BRCAA1 monoklonaal antilichaam geconjugeerd fluorescerende magnetische nanodeeltjes voor in vivo doelgerichte magnetofluorescent beeldvorming van de maag cancer

BRCAA1 monoklonaal antilichaam geconjugeerd fluorescerende magnetische nanodeeltjes voor in vivo
gerichte magnetofluorescent beeldvorming van maagkanker
Abstracte achtergrond
Maagkanker is 2e meest voorkomende vorm van kanker in China, en is nog steeds de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in de wereld. Hoe vroege maagkanker cellen herkennen blijft een grote uitdaging voor de vroege diagnose en behandeling van patiënten met maagkanker. Dit onderzoek is bedoeld om een ​​soort multifunctionele nanoprobes ontwikkelen in vivo
gerichte magnetofluorescent beeldvorming van maagkanker.
Methods
BRCAA1 monoklonaal antilichaam werd bereid, werd toegepast als eerste antilichaam aan 50 paren specimens van gastrische vlek kanker en de controle van de normale maag slijmvliezen en geconjugeerd met fluorescerende magnetische nanodeeltjes met 50 nm in diameter, werden de resulterende BRCAA1-geconjugeerde fluorescerende magnetische nanosondes gekenmerkt door transmissie elektronenmicroscopie en fotoluminescentie spectrometrie, werden zo voorbereid nanosondes geïncubeerd met maagkanker MGC803 cellen, en werden geïnjecteerd in muizen model geladen met maagkanker van 5 mm diameter via staartader en werden vervolgens afgebeeld door fluorescentie optische beeldvorming en magnetische resonantie imaging, werd de biologische verdeling onderzocht. De weefselcoupes werden waargenomen door fluorescentie microscopie, en de belangrijke organen zoals hart, longen, nieren, hersenen en lever werden geanalyseerd door hematoxyline en eosine (HE) methode vlek.
Resultaten
BRCAA1 monoklonaal antilichaam werd met succes opgesteld, BRCAA1 eiwit tentoongesteld over-expressie in 64% maagkanker weefsels, geen expressie in de controle normale maag slijmvliezen bestaat er statistisch verschil tussen de twee groepen (P Restaurant < 0,01). De BRCAA1-geconjugeerde fluorescerende magnetische nanosondes vertonen zeer lage toxiciteit, lagere magnetische intensiteit en lagere fluorescentie-intensiteit met een piek-blue-shift dan pure FMNPs, kunnen worden endocytose door maagkanker MGC803 cellen, kon richten in vivo
maagkanker weefsels geladen bij muizen en kunnen worden gebruikt om het maagkanker weefsel met fluorescent imaging en magnetische resonantie imaging en voornamelijk in lokale maagkanker weefsels binnen 12 uur na de injectie. HE vlek analyse toonde aan dat geen duidelijke schade aan belangrijke organen werden waargenomen.
Conclusies
krachtige BRCAA1 monoklonaal antilichaam-geconjugeerde fluorescerende magnetische nanodeeltjes kunnen richten in vivo
maagkanker cellen, kan worden gebruikt voor gelijktijdige magnetofluorescent beeldvorming, en kunnen een groot potentieel in toepassingen zoals dual-model imaging en lokale thermische behandeling van de vroege maagkanker in de nabije toekomst te hebben. achtergrond
maagkanker was ooit de tweede meest voorkomende vorm van kanker in het woord [1]. Up to date, in de Verenigde Staten, maag maligniteit momenteel de 14e meest voorkomende kanker en 2de meest voorkomende kanker bij China [2, 3]. Maagkanker is nog steeds de tweede meest voorkomende oorzaak van aan kanker gerelateerde dood in de wereld, en blijft moeilijk te genezen, omdat de meeste patiënten aanwezig met gevorderde ziekte. Daarom, hoe te herkennen, te volgen of te doden vroege maagkanker cellen is zeer sleutel voor vroegtijdige diagnose en behandeling van patiënten met maagkanker.
