BRCAA1 monoklonalt antistof konjugeret fluorescerende magnetiske nanopartikler til in vivo målrettet magnetofluorescent billeddannelse af mavekræft

BRCAA1 monoklonalt antistof konjugeret fluorescerende magnetiske nanopartikler til in vivo
målrettet magnetofluorescent billeddannelse af mavekræft
Abstract
Baggrund
mavekræft er 2th mest almindelige kræftform i Kina, og er stadig den næsthyppigste årsag til kræft -relaterede dødsfald i verden. Sådan genkender tidlige gastriske cancerceller er stadig en stor udfordring for tidlig diagnose og behandling af patienter med mavekræft. Denne undersøgelse har til formål at udvikle en form for multifunktionelle måleprober til in vivo
målrettet magnetofluorescent billeddannelse af mavekræft.
Metoder
BRCAA1 monoklonalt antistof var forberedt, blev brugt som første antistof til at farve 50 par eksemplarer af gastrisk kræft og kontrollere normale gastriske slimhinderne, og konjugeret med fluorescerende magnetiske nanopartikler med 50 nm i diameter, blev de resulterende BRCAA1-konjugeret fluorescerende magnetiske nanoprober kendetegnet ved transmissionselektronmikroskopi og fotoluminescens spektrometri, blev som den er fremstillet nanoprober inkuberet med gastrisk cancer MGC803 celler, og blev injiceret i mus model fyldt med mavekræft af 5 mm i diameter via halevene, og derefter blev afbildet ved fluorescens optisk billeddannelse og magnetisk resonans, blev deres biofordeling undersøges. De vævssnit blev observeret ved fluorescerende mikroskopi, og de vitale organer som hjerte, lunge, nyre, hjerne og lever blev analyseret ved hematoxylin og eosin (HE) plet metode.
Resultater
BRCAA1 monoklonalt antistof blev succesfuldt fremstillet, BRCAA1 protein udstillet overekspression i 64% gastrisk kræft væv, ingen udtryk i kontrol normale gastrisk slimhinderne, der findes statistisk forskel mellem to grupper (P
< 0,01). Den BRCAA1-konjugeret fluorescerende magnetiske måleprober udviser meget lav toksicitet, lavere magnetisk intensitet og lavere fluorescensintensitet med peak-blå-skift end rene FMNPs, kunne endocytose af mavekræft MGC803 celler, kunne målrette in vivo
gastrisk kræft væv indlæst af mus, og kan anvendes til at afbilde gastrisk cancer væv ved fluorescerende billeddannelse og magnetisk resonans, og hovedsagelig fordelt i lokale gastrisk cancer væv i 12 timer efter injektion. HE plette analyse viste, at ingen tydelige skader blev observeret i vigtige organer.
Konklusioner Salg The højtydende BRCAA1 monoklonale antistof-konjugeret fluorescerende magnetiske nanopartikler kan målrette in vivo Salg gastriske cancerceller, kan anvendes til samtidig magnetofluorescent billedbehandling, og kan have stort potentiale i applikationer såsom dual-model billedbehandling og lokale termisk terapi af tidlig mavekræft i nær fremtid.
Baggrund
mavekræft var engang den anden mest almindelige kræftform i ordet [1]. Op til dato, i USA, mave malignitet er i øjeblikket den 14. mest almindelige kræftform, og 2th mest almindelige kræftform i Kina [2, 3]. Mavekræft er stadig den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald i verden, og forbliver vanskelige at helbrede, fordi de fleste patienter stede med fremskreden sygdom. Derfor hvordan man genkender, spor eller dræbe tidlige gastriske kræftceller er meget centralt for tidlig diagnose og behandling af patienter med mavekræft.
