BRCAA1 monoklonsko protitelo konjugirano fluorescentnih magnetnih nanodelcev vivo ciljno magnetofluorescent slikanje raka želodca

BRCAA1 monoklonsko protitelo konjugirano fluorescentnih magnetnih nanodelcev za in vivo
ciljno magnetofluorescent slikanje raka želodca
Abstract
Ozadje
raka želodca je 2th najpogostejši rak na Kitajskem, in je še vedno drugi najpogostejši vzrok za raka -povezana smrti na svetu. Kako prepoznati zgodnje želodčne rakavih celic, je še vedno velik izziv za zgodnje diagnosticiranje in zdravljenje bolnikov z rakom želodca. Ta študija je namenjen za razvoj ene vrste večnamenskih nanoprobes za in vivo
ciljno magnetofluorescent slikanje raka želodca.
Metode
BRCAA1 monoklonsko protitelo je bil pripravljen, je bil uporabljen kot prvi protitelesa madež 50 parov vzorcev želodca rak in nadzor normalne želodčne sluznice tkiv ter konjugiran s fluorescenčnimi magnetnih nanodelcev z 50 nm v premeru, so nastali BRCAA1 konjugiranih fluorescentne magnetne nanoprobes označen s transmisijsko elektronsko mikroskopijo in fotoluminiscence spektrometrije, so kot, pripravljene nanoprobes inkubirali z rakom želodca MGC803 celic, in smo injicirali v miši modela naložen z rakom želodca 5 mm v premeru preko rep žilo, nato pa so posneli s fluorescenčno optičnem slikanje in slikanje z magnetno resonanco, je bila njihova biološka raziskovali. Rezine tkiva so s fluorescenčno mikroskopijo opazili, in pomembne organe, kot so srce, pljuča, ledvice, možgane in jetra analiziralo hematoksilinom in eozin (HE) metodo madežev.
Rezultati
BRCAA1 monoklonsko protitelo, je bila uspešno pripravili, BRCAA1 protein razstavljene prekomerno ekspresijo v 64% želodčnih tkiv rakom, ni v kontrolnih normalnih želodčne sluznice tkiv, obstaja statistično razliko med obema skupinama (P
< 0,01). BRCAA1 konjugiranih fluorescentno magnetni nanoprobes kažejo zelo nizko toksičnost, manjša magnetna jakost in nižje fluorescenčna intenziteta z vrha-modro-premik od čistih FMNPs, lahko endocitira s MGC803 celice raka želodca, bi lahko bile usmerjene v vivo
želodčne rakavih tkiv napolnjenih miši, in se lahko uporabijo za slike želodčnega tkiva raka s fluorescenčno slikanje in slikanje z magnetno resonanco, in v glavnem razdeljeni v lokalnih želodčnih tkivih z rakom v 12 ur po injiciranju. HE madež analiza je pokazala, da ni bilo očitne škode v pomembnih organih opazili.
Sklepe
visoko zmogljivih BRCAA1 monoklonskih protiteles konjugiranih fluorescentnih magnetnih nanodelcev The mogoče usmeriti v vivo
želodca rakave celice, se lahko uporabijo za sočasno magnetofluorescent slikanje, in lahko imajo velik potencial v aplikacijah, kot so dvojno modela slikanje in lokalno toplotno zdravljenje zgodnjega raka želodca v bližnji prihodnosti.
Ozadje
rakom želodca je bila nekoč drugi najpogostejši rak v besedi [1]. Do danes, v Združenih državah Amerike, želodec malignost je trenutno 14. najpogostejši rak in 2th najpogostejši rak na Kitajskem [2, 3]. Rak želodca je še vedno drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu, in še vedno težko zdraviti, saj pri večini bolnikov prisotne z napredovalo boleznijo. Torej, kako prepoznati, tir ali ubiti zgodnje želodčne rakavih celic je zelo ključnega pomena za zgodnje diagnosticiranje in zdravljenje bolnikov z rakom želodca.