Up to date, op zoek naar biomarkers nauw verbonden met maagkanker is nog steeds een belangrijke taak. Sinds 1998 hebben we al wordt geprobeerd om een ​​vroege maag-systeem kanker pre-waarschuwing [4], vast te stellen en hopen deze pre-warning systeem te gebruiken om vroege maagkanker cellen op te sporen aan de patiënten te herkennen met vroege maagkanker. Hoewel sommige verschillend uitgedrukte genen geassocieerd met vroege maagkanker werden geïdentificeerd [5, 6], kan niemand gen worden bevestigd specifieke biomarker van maagkanker is. Daarom, met het oog op het begin van maagkanker cellen herkennen, selecteren we enige potentiële biomarkers in verband met maagkanker, en combineer nanodeeltjes en moleculaire beeldvormende technieken, proberen om in vivo
vroege maagkanker cellen door in vivo
tumor gerichte beeldvorming vinden . In ons eerdere werk, we gescreend en gekloond BRCAA1 gen (borstkanker geassocieerd antigeen 1 gen) van borstkanker cellijn MCF-7cells [AF208045, ook wel ARID4B (AT-rijke, interactieve-domein-bevattende eiwit 4B)], en geïdentificeerd zijn antigeen epitoop peptide SSKKQKRSHK [7, 8]. We bereidden ook BRCAA1 polyklonaal antilichaam, en merkte op dat de BRCAA1 eiwit vertoonde over-expressie in bijna 65% klinische monsters van maagkanker weefsels [9-11]. We waargenomen dat BRCAA1 antigeen overexpressie gebracht bij maagkanker cellijnen zoals MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO III cellen en MGC803. Daarom voorspellen we dat BRCAA1 eiwit één potentiële richtende molecule in vivo
maagkanker cellen.
Kan laatste jaren hebben molecular imaging technologieën op basis van multifunctionele nanosondes grote vooruitgang geboekt. Zo hebben nanodeeltjes zoals quantum dots, magnetische nanodeeltjes en goud nanorods, etc. gebruikt voor moleculaire beeldvorming [12-19]. Tot nu toe een aantal kleine dieren imaging technologieën zijn ontwikkeld, zoals optische beeldvorming (OI) van bioluminescentie (BLI), fluorescentie (FLI) en intravitale microscopie (IVM), micro-PET, MRI en CT [20-26]. Onder al deze technologieën, hoe ze hun ruimtelijke resolutie en weefsel diepte gevoeligheid te verbeteren is een grote uitdaging. Dusver in vivo
tumorweefsels met meer dan 1 cm in diameter kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door CT, MRI, PET en bioluminescentie, tumoren met minder dan of gelijk aan 5 mm in diameter is moeilijk te vinden in klinische patiënten. In onze vorige verslagen werden fotosensitizer-geconjugeerde magnetische nanodeeltjes met succes gebruikt voor in vivo
gelijktijdige magnetofluorescent beeldvorming en therapie gericht [27]. De targeting vermogen van nanoprobes was sterk afhankelijk van magnetische nanodeeltjes. We bereidden een multifunctionele ribonuclease-A-geconjugeerd CdTe quantum dot cluster nanosystem voor synchrone kanker beeldvorming en therapie [28], de richtende vermogen van zo bereide nanosondes afhankelijk van RGD peptide. Sommige studies tonen aan dat HER-2 eiwit vertoont abnormale expressie in 6-35% maagkanker weefsels [29, 30] en werd gebruikt als therapeutisch doel voor klinische patiënten met maagkanker [31] dan ook HER-2 eiwit bezit een groot potentieel in de beeldvorming en therapie van maagkanker. Echter, tot op heden geen rapport toont aan dat gerichte beeldvorming en therapie in vivo
maagkanker is gebaseerd op biomarkers geassocieerd met maagkanker.
Afgelopen jaren we regelbaar bereid met siliciumdioxide beklede kwantumdots super-paramagnetische nanodeeltjes composieten (FMNPs) met sterke fluorescerende signalen en uitstekende magnetische eigenschappen, en hebben ze gebruikt voor bio-etikettering, tracking stamcellen, bio-scheiding, gericht op beeldvorming en hyperthermie van tumoren [29-32], zagen we ook dat als bereide nanodeeltjes bezitten goede biocompatibiliteit en stabiliteit [33-38].
In deze paper, we ten volle gebruik maken van de voordelen van FMNPs en BRCAA1 antigen, bereid monoklonaal antilichaam tegen BRCAA1 eiwit, en bereid BRCAA1 monoklonaal antilichaam-geconjugeerde fluorescerende magnetische nanosondes (BRCAA1- FMNPs), toegepast naakt muizenmodel geladen met maagkanker van 5 mm in diameter en IVIS beeldvormingssysteem en Magnetic Resonance Imaging, bestudeerden de haalbaarheid van zo bereide nanosondes voor niet-invasief in vivo
gerichte dubbele modale beeldvorming van maagkanker. Resultaten tonen aan dat als bereide nanosondes kan worden gebruikt voor in vivo
dual-model beeldvorming van maagkanker en kan een groot potentieel hebben toepassingen zoals dubbele-model beeldvorming en plaatselijke thermische behandeling van vroege maagkanker in de nabije toekomst.
