка тканей рака. Мы также использовали Его окрашивания, чтобы проверить все органы, не было обнаружено никаких видимых повреждений в важных органов [см дополнительный файл 1]. Рисунок 7 Результат анализа иммунофлуоресценции. А, опухолевой ткани. B, печень. (Увеличение = × 200).
Как подготовленные нанозонды для МР томографии голых мышей, нагруженные раком желудка
В естественных условиях
МРТ проводили на голых мышах, загруженной с подкожным рака желудка на 12 ч после инъекции , Типичные изображения T2 карты были показаны на рисунке 8, после того, как впрыскивать нанозонды, наблюдалось значительное изменение интенсивности сигнала в некоторых областях опухоли, что указывает, что существует накопление нанозонды в месте опухоли, как показано на фиг.8В, в качестве стрелки показал. В качестве контроля, после того, как модель мышей с раком желудка вводили FMNPs в течение 12 ч, мышей проводили МР визуализации, который не показал интенсивный сигнал в области опухоли (фиг.8А). На рисунке 8 МРТ изображение мышей. А, FMNPs без муфты BRCAA1 B, FMNPs в сочетании с BRCAA1
Потенциальный механизм ориентации изображений
В последние годы, были использованы технологии молекулярной визуализации в режиме реального времени и неинвазивной визуализации в естественных условиях
опухолевых тканей [39-43]. Например, квантовые точки, благодаря своим уникальным свойствам фотолюминесцентные, были использованы для био-маркировки и флуоресцентных изображений [11-13, 33, 43], но квантовые точки токсичности "ограничивает их применение в организме человека, до сих пор некоторые безопасные квант точки разрабатываются. Магнитные наночастицы были также использованы в качестве контрастного реагента для МР-томографии [15, 33, 36]. В то же время, сочетание двух методов визуализации обеспечивает преимущества обоих, чем при использовании одного метода, который бы обеспечивал полную информацию о локализации опухоли, окружающей среды и состояния.
В этом исследовании мы разработали и подготовили новый зонд формирования изображения, который состоит из кремния, обернутая квантовых точек и магнитных наночастиц с целью повышения их биосовместимости. Наши результаты показывают, что подготовленные кремниевые обернутая квантовые точки и магнитные наночастицы являются очень стабильными, и собственные сильные флуоресцентные сигналы и напряженность магнитного поля. Используя сильные флуоресцентные сигналы, как подготовленные нанозонды, мы успешно получили флуоресцентные изображения в естественных условиях
желудочных раковых тканей с диаметром 5 мм в обнаженной модели мышей. Используя сильные магнитные сигналы, как подготовленные нанозонды, мы также успешно получили МР-изображения в естественных условиях
желудочных раковых тканей с диаметром 5 мм в обнаженной модели мышей. По сравнению с предыдущими отчетами, больший размер опухолевых тканей (≫ 5 мм) может быть легко изображаемых с помощью флуоресцентных изображений и МРТ, как контраст, наши результаты показали, что, как подготовленные нанозонды может обнаружить меньший размер опухолевых тканей (менее 5 мм в диаметре), что заметно улучшило чувствительность метода обнаружения. Наш результат также в первый раз, чтобы сообщить двойного модальный нацеливания визуализации в естественных условиях
желудочных раковых тканей.
Как предназначаться в естественных
желудка тканей рака также подлагется проблема. До настоящего времени не сообщалось о каких-либо конкретных желудка биомаркеров рака. Несмотря на то, HER-2 белка было подтверждено иметь положительное выражение в 6-35% от желудочного рака тканей [28-31], HER-2 белок также проявляет избыточная экспрессия во многих тканях опухолей, таких как рак молочной железы, рак легкого, рак толстой кишки, и т.д., поэтому HER-2 не должны быть специфическими биомаркером рака желудка. Наши результаты показали, что BRCAA1 антиген только чрезмерно выраженное в 64% или около желудка раковых тканей от клинических пациентов хирургии, мы также подтвердили, что BRCAA1 антиген сверхэкспрессии в некоторых желудочных линиях раковых клеток, таких как MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, КАТО-III и MGC803 [6-9]. Мы использовали MGC803 клетки для подготовки обнаженной модели мышей с загруженными раком желудка, и успешно наблюдали, что, как подготовленные нанозонды преимущественно накапливается в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями управления, а также время после инъекции увеличилось. Мы также наблюдали, что прививочный нанозонды во всем теле выставляется зазор зависит от времени, и флуоресцентные сигналы постепенно уменьшается, как время, прошедшее благодаря системе экскреции печени и желчного пузыря почек четкостью, как подготовленных нанозонды. Несколько отчетов показали, что почки только прозрачные наночастицы с диаметром 5 нм, в нашем исследовании, мы обнаружили, что, как подготовленные нанозонды с 50 нм в диаметре, также может быть очищен в течение 12 часов. Этот конкретный механизм идет полным ходом.