Do datuma, ki išče biomarkerjev tesno povezane z rakom želodca je še vedno pomembna naloga. Od leta 1998, smo se poskušali vzpostaviti sistem zgodnjega želodčni rak vnaprej opozarjanja [4], in upamo, da uporabljajo to pre-opozorilni sistem za odkrivanje zgodnjega želodčne rakave celice prepoznati bolnike z zgodnjim rakom želodca. Čeprav so bile ugotovljene nekatere drugače, izraženi geni, povezani z zgodnjim rakom želodca [5, 6], nihče ne more gen treba potrditi, da je specifična biološkega označevalca raka želodca. Zato, da bi prepoznali zgodnje želodčne rakave celice, smo izbrali le potencialne biološke označevalce, povezanih z rakom želodca in združiti nanodelce in tehnik molekularne slikanje, poskusite najti in vivo
zgodnje želodčne rakave celice in vivo
tumorja ciljno slikanje . V prejšnjem delu smo izločiti in klonirali BRCAA1 gen (rak dojke povezan antigen 1 gen) od raka dojke celične linije MCF-7cells [AF208045, ki se imenuje tudi ARID4B (AT bogate interaktivne vsebujejo domena proteina 4B)], in opredelila svoje antigenski epitop peptid SSKKQKRSHK [7, 8]. Pripravili smo tudi BRCAA1 poliklonsko protitelo, in ugotovili, da je BRCAA1 protein razstavljene prekomerno ekspresijo v skoraj 65% kliničnih vzorcih želodčne tkiv raka [9-11]. Opazili smo tudi, da je BRCAA1 antigen prekomerno izražen v želodčnih linij rakavih celic, kot so MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO-III in MGC803 celice. Zato napovedujejo, da lahko BRCAA1 protein en potencial molekule ciljanja in vivo
želodca rakave celice.
V zadnjih letih so tehnologije molekularno slikanje, ki temeljijo na večnamenski nanoprobes naredila velik napredek. Na primer, nanodelci, kot so kvantne pike, magnetnih nanodelcev in zlato nanopalčk itd so bili uporabljeni za molekularno slikanje [12-19]. Doslej je bilo več manjših tehnologije slikanje živali razvit kot optični slikanje (OI) v bioluminiscenco (BLI), fluorescenčno (FLI) in intravital mikroskopije (IVM), mikro-PET, MRI in CT [20-26]. Med vsemi temi tehnologijami, kako izboljšati njihovo prostorsko ločljivost in občutljivost globino tkiva je velik izziv. Doslej vivo
tumorskih tkiv z več kot 1 cm v premeru mogoče zlahka identificirati s CT, MRI, PET in bioluminiscenčnega slikanje, tumorji z manj kot ali enaka 5 mm v premeru, je zelo težko najdemo v kliničnih bolnikih. V naših prejšnjih poročilih, so bile fotosenzibilizator konjugiranih magnetni nanodelci uspešno uporablja za in vivo
hkratno magnetofluorescent slikanje in ciljanje zdravljenja [27]. Vendar pa je ciljanje sposobnost nanoprobes močno odvisna od magnetnih nanodelcev. Pripravili smo tudi večnamensko ribonukleazna-A-konjugirane CdTe kvantne pike grozda nanosistem za sinhrono slikanje raka in zdravljenja [28], ciljanje sposobnost kot pripravljenih nanoprobes je odvisna od RGD peptida. Nekatere študije kažejo, da HER-2 protein kaže nenormalno ekspresijo v 6-35% raka želodca tkiva [29, 30], in se uporablja kot terapevtski cilj pri kliničnih bolnikih z rakom želodca [31], zato HER-2 protein ima velik potencial slikanje in terapijo raka želodca. Vendar pa do danes ni poročila je razvidno, da je ciljno slikanje in terapijo in vivo
raka želodca, ki temelji na bioloških označevalcev, povezanih z rakom želodca.
V zadnjih letih smo kontrolirano pripravljeni kremena obložene kvantnih pik in super-paramagnetno nanodelci kompoziti (FMNPs) z močnimi fluorescentnih signalov in odlične magnetne lastnosti, in so jih uporabljali za bio-označevanje, sledenje matične celice, bio-ločitev, ciljanje slikanje in hipertermija tumorjev [29-32], ugotovili smo tudi, da se pripravljeni nanodelci lastno dobro biokompatibilnosti in stabilnost [33-38].
V tem prispevku, smo v celoti izkoristijo prednosti FMNPs in BRCAA1 antigen, pripravljeno monoklonskih protiteles proti BRCAA1 beljakovin in pripravljeni BRCAA1 monoklonskih protiteles konjugiranih fluorescentnih magnetnih nanoprobes (BRCAA1- FMNPs), zaposleni nude miši model, naložen z rakom želodca 5 mm v premeru in slikanje sistem IVIS in slikanje z magnetno resonanco, raziskati izvedljivost kot pripravljenih nanoprobes za neinvazivno in vivo
ciljno dvojno modalno slikanje raka želodca. Rezultati kažejo, da je kot, pripravljene nanoprobes lahko uporablja za in vivo
dual-modela slikanje raka želodca, in lahko imajo velik potencial v aplikacijah, kot so dvojno modela slikanje in lokalno toplotno zdravljenje zgodnjega raka želodca v bližnji prihodnosti.