Resultaten en discussie
Karakterisering van anti-BRCAA1 monoklonaal antilichaam
Zoals getoond in Tabel 1, verkregen wij met succes twee positieve kloon cellijnen S-S-200-5 en 335-5, de titers verschilden tenslotte we gekozen voor de anti-BRCAA1 monoklonaal antilichaam van S-200-5-cellijn als het eerste antilichaam om vlekken maagkanker weefsels en controle weefsels. We vonden dat BRCAA1 eiwit vertoonde overexpressie in 64% maagkanker weefsels geen expressie in normale controle maagslijmvlies weefsels, zoals weergegeven in figuur 1, bestaat statistisch verschil tussen de twee groepen (P
< 0,01). Dit resultaat is bijna identiek aan onze eerdere rapport [4, 9-11], die sterk suggereert dat BRCAA1 antigeen kan worden geselecteerd als potentieel doel voor de meeste maagkanker, indien zo bereide nanosondes kan 64% patiënten herkennen met vroege maagkanker, het zal zeer nuttig zijn voor de diagnose en behandeling van klinische maagkanker patients.Table 1 Titers van BRCAA1 monoklonale antilichamen in ascites vloeistof geïnduceerd door Hybridoma klonen cellen door ELISA
is
antilichaamtiter *
Clone
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) -BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1.024.000
1.024.000 Restaurant < 1000 Restaurant < 1000
S-335- 5
128.000
512.000 Restaurant < 1000 Restaurant < 1,000
* de wederzijdse van ascitesvloeistof verdunning, de eerste verdunning van ascitesvloeistof was. 1: 1000
** de antigenen werden bekleed op de ELISA-plaat.
Figuur 1 Expressie van BRCAA1 eiwit bij maagkanker weefsels en normale controle van de maag slijmvliezen. A: maagkanker weefsels × 100; B: normale controle weefsels × 50.
Bereiding en karakterisering van BRCAA1- FMNPs nanosondes
Zoals getoond in Figuur 2A, bereid FMNPs bestonden uit silica verpakte CdTe en magnetische nanodeeltjes, grootte waren 50 nm of zo in diameter. Zoals getoond in figuur 2D, na FMNPs werden geconjugeerd met anti-BRCAA1 antilichaam fotoluminescentie als bereid nanosondes (PL) intensiteit lager dan FMNPs, vertonen linkershifttoets van 40 nm, die vanwege de verminderde de polarisatie bedroeg van het omringende moleculen, resulterend in de vermindering van stokes verschuiving, uiteindelijk resulterend in een blauwe verschuiving in de emissiespectra. Ook magnetische intensiteit als bereide nanosondes was lager dan FMNPs. Figuur 2 Karakterisering van anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes. A: HR-TEM beeld van FMNPs; B: magnetische eigenschap van anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes; C: Zeta-potentieel van FMNPs met aminogroep, COOH, Si-O-groep; D:. PL spectra van FMNPs geconjugeerd met en zonder BRCAA1 antilichaam
In het kader van de voorbereiding van BRCAA1-FMNPs nanosondes, vonden we dat het oppervlak functionalisering van FMNPs was zeer sleutel tot anti-BRCAA1 antilichaam met FMNPs vervoegen via covalente binding. Zoals getoond in Figuur 2C, verschillende functionele groepen FMNPs verschillende zeta-potentiaal waarden. FMNPs had negatieve Si-O-groep, hun Zeta-potentiële waarde was -34,05 mV, de FMNPs met aminogroep positieve zeta-potentiële waarde van 24,80 mV, FMNPs met carboxylgroep hadden negatief zeta-potentiële waarde van -30,50 mV. We vonden dat carboxylgroepen op het oppervlak van FMNPs geconjugeerd met anti-BRCAA1 antilichaam eenvoudiger dan aminogroepen op het oppervlak van FMNPs. Zoals weergegeven in tabel 2, de gemiddelde koppeling snelheid van anti-BRCAA1 antilichaam met FMNPs-COOH was 80,28% .table 2 Koppeling snelheid meten van FMNPs-anti-BRCAA1 antilichaam