Nanoprobe биологической безопасности также является важной задачей [44], которая определяет перспективу приложения в качестве подготовленных нанозонды. Наши результаты в полной мере показали, что, как подготовленные нанозонды не повредить важные органы, включая печень, почки, сердце, легкие, и т.д., также не проявляли долгосрочное пребывание в важных органов, которые настоятельно рекомендуем как подготовленный нанозонды собственный хорошую биосовместимость, и имеют большой потенциал в таких приложениях, как дуальной модели визуализации и селективной терапии ранних стадий рака желудка.
Заключение
Мы успешно подготовили новые анти-BRCAA1-FMNPs нанозонды, которые могут быть использованы для в естественных условиях
два модальный визуализации таких как флуоресцентных изображений и магнитно-резонансной томографии, а также собственные явно специфическое нацеливание способность к желудочным раковых тканей с диаметром 5 мм в течение 0,5 ч и 12 ч после инъекции и собственной хорошей биосовместимости. Это должно быть первым докладом. В качестве подготовленные многофункциональные нанозонды также могут быть использованы для гипертермии терапии рака желудка в пробирке при
переменного поля облучения магнитным, и имеют большой потенциал в таких приложениях, как одновременное визуализации и ориентации терапии клинического рака желудка в ближайшем будущем.
материалы и методы
Получение анти-BRCAA1 моноклональных антител
эксперименты на животных были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию животных комитета, Shanghai Jiao Tong University. Моноклональные антитела получали против очищенного слитого белка BRCAA1. BALB /с самок мышей, 4-6 недель, были приобретены у Шанхайской ЛАК лабораторных животных Co. Ltd., Китайская академия наук (Шанхай, Китай). Мышей иммунизировали интраперитонеально 50 мкг очищенного белка BRCAA1, который эмульгировали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Еще три инъекции были введены с использованием неполного адъюванта через каждые две недели. Через три дня после последней инъекции клетки селезенки мышей собирали и сливают с 2/0 мышиной миеломы клеточной линии Sp. Через 10-14 дней, культуральные супернатанты подвергали скринингу с помощью теста ЭЛИЗА, в котором твердая фаза покрывалась рекомбинантного белка BRCAA1 (2 мкг /мл), используемого для иммунизации. В процессе скрининга, моноклональные антитела для связывания с белком с покрытием BRCAA1 были выбраны. В два раза лимитирующим разведением, были субклонировали положительные колонии. Асцитической жидкости собирали из мышей, загрунтованную 0,5 мл внутрибрюшинно инъекции пристана, а затем вводили 10 6 клеток гибридомы. Класс и подкласс каждого мАт определяли с помощью мышиных моноклональных антител Изотипирование комплект (Hy Cult биотехнологии B.V., Нидерланды). Эти моноклональные антитела были очищены от мыши аскетических жидкостей с использованием белка G-Sepharose 4ff колонку (Pharmacia, Упсала, Швеция) в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы удалить компоненты, которые могут помешать с экспериментами биопэннинга. Титры антител определяли с помощью методов ELISA [45]. Наконец один из подготовленных анти-BRCAA1 моноклональных антител использовали в качестве первого антитела для окрашивания 50 образцов рака желудка и контроля слизистой желудка тканей, которые были собраны из больницы Чанчжэн и № 1 Народной больницы в Шанхае и выявленных гистологического исследования.