Rezultati in razprava
Karakterizacija anti-BRCAA1 monoklonsko protitelo
Kot je prikazano v tabeli 1, smo uspešno pridobili dva pozitivna klon celic linije S-200-5 in S-335-5, so bili njihovi titri drugačna, končno smo izbrali anti-BRCAA1 monoklonsko protitelo iz s-200-5 celične linije kot prvo protitelesa na madež želodčni rak tkiva in kontrolne tkiva. Ugotovili smo, da BRCAA1 protein razstavljene prekomerno ekspresijo v 64% želodčnih tkiv rakom, ni izraz v normalne kontrolne želodčne sluznice tkivih, kot je prikazano na sliki 1, obstaja statistično razliko med dvema skupinama (P
< 0,01). Ta rezultat je skoraj enak prejšnjem poročilu [4, 9-11], ki močno nakazujejo, da se BRCAA1 antigen lahko izberejo kot potencialno tarčo za raka najbolj želodca, če kot pripravljeni nanoprobes lahko prizna 64% bolnikov z zgodnjim rakom želodca, da bo zelo koristno za diagnozo in zdravljenje kliničnih želodčnega raka patients.Table 1 titre BRCAA1 monoklonskih protiteles v ascitesa povzročenim s hibridoma klonom celic z ELISA

protiteles titer *
Clone
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) -BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1024000
1024000
< 1000
< 1,000
S-335- 5
128.000
512.000
< 1000
< 1,000
* vzajemno ascitesa redčenja tekočine, je bila prva razredčitev ascitesa 1:. 1000
** antigene so prevlečena na ELISA ploščo.
Slika 1 Podajanje BRCAA1 beljakovin v želodcu tkivih rakom in normalno nadzora želodčne sluznice tkiva. A: želodčni rak tkiva, × 100; B: običajni nadzor tkiva, × 50.
Priprava in karakterizacija BRCAA1- FMNPs nanoprobes
Kot je prikazano na sliki 2A, pripravljeni FMNPs so sestavljali-silicijevega dioksida zaviti CdTe in magnetnih nanodelcev je bila njihova velikost 50 nm ali tako v premer. Kot je prikazano na sliki 2D, potem ko so FMNPs konjugirano z anti-BRCAA1 protitelesa, je bil fotoluminiscenco kot pripravljeni nanoprobes "(PL) Intenzivnost nižja od FMNPs, kjer se vidi levo-premik 40 nm, ki je bila zaradi zmanjšanja stopnje polarizacije okoliških molekul in posledično zmanjšanju Stokes razseljevanja, končno posledico modri premik v spektrih emisij. Prav tako je bila nižja od FMNPs tudi magnetna intenzivnost kot pripravljenih nanoprobes. Slika 2 Karakterizacija anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes. A: HR-TEM slika FMNPs; B: Magnetic lastnost anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes; C: Zeta-potencial FMNPs z amino skupino, COOH, Si-O skupina; D:. PL spektri FMNPs konjugiranih z in brez BRCAA1 protitelesa
V okviru priprave BRCAA1-FMNPs nanoprobes, smo ugotovili, da površinska funkcionalizacija FMNPs je zelo ključnega pomena za spregati anti-BRCAA1 protitelo z FMNPs preko kovalentne vezi. Kot je prikazano na sliki 2C, različne funkcionalne skupine FMNPs imajo različne zeta-potencial vrednosti. FMNPs imela negativen Si-O-skupino, je bil njihov zeta-potencial vrednost -34,05 mV so FMNPs z amino skupino imela pozitiven zeta-potencial vrednosti 24,80 mV, je imel FMNPs s karboksilno skupino negativen zeta-potencial vrednost -30.50 mV. Smo ugotovili, da so karboksilne skupine na površini FMNPs konjugiran z anti-BRCAA1 protitelo lažje kot amino skupinami na površini FMNPs. Kot je prikazano v tabeli 2, je bila povprečna stopnja sklopke anti-BRCAA1 protitelesa z FMNPs-COOH 80,28% .table merjenja 2 Sklopka stopnja FMNPs-anti-BRCAA1 protitelesa