Totaal concentratie van het anti-BRCAA1 antilichaam (ng /ul)
de concentratie van het anti-BRCAA1 antilichaam in overblijvende reactiemengsel (ng /ul)
Coupling rate (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
As-voorbereid nanosondes voor in vitro
gerichte maagkanker cellen
Targeting vermogen van as-bereide nanosondes in vitro
werden waargenomen door middel van fluorescentie microscoop en berekend door FACSCalibur Flow cytometer. Zoals getoond in figuur 3, FMNPs willekeurig verspreid in het inwendige van het cytoplasma, en anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes bestond rond de nucleolus. Zowel FMNPs en bereid BRCAA1-FMNPs nanosondes kan na 4 uur incubatie in het cytoplasma van cellen binnen MGC803 met MGC803 cellen, zoals getoond in figuur 4A, kan FMNPs 25,23% label MGC803 cellen, het blijven 74,77% cellen kunnen niet worden gelabeld. Zoals getoond in figuur 4B, 45,92% MGC803 cellen kunnen worden gelabeld door het BRCAA1-FMNPs nanosondes. Wanneer FMNPs en anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes respectievelijk werden met MGC803 cellen en menselijke fibroblast cellen gedurende 0,5 uur, zagen we heel wat anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes in MGC803 cellen aangegaan, weinig nanosondes in menselijke fibroblast cellen ingevoerd, enkele FMNPs kon aangaan MGC803 cellen en menselijke fibroblast cellen, die sterk suggereren dat de anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes specifiek kan richten MGC803 cellen. De MRI beeldvorming van MGC803 cellen en humane fibroblast cellen geïncubeerd met anti-BRCAA1-FMNPs gedurende 4 uur worden getoond in figuur 5, MGC803 cellen vertoonden sterke magnetische signaal dan menselijke fibroblastcellen (HDF), die tevens bleek dat de bereide nanosondes kunnen targeten MGC803 cellen specifiek. Figuur 3 In vitro fluorescentie beelden van MGC 803 na behandeling met FMNPs en FMNPs-BRCAA1 nanodeeltjes (Vergroting = × 200). De top groep afbeeldingen geïllustreerd FMNPs willekeurig te verdelen in het cytoplasma, de onderste groep van beelden tentoongesteld FMNPs-BRCAA1 verspreid rond de nucleolus en het was goed targeting mogelijkheid om de MGC803.
Figuur 4 FACSCalibur Flow cytometer analyse van MGC803 gelabeld met FMNPs en FMNPs-BRCAA1. A: de MGC803 behandeld met 50 ug /ml FMNPs gedurende 24 uur vertoonden 25,23% cellen werden gelabeld met FMNPs. B: de MGC803 behandeld met 50 ug /ml FMNPs-BRCAA1 gedurende 24 uur geïllustreerde tot 45,92% cellen werden gelabeld met FMNPs-BRCAA1
Figuur 5 MR beeldvorming van MGC803 cellen en HDF-cellen.. A: MGC803 cellen met anti-BRCAA1-FMNPs. B: HDF-cellen met anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 cellen met alleen FMNPs
As-voorbereid nanosondes voor fluorescerende beeldvorming van in vivo
maagkanker cellen Belgique Om tumor gerichte eigenschappen van anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes, naakt muismodellen geladen met MGC- evalueren 803 maagkanker cellen werden bereid en onder een niet-invasieve wijze gecontroleerd op 12 uur met IVIS fluorescentie afbeeldingssysteem.