Indtil dato, på udkig efter biomarkører tæt knyttet til mavekræft er stadig en vigtig opgave. Siden 1998 har vi været at blive forsøgt at etablere en tidlig gastrisk system, kræft pre-advarsel [4], og håber at kunne bruge denne pre-varslingssystem for at opdage tidlige gastrisk kræftceller til at genkende de patienter med tidlig mavekræft. Selv om nogle anderledes-udtrykte gener associeret med tidlig mavekræft blev identificeret [5, 6], kan ingen gen bekræftes at være specifikke biomarkør af gastrisk cancer. Derfor, for at genkende tidlige gastriske cancerceller, vælger vi kun potentielle biomarkører forbundet med mavekræft, og kombinere nanopartikler og molekylære billeddiagnostiske teknikker, forsøge at finde in vivo
tidlige mavekræft celler ved in vivo
tumor målrettet billedbehandling . I vores tidligere arbejde, vi screenet ud og klonet BRCAA1 gen (brystkræft associeret antigen 1-genet) fra brystcancercellelinie MCF-7cells [AF208045, også kaldet ARID4B (AT-rige interaktive domæne-holdigt protein 4B)], og identificeret dens antigenepitop peptid SSKKQKRSHK [7, 8]. Vi forberedte også BRCAA1 polyklonale antistof, og bemærkede, at BRCAA1 protein udstillet overekspression i næsten 65% kliniske prøver af mavekræft væv [9-11]. Vi observerede også, at BRCAA1 antigenet er overudtrykt i gastrisk cancer cellelinjer, såsom MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO-III og MGC803 celler. Derfor forudser vi, at BRCAA1 protein kan være en potentiel målretning molekyle til in vivo
gastriske kræftceller.
I de senere år har molekylær billeddannelse teknologier baseret på multifunktionelle måleprober gjort store fremskridt. For eksempel har nanopartikler såsom quantum dots, magnetiske nanopartikler og guld nanorods osv været anvendt til molekylær billeddannelse [12-19]. Hidtil flere små dyr imaging teknologier er blevet udviklet, såsom optisk billeddannelse (OI) af bioluminescens (BLI), fluorescens (FLI) og intravital mikroskopi (IVM), mikro-PET, MR og CT [20-26]. Blandt alle disse teknologier, hvordan man kan forbedre deres rumlige opløsning og væv dybde følsomhed er en stor udfordring. Hidtil in vivo
tumorvæv med over 1 cm i diameter kan let identificeres ved CT, MRI, PET og bioluminescens billeddannelse, tumorer med mindre end eller lig med 5 mm i diameter er meget vanskeligt at finde i kliniske patienter. I vores tidligere rapporter blev fotosensibilisator-konjugeret magnetiske nanopartikler held anvendt til in vivo
simultan magnetofluorescent billedbehandling og målretning terapi [27]. Men den målsøgende evne Måleproberne var stærkt afhængige af magnetiske nanopartikler. Vi har også udarbejdet en multifunktionel Ribonuclease-A-konjugeret CdTe kvantepunktet klynge nanosystem for synkron cancer billeddannelse og terapi [28], den målsøgende evne som fremstillede måleprober er afhængig af RGD peptid. Nogle undersøgelser viser, at HER-2-protein udviser unormal ekspression i 6-35% gastrisk cancer væv [29, 30], og er blevet anvendt som terapeutisk mål for kliniske patienter med gastrisk cancer [31], således, HER-2-protein ejer stort potentiale i billedbehandling og behandling af mavekræft. ajour, ingen rapport viser imidlertid, at målrettet billeddannelse og terapi af in vivo
mavekræft er baseret på biomarkører forbundet med gastrisk cancer.
I de seneste år, vi styrbart fremstillet siliciumdioxidovertrukket quantum dots og super-paramagnetiske nanopartikler kompositter (FMNPs) med stærke fluorescerende signaler og fremragende magnetiske egenskaber, og har brugt dem til bio-mærkning, sporing af stamceller, bio-separation, målrettet billedbehandling og hypertermi af tumorer [29-32], vi også observeret, at som den er fremstillet nanopartikler ejer god biokompatibilitet og stabilitet [33-38].
I dette papir, vi bruger fordelene ved FMNPs og BRCAA1 antigen, forberedt monoklonalt antistof mod BRCAA1 protein og forberedt BRCAA1 monoklonale antistof-konjugeret fluorescerende magnetiske måleprober fuldt (BRCAA1- FMNPs), anvendes nøgne mus model fyldt med mavekræft af 5 mm i diameter og IVIS imaging system og Magnetic Resonance Imaging, undersøgte muligheden for som fremstillet måleprober til ikke-invasiv in vivo
målrettet dobbelt modal billeddannelse af mavekræft. Resultater viser, at som den er fremstillet nanoprober kan anvendes til in vivo
dual-model billeddannelse af mavekræft, og kan have et stort potentiale i applikationer såsom dual-model billeddannelse og lokal termisk behandling af tidlig gastrisk cancer i nær fremtid.
