BRCAA1 monoklonálna protilátka konjugovaná fluorescenčné magnetických nanočastíc pre in vivo cielené magnetofluorescent zobrazovanie rakoviny žalúdka

BRCAA1 monoklonálna protilátka konjugovaná fluorescenčných magnetických nanočastíc pre in vivo
cielené magnetofluorescent zobrazovanie rakoviny žalúdka
abstraktné
pozadia
rakovinou žalúdka je 2th najčastejšou rakovinou v Číne, a je stále druhou najčastejšou príčinou rakoviny -příbuzné smrti vo svete. Ako rozpoznať prvé rakovinové bunky žalúdočné je stále veľkou výzvou pre včasnú diagnózu a liečbu pacientov s rakovinou žalúdka. Táto štúdia je zameraná na rozvoj jeden druh multifunkčných nanosondami pre in vivo cielené
magnetofluorescent zobrazovania rakoviny žalúdka.
Metódy
BRCAA1 monoklonálne protilátky bol pripravený, bol použitý ako prvý protilátky na škvrnu 50 párov vzoriek žalúdka a liečbe zhubných nádorov normálne žalúdočnej sliznicou, a konjugované s fluorescenčnými magnetických nanočastíc s 50 nm v priemere, výsledné BRCAA1 konjugovanú fluorescenčné magnetické nanosondy boli charakterizované pomocou transmisný elektrónové mikroskopie a fotoluminiscenčná spektrometrie, as-pripravené nanosondy boli inkubované s rakovinou žalúdka MGC803 buniek, a bolo do myšiam modelu naložené rakovinou žalúdka 5 mm v priemere cez chvostovej žily, a potom boli zobrazené fluorescencie optického zobrazovania a zobrazovanie magnetickou rezonanciou, ich biodistribúcie bola skúmaná. Tkanivové rezy boli pozorované fluorescenčným mikroskopom a dôležité orgány, ako sú srdce, pľúc, obličiek, mozgu a pečeni boli analyzované metódou hematoxylínom a eosínu škvŕn (HE).
Výsledky
BRCAA1 monoklonálna protilátka bola úspešne pripravená, BRCAA1 proteín vykazoval nadmernú expresiu v 64% karcinómu žalúdka tkanív, nie v kontrolných normálnej žalúdočnej sliznice, existuje štatisticky významné rozdiely medzi oboma skupinami (P Hotel &0,01). BRCAA1 konjugovaná s fluorescenčné magnetické Nanosondy vykazujú veľmi nízku toxicitu, nižšia intenzita magnetického a nižšia intenzita fluorescencie so šiltom-modro-shift než čistý FMNPs, by mohla byť endocytován žalúdočnými rakovinových buniek MGC803, by sa mohli zamerať in vivo
rakovinou žalúdka tkanív naložené myšami, a môžu byť použité na obrazové žalúdočných rakovinové tkanive fluorescenčným zobrazovanie a zobrazovanie magnetickou rezonanciou, a distribuované najmä v miestnych žalúdočných tkanivách s rakovinou v rámci 12 hodín po injekcii. HE škvrna analýza ukázala, že žiadne zjavné škody boli pozorované u dôležitých orgánov.
Závery
vysoko výkonných BRCAA1 monoklonálnej protilátky konjugovanej s fluorescenčnými magnetických nanočastíc môžu byť zacielené na in vivo
rakovinové bunky žalúdka, môžu byť použité pre súčasnú magnetofluorescent imaging, a môže mať veľký potenciál v aplikáciách, ako je duálne zobrazovanie modelu a lokálnej tepelnej terapii skoré rakoviny žalúdka v blízkej budúcnosti.
pozadí
rakoviny žalúdka bol jednou druhou najčastejšou rakovinou v slove [1]. Až do dnešného dňa, v Spojených štátoch amerických, žalúdok zhubný nádor je v súčasnosti 14. najčastejšou rakovinou, a 2th najbežnejšie rakovinou v Číne [2, 3]. Karcinómu žalúdka je stále druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenia na svete a je stále ťažké liečiť, pretože u väčšiny pacientov prichádza s pokročilým ochorením. Preto, ako rozpoznať, sledovať alebo zabiť skoré rakovinové bunky žalúdočné je veľmi kľúčové pre včasnú diagnózu a liečbu pacientov s rakovinou žalúdka.