Skupna koncentracija anti-BRCAA1 protitelesa (ng /ul)
koncentracija anti-BRCAA1 protitelesa v preostale reakcijski zmesi (ng /ul)
mere sklopke (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Kot pripravljene nanoprobes za in vitro
ciljno želodca rakave celice PODJETJA
ciljanje sposobnosti kot pripravljenih nanoprobes vitro
so bile ugotovljene s fluorescenčnim mikroskopom in jih izračuna FACSCalibur Flow citometrom. Kot je prikazano na sliki 3, FMNPs naključno razpršeni v notranji v citoplazmo in obstajala proti BRCAA1-FMNPs nanoprobes okoli jedrce. Tako FMNPs in pripravljene BRCAA1-FMNPs nanoprobes lahko vstopijo v citoplazmi MGC803 celic po 4 h inkubacije pri MGC803 celic, kot je prikazano na sliki 4A, bi FMNPs označiti 25.23% MGC803 celic je ostala 74.77% celic ni bilo mogoče označiti. Kot je prikazano na sliki 4B, 45,92% bi MGC803 celice biti označene s BRCAA1-FMNPs nanoprobes na. Ko so FMNPs in anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes oziroma inkubirali z MGC803 celicami in fibroblastne celice človeških za 0,5 h, smo opazili veliko anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes sklenili MGC803 celic, nekaj nanoprobes začel fibroblastne celice človeka, bi lahko nekaj FMNPs začne MGC803 celice in človeških fibroblastne celice, ki močno kažejo, da lahko anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes ciljno MGC803 celice posebej. Magnetic Resonance slikanje MGC803 celic in fibroblastne celice človeškega inkubirana z anti-BRCAA1-FMNPs za 4 ure so bili prikazani na sliki 5, MGC803 celice razstavljene močnega magnetnega signala človeške fibroblastne celice (HDF), ki je prav tako pokazali, da lahko pripravljene nanoprobes ciljajo MGC803 celice Natančneje. Slika 3 In vitro fluorescence slike MGC 803 po zdravljenih z FMNPs in FMNPs-BRCAA1 nanodelcev (povečava = × 200). Z zgornjo skupino slik razvidno FMNPs naključno razdelili v citoplazmi, dno skupina slike razstavljene FMNPs-BRCAA1 razpršeni po jedrce in je dobro ciljanje sposobnost za MGC803.
Slika 4 FACSCalibur Flow citometrom analizo MGC803 označen z FMNPs in FMNPs-BRCAA1. A: the MGC803 obdelamo s 50 ug /ml FMNPs za 24 h razstavljena 25,23% celica bili označeni z FMNPs. B: MGC803 obdelamo s 50 ug /ml FMNPs-BRCAA1 za 24 ur ponazorjen do 45.92% celici bili označeni s FMNPs-BRCAA1
Slika 5 MR slikanje MGC803 celic in HDF celic.. A: MGC803 celice z anti-BRCAA1-FMNPs. B: HDF celice z anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 celice samo FMNPs
Kot pripravljene nanoprobes za fluorescenčne slikanje in vivo
želodca rakave celice
Za oceno tumorske ciljnih lastnosti anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, golih modelov miši obremenjenih z MGC- 803 želodca rakave celice so pripravili in spremljali v okviru neinvazivno način za 12 ur z uporabo IVIS sistem fluorescence slikanje.