Resultater og diskussion
Karakterisering af anti-BRCAA1 monoklonalt antistof
Som vist i tabel 1, vi med succes opnået to positive klon cellelinier S-200-5 og S-335-5, deres titre var forskellige, endelig vi valgte anti-BRCAA1 monoklonalt antistof fra S-200-5 cellelinie som det første antistof til at farve gastrisk cancer væv og kontrol væv. Vi fandt, at BRCAA1 protein udviste overekspression i 64% gastrisk cancer væv, ingen ekspression i normal kontrol gastriske slimhinderne, som vist i figur 1, eksisterer der statistisk forskel mellem to gruppe (P
< 0,01). Dette resultat er næsten identisk med vores tidligere rapport [4, 9-11], som meget tyder på, at BRCAA1 antigen kan vælges som potentielt mål for de fleste mavekræft, hvis som den er fremstillet måleprober kan anerkende 64% patienter med tidlig mavekræft, det vil være meget nyttigt til diagnose og behandling af kliniske mavekræft patients.Table 1 Titre på BRCAA1 monoklonale antistoffer i ascitesvæske induceret af hybridomklon Celler ved ELISA

antistof titer *
Clone
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) -BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1.024.000
1.024.000
< 1000
< 1.000
S-335- 5 fotos 128.000
512 tusind
< 1000
< 1000
* den gensidige af ascites væske fortynding, den første fortynding af ascites væske var 1:. 1000 Salg ** antigenerne blev overtrukket på ELISA-plade.
Figur 1 Ekspression af BRCAA1 protein i gastrisk cancer væv og normal kontrol gastriske slimhinderne. A: gastrisk kræft væv, × 100; B: normale kontrol væv, × 50.
Fremstilling og karakterisering af BRCAA1- FMNPs nanoprober
Som vist i figur 2A, tilberedte FMNPs var sammensat af silica-indpakket CdTe og magnetiske nanopartikler, deres størrelse var 50 nm eller så i diameter. Som vist i figur 2D, efter FMNPs blev konjugeret med anti-BRCAA1 antistof, som den er fremstillet nanoprober 'fotoluminescens (PL) intensitet var lavere end den af ​​FMNPs, udviser venstre-skift på 40 nm, hvilket skyldes at falde af polarisering sats de omgivende molekyler, og har ført til nedgang i stokes forskydning, endelig resulterer i en blå skift i emissionsspektre. Tilsvarende magnetisk intensitet som fremstillet nanoprober var også lavere end FMNPs. Figur 2 Karakterisering af anti-BRCAA1-FMNPs nanoprober. A: HR-TEM billede af FMNPs; B: Magnetisk ejendom af anti-BRCAA1-FMNPs måleprober; C: Zeta-potentiale FMNPs med aminogruppe, COOH, Si-O-gruppe; D:. PL spektre af FMNPs konjugeret med og uden BRCAA1 antistof
I forbindelse med udarbejdelsen BRCAA1-FMNPs måleprober, fandt vi, at overfladen funktionalisering af FMNPs var meget nøglen til konjugat anti-BRCAA1 antistof med FMNPs via kovalent binding. Som vist i figur 2C, forskellige funktionelle grupper af FMNPs har forskellige zeta-potentiale værdier. FMNPs havde negativ Si-O-gruppe, deres Zeta-potentialet værdi var -34,05 mV, de FMNPs med aminogruppen havde positive zeta-potentielle værdi af 24,80 mV, FMNPs med carboxylgruppe havde negative Zeta-potentialet værdi på -30,50 mV. Vi observerede, carboxylgrupper på overfladen af ​​FMNPs konjugeret med anti-BRCAA1 antistof lettere end aminogrupper på overfladen af ​​FMNPs. Som vist i tabel 2 var den gennemsnitlige kobling på anti-BRCAA1 antistof med FMNPs-COOH var 80,28% .table 2 Kobling rate måling af FMNPs-anti-BRCAA1 antistof