Подготовка и поверхности Функционализация FMNPs
Получение Fe <суб> 3O наночастицы <суб> 4 было основано на соосаждения черных и ионов трехвалентного железа растворов (1: 2 мольное отношение) [46-49]. CdTe нанокристаллы были синтезированы следующим образом в соответствии с нашим предыдущим отчета: CdCl <суб> 2 (5 ммоль) растворяли в 110 мл воды, и 12 ммоль TGA добавляли при перемешивании, с последующим доведением рН до 11 добавлением по каплям 1 М раствор NaOH. Смешанный раствор, помещали в трехгорлую колбу, деаэрированной N <к югу> 2 барботирования в течение 30 мин. При перемешивании, 2,5 ммоль бескислородной раствора NaHTe вводили в трехгорлую колбу, которую свежеприготовленный из порошка теллура и NaBH <суб> 4 (мольном соотношении 1: 2) в воде при 0 ° С. Полученный раствор содержит около 4 мг /мл, и продукт диаметром 3,5 нм, излучаемый с максимумом около 630 нм. Флуоресцентные магнитные наночастицы (FMNPs) были получены с использованием обратной микроэмульсии подход. Перед соединением FMNPs с BRCAA1, мы сначала функционализированный поверхность функциональной группы FMNPs как карбоксильная группа. 95 мл этанола и 2 мл 3-аминопропилтриэтоксисилана (АПС), чтобы образовать смешанный раствор и оставляют реагировать при комнатной температуре в течение 24 ч. Аминосиланового-модифицированный FMNPs были разделены постоянным магнитом и промывали деионизированной водой три раза. Затем снова диспергируют в FMNPs-NH <суб> 2 в 100 мл диметилформамида (ДМФ), добавили избыточное янтарного ангидрида с образованием смешанного раствора и выдерживают при комнатной температуре в течение 24 ч. Карбоксильных модифицированный FMNPs были разделены постоянным магнитом снова и промывают деионизированной водой три раза.
Получение и характеристика BRCAA1 FMNPs антител-конъюгированные
Использовалась двухступенчатый процесс для получения стабильного анти-BRCAA1-FMNPs конъюгации [ ,,,0],48, 49]. 1,5 мг раствора FMNPs-СООН диспергируют в 2 мл PBS буфера рН 7, и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин. Затем мы смешали 1 мл свежей 400 мМ EDC и 100 мМ НГС в рН 6,0 MES-буфера и повернуты его при комнатной температуре в течение 15 мин. После этого полученный раствор отделяют от магнитного поля и 1 мг /мл BRCAA1 моноклонального антитела были добавлены к вышеуказанной смеси, перемешивают в темном месте в течение 2 ч. Для того, чтобы удалить свободный BRCAA1 остаточную реакционную смесь разделяют магнитным полем и твердым телом остальные промывали 1 мл PBS буфером три раза. И, наконец, 1 мл 0,05% твина-20 /PBS, добавляли к сопряжению BRCAA1-FMNPs и хранили при 4 ° С в конечном био-конъюгации. Когда мы использовали этот BRCAA1-FMNPs конъюгация следует разбавить PBS /0,05% твин-20. Затем мы использовали устройство Nano падения для количественного определения скорости сцепления BRCAA1 антитела с FMNPs-COOH. Перед соединением реакции, мы измерили суммарную концентрацию BRCAA1 антитела. После связывания реакции, мы измеряли концентрацию BRCAA1 антител в остаточной реакционной смеси и рассчитал скорость муфты согласно уравнению:
Сцепление (%) = (1-Концентрация BRCAA1 антитела в остаточной реакционной смеси /общая концентрация BRCAA1 антител) × 100.
The в подготовленных нанозонды и чистых FMNPs были охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии и фотолюминесценции (PL) спектрометрии и дзета-потенциал анализатора.
нанозонды для работы с изображениями в Vitro
адресности клеток рака желудка
Желудочный линия клеток рака MGC803 клетки с сверхвыражен BRCAA1 белка были использованы в качестве клеток-мишеней, клетки фибробластов человека без выраженного BRCAA1 белка использовали в качестве контроля, культивировали и собирали, а затем обрабатывали 50 мкг /мл BRCAA1-FMNPs нанозонды и культивировали в увлажненной 5% CO <югу> 2 сбалансированным соотношением воздух при температуре 37 ° с в течение 4 часов, пока что MGC803 и клетки фибробластов обрабатывали FMNPs в качестве контрольной группы. После этого клетки промывали PBS три раза, а затем фиксировали клетки с 2,5% -ным раствором глутарового альдегида в течение 30 мин. Для получения ядерного counterstaining, MGC803 инкубировали с 1 мМ Hoechst 33258 в PBS в течение 5 мин. Клетки наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (NIKON TS100-F), а также с помощью отображаемого изображения инструмента GE HDX 3.0T MR, оснащенного программным обеспечением ParaVision 3.0.
Мы также использовали проточный цитометр оценить клетку рака желудка таргетирования способность BRCAA1- FMNPs нанозонды.

• Глубокое секвенирование рака желудка обнаруживает соматические мутации, имеющие отношение к персонализиров…
• BariSurg испытание: Рукав гастрэктомии по сравнению с Ру-ан-Y желудочного шунтирования у пациентов с ожирением с И…