s sprotnim spremljanjem Intenziteta fluorescence v celotnem telesu, s tumorjem ciljanje značaj anti-BRCAA1- FMNPs sonda je lahko določena v golih miših obremenjenih z rakom želodca MGC803 celic. Kot je prikazano na sliki 6A, celotno proizvedeni fluorescentne signale v 30 min po injekciji nanoprobes, podkožnega tumorske tkiva mogoče jasno opredeljenimi iz okoliškega ozadja tkivo med 1 uro in 12 ur po injiciranju, pri maksimalni kontrast, ki se pojavljajo pri 6 h po injiciranju. Močna fluorescence Signal je še vedno zaznati v mestu tumorja na 6 ur po injiciranju, ki je pokazal, da so bili proti BRCAA1-FMNPs nanoprobes prednostno nabrali v tumorskih tkivih. Dejansko je na podlagi rezultatov v sliki 6B, večji tumor na razmerje ozadje vrednost (TBR) zelo predlagali kot pripravljeni nanoprobes prednostno nabrali v tumorskih tkivih, v primerjavi z normalnimi kontrolnimi tkiva. To je bilo potrjeno v fluorescence slik, ki so pokazale, da je fluorescenčni signal kot pripravljenih nanoprobes v mestu tumorja najmočnejši med vsemi miši organov, kot je prikazano na sliki 6C. Poleg tega je po 12 ur po injiciranju anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, intenziteta fluorescence tumorja je še vedno jasno opaziti, medtem ko se je poraba pripravljenih nanoprobes v normalnih organih ni bilo očitno. Ti podatki močno kažejo, da lahko pripravljeni nanoprobes ciljajo visoko učinkovito tumorske tkiva znotraj golih miših, obremenjenih z rakom želodca. Opazili smo tudi, da so ti nanoprobes v celotnem telesu miške skoraj povsem izginilo 12 ur po injiciranju, smo tudi zaznajo nanoprobes izstopilo ven iz sistema cholecyst (podatki niso prikazani), čas odvisen od cholecyst razdalja nanoprobes zelo predlagamo, da kot pripravljeni nanoprobes ne more ostati znotraj nude miši za dalj časa, tako, kot pripravljeni nanoprobes lastno dobro biološko varnost. Slika 6 vivo fluorescence slike kopičenja tumorja in tkivni porazdelitvi za FMNPs-BRCAA1 nanodelcev v MGC803 človekovih želodca gole miši s tumorji nosijo. A, in vivo
fluorescence slike gole miši. MGC803 človek želodčni tumor, pridobljena po injekciji FMNPs-BRCAA1 nanodelcev na drugačen časovni točki. Lokacija tumorja je določena s puščico. A-1: 0 h, A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 ur, A-6: 12 ur. B, TBR [tkiva na ozadju razmerja (v mišicah)] vrednosti. Vrednost TBR je bila določena, kot sledi: TBR = (tumorje signal ozadja signala) /(ozadje signala). C, Ex vivo
fluorescence slike razkosanih organov in tumorja miši MGC803 človeške želodčne tumor žrtvovali na 12 ur po injiciranju FMNPs-BRCAA1 nanodelcev. Fluorescence slike razkosanih organov in tumorja so bili pridobljeni s pomočjo fluorescence slikanja s filtrom za emisije 630 nm je. D, biološka porazdelitev anti- BRCAA1-FMNPs pri miših po intravenski injekciji. Več časovnih točk po injekciji, smo količine železa v vzorcih tkiv ovrednotijo ​​ICP masne spektrometrije (n = 3).
Patološkem analiza tumorja in pomembnih organov
vitro
ocena izrezali večjih tkivih jeter, pljuč , vranice, ledvic in srca, kakor tudi tumor, je pokazala, da so anti-BRCAA1-FMNPs sonde v glavnem navzgor izvedel tumorskih tkiv, ki so razstavljena močne fluorescence signale, kot je prikazano na sliki 7, medtem ko druga tkiva, vključno z jetri , pljuč, vranice in srca up-vzel anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes zelo manj, ki furtherly kaže, da lahko BRCAA1-FMNPs nanoprobes kot pripravljeno ciljno želodčne rakavih tkiv. Uporabili smo tudi HE obarvanje preveriti vse organe, so v pomembnih organih [glej dodatno datoteke 1] opazili nobenih očitnih škode. Slika 7 rezultat imunofluorescenco analize. A tumorsko tkivo. B, jetra. (Povečava = × 200).
Kot pripravljene nanoprobes za MR slikanje golih miših, naloženi z rakom želodca
vivo
slikanje je bila izvedena na golih miših naložen s podkožno raka želodca na 12 ur po injiciranju . Reprezentativni slike T2 kartah so prikazane na sliki 8, po injiciranju z nanoprobes opazili pomembne spremembe v jakosti signala v nekaterih regijah tumorjev, kar pomeni, da obstaja kopičenje v nanoprobes v mestu tumorja, kot je prikazano na sliki 8B, kot puščica pokazala. Kot kontrolo po modelu miši z rakom želodca smo injicirali FMNPs 12 ur, so bile miši izvedli MR slikanje, ki ni pokaže intenzivno signal v območju tumorja (slika 8A). Slika 8 MRI slika miši. A, FMNPs brez spajanjem BRCAA1 B, FMNPs združene z BRCAA1
potencial mehanizma ciljnih slikanje
V zadnjih letih so bile uporabljene tehnologije molekularno slikanje v realnem času in neinvazivno slikanje in vivo
tumorskih tkivih [39-43]. Na primer, kvantnih pik, zaradi svoje edinstvene fotoluminiscenčna lastnosti, ki so bili uporabljeni za bio-označevanje in fluorescentno slikanje [11-13, 33, 43], vendar kvantnih pik "toksičnost omejena z njihovo uporabo v človeškem telesu, doslej nekaj varno količinskega pike se razvijajo. Magnetni nanodelci so bili uporabljeni tudi kot kontrastno reagenta za MR-slikanje [15, 33, 36]. Ob istem času, kombinacija obeh načinov slikanja nudi prednosti tako kot z eno metodo, ki bi zagotovila izčrpne informacije o tumor lokalizacije, varovanje okolja in statusa.