Total koncentration af anti-BRCAA1 antistof (ng /uL)
koncentration af anti-BRCAA1 antistof i resterende reaktionsblanding (ng /uL)
Kobling sats (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Som forberedt måleprober for in vitro
målrettet gastrisk kræftceller
Målretning evne som fremstillet måleprober in vitro
blev observeret ved fluorescens mikroskop og beregnet af FACSCalibur flowcytometer. Som vist i figur 3, FMNPs dispergeret tilfældigt i inderside i cytoplasmaet, og anti-BRCAA1-FMNPs nanoprober eksisterede omkring nucleolus. Både FMNPs og tilberedte BRCAA1-FMNPs nanoprober kan træde ind i cytoplasmaet af MGC803 celler efter 4 timers inkubering med MGC803 celler, som vist i figur 4A, kan FMNPs mærke 25.23% MGC803 celler, det forbliver 74.77% celler kunne ikke mærkes. Som vist i figur 4B, 45.92% MGC803 celler kunne mærkes med BRCAA1-FMNPs nanoprober. Når FMNPs og anti-BRCAA1-FMNPs måleprober blev hhv inkuberet med MGC803 celler og humane fibroblastceller til 0,5 time, vi observerede en masse anti-BRCAA1-FMNPs måleprober indgået MGC803 celler, få måleprober indgået humane fibroblastceller, få FMNPs kunne indgå MGC803 celler og humane fibroblastceller, hvilket meget tyder på, at anti-BRCAA1-FMNPs måleprober kan målrette MGC803 celler specifikt. Den magnetisk resonans af MGC803 celler og humane fibroblastceller inkuberet med anti-BRCAA1-FMNPs i 4 timer blev vist i figur 5, MGC803 celler udviste stærke magnetiske signal end humane fibroblastceller (HDF), som også viste, at de fremstillede nanoprober kan målrette MGC803 celler specifikt. Figur 3 In vitro fluorescens billeder af MGC 803 efter behandling med FMNPs og FMNPs-BRCAA1 nanopartikler (forstørrelse = × 200). Den øverste gruppe billeder illustrerede FMNPs tilfældig distribuere i cytoplasmaet, den nederste gruppe billeder udstillet FMNPs-BRCAA1 spredt rundt om nucleolus og havde godt målrette evne til MGC803.
Figur 4 FACSCalibur flowcytometer analyse af MGC803 mærket med FMNPs og FMNPs-BRCAA1. A: MGC803 behandlet med 50 ug /ml FMNPs for 24 timer udstillet 25,23% celle blev mærket med FMNPs. B: MGC803 behandlet med 50 ug /ml FMNPs-BRCAA1 i 24 timer illustreret op til 45.92% celle blev mærket med FMNPs-BRCAA1
Figur 5 MR billeddannelse af MGC803 celler og HDF-celler.. A: MGC803 celler med anti-BRCAA1-FMNPs. B: HDF celler med anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 celler med kun FMNPs
As-forberedt måleprober for fluorescerende billeddannelse af in vivo
gastriske kræftceller
at vurdere tumor målrettede egenskaber af anti-BRCAA1-FMNPs måleprober, nøgne mus modeller fyldt med MGC- 803 gastriske cancerceller blev fremstillet og overvåges under en ikke-invasiv måde i 12 timer ved anvendelse IVIS fluorescensafbildning system.