Až do dnešného dňa, hľadal biomarkerov úzko spojené s rakovinou žalúdka je stále dôležitou úlohou. Od roku 1998 sme boli súdení nastaviť skorý žalúdočné rakovina pre-systém varovania [4], a dúfať, že použitie tohto pre-varovný systém pre detekciu skoré rakovinové bunky žalúdočnej rozpoznať pacientov so skorými rakovinou žalúdka. Aj keď boli identifikované niektoré rôzne exprimované gény so vzťahom k skorej rakoviny žalúdka [5, 6], žiadny gén môže byť potvrdené, že je špecifický biomarker na rakovinu žalúdka. Preto, aby sa rozpoznať prvé rakovinové bunky žalúdočné, my len vybrať potenciálne biomarkery spojené s rakovinou žalúdka, a kombinovať nanočastíc a techník molekulárnej zobrazovanie, pokúste sa nájsť in vivo
skoré žalúdočné rakovinové bunky in vivo
nádoru cielené zobrazovanie , V našej predchádzajúcej práci sme vytriedené a klonovaný BRCAA1 gén (rakovina prsníka, antigénom asociovaným s 1 gén), z rakoviny prsníka bunkovej línie MCF-7cells [AF208045, nazývaný tiež ARID4B (AT-bohaté interaktívne doménu obsahujúce proteín 4B)], a identifikovať jeho antigén epitop peptidu SSKKQKRSHK [7, 8]. Sme tiež pripravené BRCAA1 polyklonálne protilátky, a pozoroval, že BRCAA1 proteín vykazoval nadmernú expresiu v takmer 65% klinických vzoriek žalúdočnej rakovinové tkanive [9-11]. Pozorovali sme tiež, že BRCAA1 antigén je nadmerne exprimovaný v žalúdočných nádorových bunkových línií, ako je MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO-III a MGC803 bunky. Preto predpokladáme, že BRCAA1 proteín môže byť jedna molekula potenciál zacielenie pre in vivo
žalúdočné rakovinové bunky.
V posledných rokoch sa technológia molekulárneho zobrazovania na báze multifunkčných nanosondami majú veľký pokrok. Napríklad nanočastice, ako sú kvantovej bodky, magnetických nanočastíc zlata a nanorods apod boli použité pre molekulárnu zobrazovanie [12-19]. Doteraz niekoľko malých zobrazovacie zviera technológie boli vyvinuté ako napríklad optického zobrazenia (OI) Bioluminiscencia (BLI), fluorescencie (FLI) a intravitální mikroskopia (IVM), mikro-PET, MRI a CT [20-26]. Zo všetkých týchto technológií, ako zlepšiť ich priestorové rozlíšenie a citlivosti hĺbka tkanivo je veľkou výzvou. Doteraz in vivo
nádorového tkaniva s viac ako 1 cm v priemere možno ľahko identifikovať pomocou CT, MRI, PET a Bioluminiscencia zobrazovanie nádorov s menej ako alebo rovný 5 mm v priemere, je veľmi ťažké nájsť v klinických pacientov. V našich predchádzajúcich správach fotosenzibilizátorom konjugovanú magnetické nanočastice boli úspešne použité pre in vivo
súčasným magnetofluorescent zobrazovania a zacielenie terapia [27]. Avšak, cielenie schopnosť nanosondami bol veľmi závislý na magnetických nanočastíc. Pripravili sme multifunkčné ribonukleázy-A-konjugovaný CdTe kvantová bodka klastra nanosystem pre synchrónne zobrazovanie a liečenie rakoviny [28], cielenie schopnosť ako pripravených nanosondami je závislá na RGD peptidu. Niektoré štúdie ukazujú, že HER-2 proteín vykazuje abnormálne expresiu v 6-35% tkanivách karcinómu žalúdka [29, 30], a bol použitý ako terapeutický cieľ pre klinické pacientov s karcinómom žalúdka, [31], a preto, HER-2 proteín vlastné veľký potenciál v zobrazovaní a liečba rakoviny žalúdka. Avšak, až do dnešného dňa, žiadna správa ukazuje, že cielené zobrazovanie a terapiu in vivo
rakoviny žalúdka je založený na biomarkerov spojených s rakovinou žalúdka.
V posledných rokoch sme riadené pripravený oxidu kremičitého potiahnuté kvantových bodiek a super-paramagnetické nanočastíc kompozity (FMNPs) so silnými fluorescenčných signálov a vynikajúcimi magnetickými vlastnosťami, a používajú ich pre bio-značenie, sledovanie kmeňové bunky, bio-oddelenie so zameraním imaging a hypertermiu nádorov [29-32], sme tiež poznamenal, že ako pripravené nanočastice vlastné dobrú biokompatibilitu a stabilitu [33-38].
V tomto článku budeme plne využívať výhody FMNPs a BRCAA1 antigénu, pripravené monoklonálne protilátky proti BRCAA1 bielkovín a pripravil BRCAA1 monoklonálnej protilátky konjugovanej s fluorescenčnými magnetických nanosondami (BRCAA1- FMNPs), ktorý je zamestnaný nahý model myši naloží s rakovinou žalúdka 5 mm v priemere a zobrazovacieho systému ivis a magnetickou rezonanciou, skúmala realizovateľnosť ako pripravených nanosondami pre neinvazívnu in vivo
cielené duálne modálne zobrazovanie rakoviny žalúdka. Výsledky ukazujú, že za-pripravené nanosondy môže byť použitý pre in vivo
duálne zobrazovanie modelu karcinómu žalúdka, a môže mať veľký potenciál v aplikáciách, ako je duálny modelu zobrazovanie a lokálnej tepelnej terapii skoré rakoviny žalúdka v blízkej budúcnosti.