door het monitoren van real-time fluorescentie-intensiteit in het hele lichaam, de tumor targeting karakter van de anti-BRCAA1- FMNPs sonde werd gemakkelijk bepaald in het naakt muizen geladen met maagkanker MGC803 cellen. Zoals getoond in figuur 6A, het gehele dieren geproduceerde fluorescentiesignalen binnen 30 min na injectie van nanoprobes, de onderhuidse tumorweefsels kon duidelijk worden afgebakend van de omringende achtergrond weefsel tussen 1 uur en 12 uur na de injectie, met maximum contrast optreedt bij 6 uur na de injectie. Sterk fluorescentiesignaal werd nog aantoonbaar in de tumorplaats op 6 uur na injectie, waaruit bleek dat de anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes voorkeur zijn opgebouwd in de tumorweefsels. Inderdaad basis van de resultaten in figuur 6B, de hogere tumor achtergrondverhouding (TBR) waarde sterk aanbevolen dat als bereide nanosondes voorkeur geaccumuleerd in tumorweefsels in vergelijking met normale controle weefsels. Dit werd bevestigd door fluorescentie afbeeldingen, waaruit bleek dat het fluorescentiesignaal van zo bereide nanosondes in de tumorplaats was het sterkst bij alle muizen organen zoals getoond in figuur 6C. Bovendien, na 12 uur na de injectie van anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes fluorescentie-intensiteit in de tumor nog duidelijk waargenomen, terwijl de opname van bereide nanoprobes in normale organen was niet duidelijk. Deze gegevens sterk suggereren dat bereid nanosondes zeer efficiënt tumor weefsels in naakt muizen geladen met maagkanker kunnen richten. We hebben ook opgemerkt dat deze nanosondes in de gehele muis lichaam bijna volledig verdween 12 uur na de injectie, we merken op dat de nanosondes verlaten uit het cholecyst systeem (gegevens niet getoond), de tijdsafhankelijke cholecyst klaring van nanoprobes stel dat als -bereide nanosondes kan niet blijven binnen naakt muizen voor langere tijd, dus, als bereide nanosondes bezitten goede bioveiligheid. Figuur 6 In vivo fluorescentie beelden van de tumor accumulatie en distributie van weefsel voor FMNPs-BRCAA1 nanodeeltjes in MGC803 menselijke maag-tumordragende athymische naakt muizen. A, In vivo
fluorescentie beelden van athymische naakt muizen met. MGC803 menselijke maag tumor werd verkregen na injectie van FMNPs-BRCAA1 nanodeeltjes op verschillende tijdstip. De tumor locatie wordt aangegeven met een pijl. A-1: 0 uur, A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 h, A-6: 12 uur. B, TBR [Tissue op de achtergrond (spier) verhouding] waarde. TBR = (Tumor signaal-achtergrond signaal) /(achtergrondsignaal): de TBR waarde werd als volgt bepaald. C, ex vivo
fluorescentie beelden van ontleed organen en tumor van muizen met MGC803 menselijke maag tumor opgeofferd om 12 uur na injectie van FMNPs-BRCAA1 nanodeeltjes. De fluorescentiebeelden van ontlede organen en tumoren werden verkregen met fluorescentie- beeldvormingstechniek met een 630 nm emissiefilter. D, biologische verdeling van anti-BRCAA1 FMNPs in muizen na intraveneuze injectie. Verschillende tijdstippen na injectie, ijzer bedragen weefselmonsters werden geëvalueerd door ICP-massaspectrometrie (n = 3).
Pathologische analyse van tumor en belangrijke organen
In vitro evaluatie
geëxcideerde belangrijkste weefsels waaronder lever, long , milt, nieren en het hart, en de tumor aan dat de anti-BRCAA1-FMNPs probes waren hoofdzakelijk uit door de tumorweefsels die sterke fluorescentiesignalen getoond, zie figuur 7, terwijl andere weefsels waaronder lever , long, milt en hart-up nam anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes zeer minder, wat furtherly aangeeft dat als bereide BRCAA1-FMNPs nanosondes kunnen richten maagkanker weefsels. Wij gebruikten ook HE kleuring naar alle organen te controleren, werden geen duidelijke schade waargenomen in belangrijke organen [zie aanvullende file 1]. Figuur 7 Resultaat van Immunofluorescentie Analysis. Een tumorweefsel. B, lever. (Vergroting = × 200).
As-voorbereid nanosondes voor MR beeldvorming van naakt muizen geladen met maagkanker
In vivo
MRI werd uitgevoerd op muizen naakt geladen met onderhuidse maagkanker op 12 uur na de injectie . Representatieve beelden van T2 kaarten worden getoond in figuur 8, na het injecteren van de nanosondes, een significante verandering in signaalintensiteit waargenomen in bepaalde gebieden van tumoren, hetgeen aangeeft dat bestond accumulatie van de nanosondes in tumorplaats zoals getoond in figuur 8B, als de pijl toonde. Als controle nadat de muizen model met maagkanker geïnjecteerd FMNPs gedurende 12 h, werden de muizen uitgevoerd MRI, die niet intensief signaal tumoroppervlak (figuur 8A) vertoonden. Figuur 8 MRI beeld van muizen. A, FMNPs zonder koppeling BRCAA1 B, FMNPs gekoppeld BRCAA1
potentieel mechanisme targeting imaging
laatste jaren molecular imaging technieken zijn gebruikt voor real-time en niet-invasieve beeldvorming van in vivo
tumorweefsels [39-43]. Bijvoorbeeld, quantum dots, vanwege hun unieke fotoluminescente eigenschappen, zijn gebruikt voor bio-labeling en fluorescerende beeldvorming [11-13, 33, 43], maar quantum dots "toxiciteit beperkt zijn toepassing in het menselijk lichaam, voorzover enige veilige quantum dots ontwikkeld. Magnetische nanodeeltjes zijn ook toegepast als contrastmiddelen voor MRI reagens [15, 33, 36]. Tegelijkertijd, combinatie van twee beeldvormende modaliteiten verschaft de voordelen van beide dan via een methode die uitgebreide informatie over tumorlokalisatie, milieu en status zou bieden.