ved at overvåge realtid fluorescensintensitet i hele kroppen, det tumor-targeting karakter af anti-BRCAA1- FMNPs probe blev let bestemmes i de nøgne mus lastet med mavekræft MGC803 celler. Som vist i figur 6A, de hele dyr producerede fluorescerende signaler inden for 30 min af post-injektion af Måleproberne, de subkutane tumorvæv kunne tydeligt afgrænset fra det omgivende baggrund væv mellem 1 time og 12 timer efter injektion, med maksimal kontrast forekommer ved 6 timer efter injektion. Stærk fluorescenssignal blev stadig detekteret i tumorstedet ved 6 timer efter injektion, hvilket indikerede, at anti-BRCAA1-FMNPs nanoprober fortrinsvis blev akkumuleret i tumorvæv. Faktisk baseret på resultaterne i Figur 6B, jo højere tumor til baggrund-forhold (TBR) værdi meget foreslået at som den er fremstillet nanoprober fortrinsvis akkumuleret i tumorvæv sammenlignet med normale kontrol væv. Dette blev bekræftet i fluorescens billeder, som viste, at fluorescenssignalet af som fremstillet måleprober i tumorstedet var stærkest blandt alle mus organer, som vist i figur 6C. Hertil kommer, efter 12 timer efter injektion af anti-BRCAA1-FMNPs nanoprober, fluorescensintensiteten i tumoren var stadig observeret klart, mens optagelsen af ​​tilberedte nanoprober i normale organer ikke var indlysende. Disse data meget tyder på, at forberedte måleprober kan målrette yderst effektivt tumorvæv inde nøgne mus fyldt med mavekræft. Vi observerede også, at disse måleprober i hele mus kroppen næsten helt forsvundet ved 12 timer efter injektion, har vi også opdaget de måleprober forladt ud fra cholecyst systemet (data ikke vist), den tidsafhængige cholecyst clearance af Måleproberne tyder meget, at så -Tilberedte måleprober kan ikke blive inde nøgne mus i længere tid, således som den er fremstillet måleprober ejer god biosikkerhed. Figur 6 In vivo fluorescens billeder af tumor ophobning og væv fordeling for FMNPs-BRCAA1 nanopartikler i MGC803 human gastrisk tumor-bærende athymiske nøgne mus. A, In vivo
fluorescens billeder af athymiske nøgne mus der bærer. MGC803 human gastrisk tumor blev opnået efter injektion af FMNPs-BRCAA1 nanopartikler på forskellige tidspunkter punkt. Tumoren placering er angivet med en pil. A-1: 0 h, A-2: 0,5 time, A-3: 1H, A-4: 3 t, A-5: 6 timer, A-6: 12 timer. B, TBR [Tissue til baggrund (muskel) forholdet] værdi. Den TBR værdi blev fastsat som følger: TBR = (Tumor signal-baggrund signal) /(baggrund signal). C, Ex vivo
fluorescensbilleder af dissekerede organer og tumor af mus, som bærer MGC803 human gastrisk tumor aflivet 12 timer efter injektion af FMNPs-BRCAA1 nanopartikler. Fluorescens billeder af dissekerede organer og tumor blev opnået ved anvendelse af en fluorescens billeddannelse teknik med en 630 nm emission filter. D, Biofordelinq af anti- BRCAA1-FMNPs i mus efter intravenøs injektion. Flere tidspunkter efter injektion blev jern beløb i vævsprøver evalueret ved ICP-massespektrometri (n = 3).
Patologisk analyse af tumor og vigtige organer Salg In vitro
evaluering af udskårne større væv, herunder lever, lunge , milt, nyre og hjerte, samt tumoren, indikerede, at anti-BRCAA1-FMNPs prober var hovedsagelig op-taget af tumorvæv, som udviste stærke fluorescenssignaler, som vist i figur 7, mens andre væv, herunder lever , lunge, milt og hjerte up-tog anti-BRCAA1-FMNPs Nanoprobes meget mindre, som furtherly tyder på, at som-forberedt BRCAA1-FMNPs måleprober kan målrette mavekræft væv. Vi brugte også HE farvning at kontrollere alle organer, blev ingen tydelige skader observeret i vigtige organer [se ekstra fil 1]. Figur 7 Resultat af immunfluorescensanalyse. A, tumorvæv. B, lever. (Forstørrelse = × 200).
As-forberedt måleprober for MR Imaging af nøgne mus lastet med mavekræft Salg In vivo
MR scanning blev udført på nøgne mus fyldt med subkutan mavekræft ved 12 timer efter injektion . Repræsentative billeder af T2 kort blev vist i figur 8, Efter indsprøjtning af nanoprober, blev der observeret en signifikant ændring i signalintensitet i visse regioner i tumorer, hvilket indikerer, at der eksisterede akkumulation nanoprober i tumorstedet som vist i figur 8B, som pilen viste. Som en kontrol, efter musemodel med mavekræft blev injiceret FMNPs i 12 timer blev musene udført MR billeddannelse, som ikke viste intensiv signal i tumor område (figur 8A). Figur 8 MRI billede af mus. A, FMNPs uden kobling BRCAA1 B, FMNPs kombineret med BRCAA1
potentiel mekanisme af målretning imaging
I de senere år molekylær imaging teknologier er blevet anvendt til realtid og ikke-invasiv billeddannelse af in vivo
tumorvæv [39-43]. For eksempel, quantum dots, på grund af deres unikke fotoluminescerende egenskaber, er blevet anvendt til bio-mærkning og fluorescerende billeddannelse [11-13, 33, 43], men quantum dots 'toksicitet begrænset deres anvendelse i menneskelige legeme, så langt nogle sikker quantum prikker er under udvikling. Magnetiske nanopartikler har også været anvendt som kontrast reagens til MR-billeddannelse [15, 33, 36]. Samtidig, kombination af to billeddiagnostiske metoder giver fordelene ved både end ved hjælp af en metode, der vil tilvejebringe omfattende information om tumor lokalisering, miljø, og status.