V tej študiji smo oblikovali in pripravili novo sondo slikanje, ki je bila sestavljena iz silicija zaviti kvantnih pik in magnetnih nanodelcev s ciljem povečanja njihove biokompatibilnosti. Naši rezultati kažejo, da so pripravljene silicija zavit kvantnih pik in magnetni nanodelci zelo stabilen in lastne močne fluorescentne signali in magnetna jakost. Uporaba močne fluorescentne signale kot pripravljenih nanoprobes smo uspešno pridobili fluorescenčne slike in vivo
želodčnih tkiva z rakom 5 mm v premeru, pri golih modelu miši. Uporaba močnih magnetnih signalov kot pripravljenih nanoprobes, smo tudi uspešno pridobili MRI slike in vivo
želodčnih tkiva z rakom 5 mm v premeru v golih modelu miši. V primerjavi s prejšnjimi poročili, večje velikosti tumorskih tkiv (> 5 mm), bi lahko brez težav slikal z uporabo fluorescenčne slikanje in MRI slikanje, kot kontrast, naši rezultati so pokazali, da je, kot je pripravljena nanoprobes lahko zazna manjše velikosti tumorskih tkiv (manj 5 mm v premeru), ki je izrazito izboljšala občutljivost metode odkrivanja. Naš rezultat je tudi prvič, da poročajo o dual-modalno slikanje usmerjanju in vivo
želodčnega tkiva raka.
Ciljanje vivo
želodčne rakavih tkiv je tudi izpodbojni problem. Do danes ni bilo poročil o posebnih želodčnih biomarkerjev raka. Čeprav je bil HER-2 proteina je potrdila, da imajo pozitiven ekspresijo v 6-35% želodca tkiv raka [28-31], HER-2 protein izraža tudi nad-ekspresijo v mnogih tumorskih tkivih, kot so rak dojke, pljučni rak, rak debelega črevesa, itd, torej HER-2 ne sme biti specifični biomarkerjev raka želodca. Naši rezultati so pokazali, da je BRCAA1 antigen samo prekomerno izražen pri 64% ali tako želodca tkiv rakavih pacientov kliničnih kirurgije, smo tudi potrdili, da je BRCAA1 antigen prekomerno izražene v nekaterih želodčnih linij rakavih celic, kot so MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III in MGC803 [6-9]. Uporabili smo MGC803 celic za pripravo gola modela miši naložen z rakom želodca in uspešno opaziti, da pripravljeni nanoprobes prednostno nabrali v tumorskih tkivih, v primerjavi z običajnimi kontrolnimi tkiva, in kot čas po injiciranju povečala. Opazili smo tudi, da vbrizga nanoprobes v celotnem telesu razstavljene časovno odvisne preverjene in fluorescentne signale postopoma zmanjšala, saj je čas, ki poteče zaradi sistemu izločanja jeter-cholecyst in ledvic jasnostjo kot pripravljenih nanoprobes. Več poročila so pokazala, da je z ledvicami samo jasne nanodelci s 5 nm v premeru, v naši raziskavi smo ugotovili, da bi bila pripravljena nanoprobes s 50 nm v premeru tudi izbil v 12 urah. Ta konkreten mehanizem je v teku.
Nanoprobe biološke varnosti je prav tako pomemben problem [44], ki se odloči, možnost brizganja, kot pripravljenih nanoprobes. Naši rezultati v celoti pokazali, da je kot, pripravljene nanoprobes ne poškoduje pomembne organe, kot so jetra, ledvice, srca, pljuč, itd, tudi niso imele dolgoročno bivanje v pomembnih organih, ki močno kažejo, da so pripravljeni nanoprobes lastno dobro biokompatibilnosti in imajo velik potencial v aplikacijah, kot so dvojno modela slikanje in selektivno zdravljenja zgodnjega raka želodca.