In deze studie werd ontworpen en vervaardigd een nieuwe afbeeldingsonde, die was samengesteld uit silicium verpakte kwantumdots magnetische nanodeeltjes met als doel het verbeteren van hun biocompatibiliteit. Onze resultaten tonen aan dat bereid silicium verpakt kwantumdots magnetische nanodeeltjes zijn zeer stabiel en eigen sterke fluorescentiesignalen en magnetische intensiteit. Met de sterke fluorescentiesignalen van zo bereide nanosondes we met succes de fluorescerende beelden van in vivo
maagkanker weefsels verkregen met 5 mm diameter in naakt muizen model. Met het sterke magnetische signalen als bereid nanosondes, we ook met succes MR afbeeldingen in vivo
maagkanker weefsels verkregen met 5 mm diameter in naakt muizen model. Vergeleken met eerdere verslagen grotere omvang van tumorweefsels (> 5 mm) kan gemakkelijk worden afgebeeld door fluorescentie beeldvorming en MRI beeldvorming, als contrast, onze resultaten tonen aan dat als bereide nanosondes kunnen kleinere omvang van tumorweefsels detecteren (minder 5 mm in diameter), die de gevoeligheid van de detectie werkwijze aanzienlijk verbeterd. Ons resultaat is ook de eerste keer om dual-modale targeting beeldvorming van in vivo
maagkanker weefsels te melden.
Hoe richten in vivo
maagkanker weefsels is ook een voor beroep vatbare probleem. Tot op heden werden geen specifieke biomarkers maagkanker gerapporteerd. Hoewel HER-2 eiwit werd bevestigd dat positieve uitdrukking hebben 6-35% van maagkanker weefsels [28-31], HER-2 eiwit vertoont ook overexpressie in veel tumorweefsels zoals borstkanker, longkanker, darmkanker, etc, dus HER-2 niet specifieke biomarker voor maagkanker is. Onze resultaten toonden dat BRCAA1 antigeen alleen overexpressie gebracht in 64% of zo van maagkanker weefsel van klinische operatiepatiënten, we bevestigd dat BRCAA1 antigeen overexpressie wordt gebracht in bepaalde maagkanker cellijnen zoals MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III en MGC803 [6-9]. We gebruikten MGC803 cellen naakt muizenmodel geladen met maagkanker bereiden en succesvol opgemerkt dat als bereide nanosondes voorkeur geaccumuleerd in tumorweefsels in vergelijking met normale controle weefsels, en de post-injectietijd verhoogd. We waargenomen dat geïnjecteerd nanosondes in het geheel vertoonde de tijdsafhankelijke verklaring en de fluorescentiesignalen geleidelijk af als de tijd als gevolg van de lever-cholecyst uitscheiding en nier helderheid van zo bereide nanosondes. Verscheidene verslagen blijkt dat nier alleen heldere nanodeeltjes met 5 nm in diameter, in onze studie hebben we vastgesteld dat als bereid nanosondes met 50 nm in diameter ook kan worden afgewikkeld binnen 12 uur. Dit beton mechanisme is aan de gang.
Nanoprobe bioveiligheid is ook een belangrijk probleem [44], waarin de toepassing vooruitzicht als bereide nanosondes beslist. Onze resultaten volledig toonden aan dat als bereide nanosondes geen belangrijke organen zoals lever, nier, hart, long, etc. niet beschadigde, deed ook lange termijn vertonen die in belangrijke organen, die sterk suggereren dat als bereid nanosondes bezitten goede biocompatibiliteit en hebben een groot potentieel in toepassingen zoals dubbele model beeldvorming en selectieve behandeling van vroege maagkanker.