I denne undersøgelse har vi designet og udarbejdet en ny imaging sonde, der var sammensat af silicium-indpakkede quantum dots og magnetiske nanopartikler med henblik på at øge deres biokompatibilitet. Vores resultater viser, at forberedte silicium-indpakkede quantum dots og magnetiske nanopartikler er meget stabile, og egen stærke fluorescerende signaler og magnetisk intensitet. Brug af stærke fluorescerende signaler af som fremstillet nanoprober, vi med succes opnået de fluorescerende billeder af in vivo Salg mavekræft væv med 5 mm i diameter i nøgne mus model. Brug af stærke magnetiske signaler af som fremstillet nanoprober, vi også succes fremstillet MR-billeder af in vivo Salg mavekræft væv med 5 mm i diameter i nøgne mus model. Sammenlignet med tidligere rapporter, større størrelse af tumorvæv (> 5 mm) let kunne afbildet ved hjælp af fluorescerende billeddannelse og MR billeddannelse, som en kontrast, viste vores resultater, at som den er fremstillet måleprober kan registrere mindre størrelse af tumorvæv (mindre 5 mm i diameter), som markant forbedret følsomhed påvisningsmetoden. Vores resultat også er første gang at rapportere målretning billeddannelse af in vivo
mavekræft væv dual-modal.
Sådan målrette in vivo
gastrisk kræft væv er også en anfægtelig problem. Indtil dato er der ikke rapporteret specifikke mavekræft biomarkører. Selvom HER-2-protein blev bekræftet at have positiv ekspression i 6-35% af mavekræft væv [28-31], HER-2-protein også udviser overekspression i mange tumorvæv såsom brystcancer, lungecancer, coloncancer, etc, derfor HER-2 bør ikke være specifik biomarkør for mavekræft. Vores resultater viste, at BRCAA1 antigenet er kun overudtrykt i 64% eller så af mavekræft væv fra kliniske kirurgi patienter, vi også bekræftet, at BRCAA1 antigenet er overudtrykt i nogle gastriske cancer cellelinjer, såsom MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III og MGC803 [6-9]. Vi anvendte MGC803 celler til fremstilling nøgne mus model indlæst med mavekræft, og med held observeret, at som den er fremstillet nanoprober fortrinsvis akkumuleret i tumorvæv sammenlignet med normale kontrol væv, og som efter injektion tid øges. Vi observerede også, at injicerede måleprober i hele kroppen udviste den tidsafhængige clearance og de fluorescerende signaler gradvist faldt som den forløbne tid på grund af leveren-cholecyst udskillelse systemet og nyre klarhed som fremstillet nanoprober. Adskillige rapporter har vist, at kun nyre klare nanopartikler med 5 nm i diameter, i vores undersøgelse, vi observeret, at som den er fremstillet måleprober med 50 nm i diameter også kunne afsluttes inden 12 timer. Denne konkrete mekanisme er i gang.
NanoProbe biosikkerhed er også en vigtig problem [44], som afgør anvendelsen udsigten som tilberedte måleprober. Vores resultater fuldt viste, at som den er fremstillet nanoprober ikke ødelægge vigtige organer, herunder lever, nyre, hjerte, lunge, osv, også udviste ikke langsigtet opholder sig i vigtige organer, som stærkt antyder, at som-fremstillet nanoprober ejer god biokompatibilitet, og har et stort potentiale i applikationer såsom dobbelt model billedbehandling og selektiv behandling af tidlig mavekræft.