Zaključek
uspešno smo pripravili nove anti-BRCAA1-FMNPs nanoprobes, ki se lahko uporabljajo za in vivo
dveh modal slikanje kot fluorescentna slikanje in slikanje z magnetno resonanco, in lastnik očitno specifično ciljanje sposobnost proti želodčni rakavih tkiv s 5 mm v premeru med 0,5 h in 12 h post-injiciranja in lastno dobro biokompatibilnosti. To bi moralo biti prvo poročilo. V tako pripravljeni večnamenski nanoprobes se lahko uporablja tudi za hipertermija zdravljenju raka želodca pod in vitro
izmenično magnetno obsevanje na terenu, in imajo velik potencial v aplikacijah, kot so simultano slikanje in ciljanje terapijo kliničnega raka želodca v bližnji prihodnosti.
materiali in metode
Priprava anti-BRCAA1 monoklonskih protiteles
so poskusi na živalih, izvedenih v skladu s smernicami za oskrbo živali in uporabe odbora, Shanghai Jiao Tong University. Monoklonska protitelesa smo pripravili proti očiščenega fuzijskega proteina BRCAA1. BALB /c samice miši, stare 4-6 tednov, so bile kupljene od Shanghai LAK laboratorijske živali Co Ltd, kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska). Miši imuniziramo z intraperitonealno injekcijo z 50 ig očiščenega BRCAA1 proteina, ki je emulgirana z enakim volumnom Freundovem kompletnem adjuvansu. Tri dodatne injekcije so dajemo z nepopolno adjuvans vsaka dva tedna. Tri dni po zadnji injekciji so bile pobrane in zlit z Sp 2/0 miške mieloma celično linijo vranica celice miši. Po 10-14 dneh smo supernatante kulture pregledani s testom ELISA, v katerem je trdna faza prevlečenih z rekombinantnim BRCAA1 proteina (2 mg /ml), ki se uporablja za imunizacijo. V postopku preverjanja, monoklonska protitelesa se vežejo z premazan BRCAA1 proteina smo izbrali. Dvakrat omejevanje redčenje, subkloniramo pozitivne kolonije. Ascitic tekočine smo zbrali iz miši cepljenih z 0,5 ml intraperitonealno injekcijo pristan in nato injicirali 10 6 hibridomskih celic. Razred in podrazred vsakega mAb bile določene z uporabo miške monoklonsko isotyping protitelesa komplet (Hy Cult Biotechnology B.V., Nizozemska). V mAbs smo očistili iz mišjih asketske tekočin uporabo beljakovina G-Sepharose 4FF kolone (Pharmacia, Uppsala, Švedska), v skladu z navodili proizvajalca, da se odstranijo sestavine, ki bi lahko motile z bioselekcije eksperimentov. Titre protiteles smo določili po metodah ELISA [45]. Nazadnje je bila uporabljena ena od pripravljenih anti-BRCAA1 monoklonskih protiteles kot prva protitelesa madež 50 primerkov raka želodca in nadzor želodčne sluznice tkiva, ki so bili zbrani iz bolnišnice Changzheng in No.1 People bolnišnici v Šanghaju in opredeljenih s patološkim pregledom.
Priprava in Surface Funkcionalizacija FMNPs
Priprava Fe 3o 4 nanodelci je temeljila na sodelovanju padavin železa in železovih ionov rešitev (v razmerju 1: 2 molarno) [46-49]. CdTe nanocrystals smo pripravili takole po prejšnjem poročilu: CDC 2 (5 mmol) smo raztopili v 110 ml vode in 12 mmol TGA dodamo med mešanjem, čemur sledi uravnavanje pH na 11 z dokapavanjem 1 M raztopino NaOH. Mešano raztopino smo dali v trigrlo bučko z N 2 mehurčki 30 minut odzračiti. Ob mešanju, 2,5 mmol brez kisika raztopino NaHTe smo injicirali v trigrlo bučko, ki je sveže pripravljenega iz telurja prahu in NaBH 4 (molskem razmerju 1: 2) v vodi pri 0 ° C. Nastala raztopina je bila okoli 4 mg /ml in premer izdelek 3,5 nm oddaja z največ okoli 630 nm. Fluorescentna magnetnih nanodelcev (FMNPs) smo pripravili ob uporabi pristop povratne mikroemulzije. Pred vezavo na FMNPs z BRCAA1 smo najprej funkcionaliziran površine funkcionalno skupino FMNPs kot karboksilno skupino. 95 ml etanola in 2 ml 3-aminopropiltrietoksisilan (APS) dodamo, da se tvori mešan raztopino in pustimo reagirati pri sobni temperaturi 24 ur. Je FMNPs-aminosilane modificiran ločimo s trajnim magnetom in speremo z deionizirano vodo trikrat. Nato ponovno dispergirati s FMNPs-NH 2 v 100 ml dimetilformamida (DMF), dodamo prekomerno jantarno anhidrid da se tvori mešan raztopino in reagirati pri sobni temperaturi 24 ur. Je FMNPs-karboksilne modificiran ločimo s trajnim magnetom znova in speremo z deionizirano vodo trikrat.