Conclusie We
succes bereid nieuwe anti-BRCAA1-FMNPs nanosondes, die kan worden gebruikt voor in vivo
twee modale imaging zoals fluorescerende beeldvorming en magnetische resonantie imaging, en eigenaar van een duidelijk specifiek richten op het vermogen in de richting van een maagkanker weefsels met 5 mm in diameter gedurende 0,5 uur en 12 uur post-injectie, en de eigen goede biocompatibiliteit. Dit zou de eerste verslag. De zo bereide multifunctionele nanosondes kan ook worden gebruikt voor hyperthermie behandeling van maagkanker onder in vitro
wisselend magnetisch veld bestraling en hebben een groot potentieel in toepassingen zoals gelijktijdige beeldvorming en therapie gericht op klinische maagkanker in de nabije toekomst.
Materialen en werkwijzen
Bereiding van anti-BRCAA1 monoklonale antilichamen
Animal experimenten werden uitgevoerd volgens de Richtlijnen voor Animal Care en gebruik Comite, Shanghai Jiao Tong University. Monoklonale antilichamen werden bereid tegen een gezuiverde fusieproteïne BRCAA1. BALB /c vrouwelijke muizen, 4-6 weken oud, werden gekocht bij de Shanghai LAC Laboratory Animal Co. Ltd., de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). De muizen werden geïmmuniseerd door intraperitoneale injectie met 50 ug gezuiverd BRCAA1 eiwit dat werd geëmulgeerd met een gelijk volume Freunds compleet adjuvans. Drie verdere injecties werden toegediend via onvolledig adjuvans om de twee weken. Drie dagen na de laatste injectie werden de miltcellen van de muizen geoogst en gefuseerd met Sp 2/0 muizen myeloma cellijn. Na 10-14 dagen werden de kweeksupernatanten onderzocht met een ELISA test waarbij de vaste fase bekleed met recombinant eiwit BRCAA1 (2 ug /ml) voor het immuniseren. Aan de screening, de monoklonale antilichamen binden met beklede BRCAA1 eiwit werden geselecteerd. Door twee keer beperkende verdunning, werden positieve kolonies gesubkloneerd. Ascitesvloeistoffen werden geoogst uit muizen geprimed met 0,5 ml intraperitoneale injectie pristaan ​​en vervolgens geïnjecteerd met 10 6 hybridomacellen. De klasse en subklasse van elk mAb werd bepaald onder toepassing van een monoklonaal antilichaam Isotypering Kit (Hy Cult Biotechnology B.V., Nederland). De mAbs werden gezuiverd uit de muis ascetische fluïda met een eiwit G-Sepharose 4FF kolom (Pharmacia, Uppsala, Zweden) volgens de instructies van de fabrikant om componenten die kunnen interfereren met de experimenten biopanning verwijderen. De antilichaamtiters werden bepaald door ELISA werkwijzen [45]. Tot slot een geprepareerde anti-BRCAA1 monoklonale antilichamen werd gebruikt als eerste antilichaam tot 50 exemplaren van maagkanker vlekken en de controle van de maag slijmvliezen, die in Shanghai werden verzameld uit Changzheng Hospital en No.1 People Hospital en geïdentificeerd door pathologisch onderzoek.
voorbereiding en Surface functionalisering van FMNPs
voorbereiding van Fe 3O 4 nanodeeltjes is gebaseerd op de co-precipitatie van ferro- en ferri-ion-oplossingen (1: 2 molverhouding) [46-49]. CdTe nanokristallen werden volgens onze eerdere rapport als volgt gesynthetiseerd: CDCIs 2 (5 mmol) werd opgelost in 110 ml water en 12 mmol TGA werden onder roeren toegevoegd, gevolgd door de pH op 11 door druppelsgewijze toevoeging van 1 M NaOH oplossing. De gemengde oplossing werd in een driehalskolf ontlucht door N 2 borrelen gedurende 30 minuten. Onder roeren, 2,5 mmol zuurstofvrij NÄHTE oplossing werd geïnjecteerd in de driehalskolf, die vers bereid uit tellurium poeder en NaBH 4 (molaire verhouding van 1: 2) in water bij 0 ° C. De resulterende oplossing werd ongeveer 4 mg /ml, en 3,5 nm diameter product geëmitteerd met een maximum rond 630 nm. Fluorescerende magnetische nanodeeltjes (FMNPs) werden bereid met behulp van de reverse micro-emulsie aanpak. Voordat het koppelen van de FMNPs met de BRCAA1 we eerst gefunctionaliseerd het oppervlak functionele groep van FMNPs als carboxylgroep. 95 ml ethanol en 2 ml 3-aminopropyltriethoxysilaan (APS) werden toegevoegd aan een gemengde oplossing te vormen en men liet reageren bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Het aminosilaan gemodificeerde FMNPs werden gescheiden met permanente magneet en werden gewassen met gedeioniseerd water driemaal. Vervolgens opnieuw gedispergeerd de FMNPs-NH 2 in 100 ml dimethylformamide (DMF), overmatige barnsteenzuuranhydride toegevoegd aan een gemengde oplossing te vormen en reageren bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. De carboxyl-gemodificeerde FMNPs werden drie keer gescheiden door permanente magneet weer en gewassen met gedeïoniseerd water.