Konklusion
Vi held forberedt en roman anti-BRCAA1-FMNPs måleprober, som kan anvendes til in vivo
to modal billeddannelse såsom fluorescerende billedbehandling og magnetisk resonans, og ejer en tydeligvis specifik målrettet evne mod en gastrisk kræft væv med 5 mm i diameter i løbet af 0,5 time og 12 timer af efter injektion, og egen god biokompatibilitet. Dette bør være første rapport. De som forberedte multifunktionelle måleprober kan også bruges til hypertermi terapi af mavekræft under in vitro
vekslende magnetfelt bestråling, og har et stort potentiale i applikationer såsom samtidige billeddannelse og målretning terapi klinisk mavekræft i nær fremtid.
Materialer og metoder
af anti-BRCAA1 monoklonale antistoffer
Dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne for Animal Care og brug Udvalg, Shanghai Jiao Tong University. Monoklonale antistoffer blev fremstillet mod et oprenset fusionsprotein BRCAA1. BALB /c hunmus, 4-6 uger gamle, blev købt fra Shanghai LAC Laboratory Animal Co. Ltd., Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Musene blev immuniseret ved intraperitoneal injektion med 50 ug oprenset BRCAA1 protein, som blev emulgeret med et tilsvarende volumen af ​​Freunds komplette adjuvans. Yderligere tre injektioner blev administreret under anvendelse af ufuldstændige adjuvans hver anden uge. Tre dage efter den sidste injektion blev miltceller fra musene høstet og fusioneret med Sp 2/0 musemyelomcellelinje. Efter 10-14 dage blev kultursupernatanter screenet med en ELISA-test, hvor den faste fase blev overtrukket med den rekombinante BRCAA1 protein (2 ug /ml) anvendes til immunisering. I udvælgelsesprocessen, at de monoklonale antistoffer binder med coated BRCAA1 protein blev selekteret. Ved to gange begrænsende fortynding blev positive kolonier subklonet. Ascitesvæsker blev høstet fra musene primet med en 0,5 ml intraperitoneal injektion af pristan og derefter injiceret med 10 6 hybridomceller. Klassen og underklassen af ​​hver mAb blev bestemt ved anvendelse af et monoklonalt muse-antistof isotypebestemmelse kit (Hy Cult Biotechnology B.V., Holland). MAb'erne blev oprenset fra muse asketiske fluider under anvendelse af en protein G-Sepharose 4FF (Pharmacia, Uppsala, Sverige) søjle ifølge producentens instruktioner for at fjerne komponenter, der kan interferere med biopanning eksperimenter. Antistof-titre blev bestemt ved ELISA-metoder [45]. Endelig en af ​​forberedte anti-BRCAA1 monoklonale antistoffer blev anvendt som første antistof til at farve 50 eksemplarer af mavekræft og styre gastrisk slimhinderne, som blev indsamlet fra Changzheng Hospital og No.1 People Hospital i Shanghai og identificeret ved patologisk undersøgelse.
Forberedelse og overfladefunktionalisering af FMNPs
Udarbejdelse af Fe 3O 4 nanopartikler var baseret på co-udfældning af jern og ferri-ion-løsninger (1: 2 molær forhold) [46-49]. CdTe nanokrystaller blev syntetiseret som følger ifølge vores tidligere rapport: CDC 2 (5 mmol) blev opløst i 110 ml vand, og 12 mmol af TGA blev tilsat under omrøring efterfulgt af justering af pH til 11 ved dråbevis tilsætning af 1 M NaOH-opløsning. Den blandede opløsning blev anbragt i en trehalset kolbe afluftet ved N 2 boblende i 30 min. Under omrøring, 2,5 mmol af syrefrit SYNINGER opløsning blev injiceret i tre-halset kolbe, som var frisk fremstillet ud fra tellur pulver og NaBH 4 (molært forholdet 1: 2) i vand ved 0 ° C. Den resulterende opløsning var ca. 4 mg /ml, og 3,5 nm diameter produkt den udsendte med et maksimum omkring 630 nm. Fluorescerende magnetiske nanopartikler (FMNPs) blev fremstillet ved anvendelse af omvendt mikroemulsion tilgang. Før koble FMNPs med BRCAA1, vi først funktionaliserede overfladen funktionelle gruppe FMNPs som carboxylgruppe. 95 ml ethanol og 2 ml 3-aminopropyltriethoxysilan (APS) blev tilsat til dannelse af en blandet opløsning og fik lov at reagere ved stuetemperatur i 24 timer. Aminosilanen-modificerede FMNPs blev separeret ved permanent magnet og vaskes med deioniseret vand tre gange. Derefter gendispergeres den FMNPs-NH 2 i 100 ml dimethylformamid (DMF), tilsættes overdreven ravsyreanhydrid til dannelse af en blandet opløsning og reagere ved stuetemperatur i 24 timer. Carboxyl-modificerede FMNPs blev separeret ved permanent magnet igen og vasket med deioniseret vand tre gange.