Priprava in karakterizacija BRCAA1 protiteles konjugiranih FMNPs
smo uporabili dvostopenjski postopek, da dobimo stabilno anti-BRCAA1-FMNPs konjugacijo [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg FMNPs-COOH raztopino dispergiramo v 2 ml pH7 PBS pufra in sonificiramo 10 minut. Nato smo mešati 1 ml svežega 400 mM EDC in 100 mM NSVS pri pH 6,0 MES buffer in ga vrti pri sobni temperaturi 15 minut. Po tem smo dobljeno raztopino ločimo z magnetnim poljem in 1 mg /ml BRCAA1 monoklonsko protitelo dodamo k zgornji mešanici, mešali v temnem prostoru 2 uri. Za odstranitev prostega BRCAA1 je bila preostala reakcijsko zmes ločimo z magnetnim poljem in trdno snov, ki ostane speremo z 1 ml PBS pufra trikrat. Končno, 1 ml 0,05% Tween-20 /PBS dodamo konjugacijo BRCAA1-FMNPs in so shranjeni pri 4 ° C pri končnem bio-konjugacijo. Ko smo uporabili, bi morala ta BRCAA1-FMNPs konjugacija razredčimo s PBS /0,05% Tween-20. Potem smo uporabili napravo Nano Drop količinsko stopnjo spajanja BRCAA1 protiteles s FMNPs-COOH. Pred pripajanje reakcijo, smo izmerili skupno koncentracijo BRCAA1 protitelesa. Po spenjanje reakcijo, smo merili koncentracije BRCAA1 protiteles v preostale reakcijske zmesi in izračunali stopnje vezanosti v skladu z enačbo:
sklopke (%) = (1-Koncentracija BRCAA1 protitelesa v preostale reakcijski zmesi /skupno koncentracijo BRCAA1 protitelesa) × 100.
kot pripravljenih nanoprobes in čiste FMNPs bilo značilno transmisijsko elektronsko mikroskopijo in fotoluminiscence (PL) spektrometrijo in Zeta potencialnem analizatorja.
Nanoprobes za in vitro
ciljanje slikanje želodca rakavih celic
uporabimo želodčnega raka celična linija MGC803 celice s pretirano izražena BRCAA1 proteina smo uporabili kot ciljne celice človeških fibroblastne celice brez izraženega BRCAA1 proteina kot kontrolo smo gojili in pobere, nato pa smo obdelali s 50 ug /ml BRCAA1-FMNPs nanoprobes in gojimo v navlaženi 5% CO 2 uravnotežene zraka inkubatorju pri 37 ° C za 4 ure, medtem ko je MGC803 in fibroblastne celice človeških smo obdelali z FMNPs kot kontrolno skupino. Potem smo celice splaknemo s PBS trikrat in nato pritrjene celice z 2,5% raztopino glutaraldehida 30 min. Za jedrsko counterstaining so MGC803 inkubirali z 1 mM Hoechst 33258 v PBS za 5 min. Celice smo s fluorescenčno mikroskopom (NIKON TS100-F) opazili, in posnel instrument GE HDX 3.0T MR slikanje opremljeno z ParaVision 3,0 programske opreme.
Uporabili smo tudi pretočnim citometrom oceniti želodčnega raka celico ciljanje sposobnost BRCAA1- FMNPs nanoprobes.

• Deep zaporedja raka želodca razkriva somatskih mutacij, ki so pomembni za osebno medicine
• BariSurg preskušanje: rokav želodca v primerjavi Roux-en-Y želodčni obvod pri debelih bolnikih z ITM 35-60 kg /m2 - multi-center naključno potrpežljivi in ​​opazovalec slepi neinferiornost trial