Bereiding en karakterisering van BRCAA1 antilichaam geconjugeerd FMNPs
We gebruikten twee stappen stabiele anti-BRCAA1-FMNPs conjugatie vinden [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg FMNPs-COOH werd gedispergeerd in 2 ml PBS-buffer pH 7, en werd gesonificeerd gedurende 10 min. Daarna gemengd we 1 ml vers 400 mM EDC en 100 mM pH 6,0 NHSS in MES buffer en geroteerd bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Hierna werd de verkregen oplossing gescheiden door magnetisch veld en 1 mg /ml BRCAA1 monoklonaal antilichaam werd toegevoegd aan het bovenstaande mengsel, geroerd in donkere plaats gedurende 2 uur. Om vrij BRCAA1 verwijderen werd de resterende reactiemengsel gescheiden door magnetisch veld en de resterende vaste stof werd gewassen met 1 ml PBS-buffer driemaal. Tenslotte, 1 ml 0,05% Tween-20 /PBS werd aan het BRCAA1-FMNPs conjugatie en de uiteindelijke bio- conjugatie werd bewaard bij 4 ° C toegevoegd. Toen we, dient deze BRCAA1-FMNPs conjugatie worden verdund met PBS /0,05% Tween-20. Dan hebben we de Nano Drop apparaat om de koppeling snelheid van BRCAA1 antilichaam met FMNPs-COOH te kwantificeren. Vóór koppelingsreactie, maten we de totale concentratie van BRCAA1 antilichaam. Na koppelingsreactie, maten we de BRCAA1 antilichaamconcentratie in overblijvende reactiemengsel en berekende de koppelingspercentage volgens de vergelijking:
Coupling (%) = (1-concentratie van antilichaam in BRCAA1 resterende reactiemengsel /totale concentratie BRCAA1 antilichaam) × 100.
De as-bereide nanosondes en pure FMNPs werden gekenmerkt door transmissie elektronenmicroscopie en fotoluminescentie (PL) spectrometrie, en Zeta potentieel analyzer.
nanosondes voor in vitro
targeting beeldvorming van maagkanker cellen
maagkanker cellijn MGC803 cellen met overexpressie BRCAA1 eiwit werden gebruikt als doelcellen, menselijke fibroblast cellen zonder expressie BRCAA1 eiwit werd als controle, werden gekweekt en verzameld en vervolgens werden behandeld met 50 ug /ml BRCAA1-FMNPs nanosondes en gekweekt in een bevochtigde 5% CO 2 gebalanceerde lucht incubator bij 37 ° C gedurende 4 uur, ondertussen het MGC803 en menselijke fibroblast cellen werden behandeld met FMNPs als controlegroep. Daarna werden de cellen drie keer, en gefixeerde cellen met 2,5% glutaaraldehyde-oplossing gespoeld met PBS gedurende 30 minuten. Voor nucleaire tegenkleuring werden MGC803 geïncubeerd met 1 mM Hoechst 33258 in PBS gedurende 5 minuten. De cellen werden waargenomen door fluorescentiemicroscoop (Nikon TS100-F) en afgebeeld door GE HDX 3.0T MRI toestel met ParaVision 3,0 software.
We gebruikten ook de flowcytometer de maagkanker celgericht vermogen van BRCAA1- evalueren FMNPs nanosondes.

• Deep sequencing van maagcarcinoom onthult somatische mutaties aan gepersonaliseerde geneeskunde relevant
• BariSurg proef: Sleeve gastrectomie versus Roux-en-Y gastric bypass in obese patiënten met een BMI 35-60 kg /m2 - een multi-center gerandomiseerde patiënt en waarnemer blind non-inferioriteit studie