Fremstilling og karakterisering af BRCAA1 antistof-konjugerede FMNPs
Vi brugte to-trins proces til opnåelse stabil anti-BRCAA1-FMNPs konjugation [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg FMNPs-COOH opløsning blev dispergeret i 2 ml pH 7 PBS-buffer, og blev sonikeret i 10 min. Derefter blandet vi 1 ml frisk 400 mM EDC og 100 mM NHSS i pH 6,0 MES-buffer og roteres ved stuetemperatur i 15 minutter. Derefter blev den resulterende opløsning adskilt af magnetfelt og 1 mg /ml BRCAA1 monoklonalt antistof blev tilsat til den ovennævnte blanding, omrørt i mørkt sted i 2 timer. At fjerne frit BRCAA1 blev den resterende reaktionsblanding adskilt af magnetfelt og det faste stof resterende blev vasket med 1 ml PBS-buffer tre gange. Endelig 1 ml 0,05% Tween-20 /PBS blev tilsat til BRCAA1-FMNPs konjugering og den endelige bio-konjugering blev opbevaret ved 4 ° C. Når vi anvendte, bør dette BRCAA1-FMNPs konjugering fortyndes med PBS /0,05% Tween-20. Derefter brugte vi Nano Drop enheden til at kvantificere koblingen på BRCAA1 antistof med FMNPs-COOH. Før koblingsreaktion, målte vi den samlede koncentration af BRCAA1 antistof. Efter kobling reaktion, vi målte koncentration af BRCAA1 antistof i tilbageværende reaktionsblanding og beregnet koblingen sats ifølge ligningen:
Kobling (%) = (1-Koncentration af BRCAA1 antistof i tilbageværende reaktionsblanding /Total koncentration af BRCAA1 antistof) × 100. Salg The som fremstillede måleprober og rene FMNPs var præget af transmission elektronmikroskopi og fotoluminiscens (PL) spektrometri, og Zeta potentielle analysator.
Nanoprobes i vitro
målrettet billeddannelse af gastriske kræftceller
gastrisk cancer cellelinje MGC803 celler med overudtrykt BRCAA1 protein blev anvendt som målceller, humane fibroblastceller uden udtrykte BRCAA1 protein blev anvendt som kontrol, blev dyrket og opsamlet, og derefter blev behandlet med 50 ug /ml BRCAA1-FMNPs nanoprober og dyrket i en befugtet 5% CO 2 balanceret luft inkubator ved 37 ° C i 4 timer, i mellemtiden den MGC803 og humane fibroblastceller blev behandlet med FMNPs som kontrolgruppen. Bagefter blev cellerne skyllet med PBS tre gange, og derefter fikserede celler med 2,5% glutaraldehydopløsning i 30 minutter. For nuklear kontrastfarvning blev MGC803 inkuberet med 1 mM Hoechst 33258 i PBS i 5 min. Cellerne blev observeret ved fluorescens mikroskop (NIKON TS100-F), og afbildes af GE HDX 3.0T MR billeddannelse instrument udstyret med ParaVision 3,0 software.
Vi brugte også flowcytometeret at evaluere mavekræft celle målrettet evne BRCAA1- FMNPs måleprober.

• Deep sekventering af gastrisk karcinom afslører somatiske mutationer er relevante for personlig medicine
• BariSurg retssagen: Sleeve gastrektomi versus Roux-en-Y gastrisk bypass hos overvægtige patienter med BMI 35-60 kg /m2 - et multicenter randomiseret patient og observatør blinde noninferioritet tria…