Výsledky a diskusia
Charakterizácia anti-BRCAA1 monoklonálna protilátka
Ako je ukázané v tabuľke 1, sme úspešne získali dva pozitívne klon bunkové línie S-200-5 a S-335-5, ich titre boli rôzne, konečne sme zvolili anti-BRCAA1 monoklonálne protilátky z s-200-5 bunkové línie ako prvý protilátky farbiť žalúdočné rakovinové tkanive a kontrolné tkanivá. Zistili sme, že BRCAA1 proteín vykazoval nadmernú expresiu v 64% žalúdočné rakovinové tkanive, bez expresie v normálnej kontroly žalúdočných slizníc, ako je znázornené na obrázku 1, existuje štatisticky významné rozdiely medzi dvoma skupiny (P Hotel &0,01). Tento výsledok je takmer zhodný s našej predchádzajúcej správe [4, 9-11], čo naznačuje, že vysoko BRCAA1 antigén môžu byť vybrané ako potenciálny cieľ pre rakovinu žalúdka najviac, ak je ako pripravená nanosondy môže rozpoznať 64% pacientov s včasnou rakoviny žalúdka, to bude veľmi užitočné pre diagnostiku a liečbu klinických karcinómu žalúdka patients.Table 1 titre BRCAA1 monoklonálnych protilátok v ascitu vyvolaná hybridómu Clone buniek pomocou ELISA

titra protilátok *
Clone
BRCAA1 (C) -ová **
BRCAA1 (C) -BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1024000 1024000
Hotel < 1000 Hotel < 1,000
S-335- 5
128000 512000
Hotel < 1000 Hotel < 1000
* prevrátená ascitu riedenie kvapaliny, prvé riedenie ascitu bolo 1: 1000.
** antigény boli nanesené na ELISA doštičke.
Obrázok 1 Vyjadrenie BRCAA1 bielkovín v žalúdku rakovinových tkanív a normálne kontrolné žalúdočných slizníc. A: žalúdočné rakovinové tkanivá, x 100; B: normálne kontrolné tkanivá, x 50.
Príprava a charakterizácia BRCAA1- FMNPs nanosondy
Ako je ukázané na obrázku 2A, pripravené FMNPs boli zložené z oxidu kremičitého zabalené CdTe a magnetických nanočastíc, ich veľkosť bola 50 nm, alebo tak priemer. Ako je znázornené na obrázku 2D, po FMNPs boli konjugované s anti-BRCAA1 protilátky, fotoluminiscencie ako pripravená nanosondy "(PL) intenzita bola nižšia ako u FMNPs, vykazuje ľavý posuv 40 nm, čo bolo v dôsledku zníženia rýchlosti polarizácie okolitých molekúl, čo má za následok aj zníženie Stokes posunutie, čo nakoniec v modrom posun v emisných spektier. Podobne, intenzita magnetického ako pripravených nanosondami bola tiež nižšia ako FMNPs. Obrázok 2 Charakterizácia anti-BRCAA1-FMNPs nanosondami. A: HR-TEM obraz FMNPs; B: Magnetická vlastnosť anti-BRCAA1-FMNPs nanosondami; C: Zeta-potenciál FMNPs s aminoskupinou, COOH, Si-O skupina; D :. PL spektra FMNPs konjugovanej s alebo bez BRCAA1 protilátky
V priebehu prípravy BRCAA1-FMNPs nanosondy sme zistili, že povrchová funkcionalizace FMNPs bol veľmi kľúčom k časovať anti-BRCAA1 protilátku s FMNPs cez kovalentnej väzby. Ako je ukázané na obrázku 2C, rôzne funkčné skupiny FMNPs majú rôzne zeta-potenciál hodnôt. FMNPs mal negatívny Si-O-skupinu, ich zeta-potenciál hodnota bola -34,05 mV, že FMNPs s aminoskupinou mal pozitívny zeta-potenciál hodnotu 24.80 mV, FMNPs s karboxylovú skupinou malo negatívny Zeta-potenciál hodnote -30.50 mV. Pozorovali sme, že karboxylové skupiny na povrchu FMNPs konjugovaných s anti-BRCAA1 protilátka jednoduchšie, než aminoskupín na povrchu FMNPs. Ako je uvedené v tabuľke 2, priemerná miera väzba anti-BRCAA1 protilátky s FMNPs-COOH bol 80,28% .Table 2 Spojka meranie rýchlosť FMNPs-anti-BRCAA1 protilátky

celková koncentrácia anti-BRCAA1 protilátky (ng /ul)
koncentrácie anti-BRCAA1 protilátky v zostatkovej reakčnej zmesi (ng /ul)
Spojka sadzby (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Ako pripravené nanosondy pre in vitro
cielené buniek karcinómu žalúdka
cielenie schopnosti boli pozorované fluorescenčným mikroskopom a vypočítaných FACSCalibur prietokovom cytometri ako pripravených nanosondami in vitro
. Ako je znázornené na obrázku 3, FMNPs náhodne rozptýlené vo vnútornej cytoplazmy, a anti-BRCAA1-FMNPs nanosondy existovala okolo jadierka. Obe FMNPs a pripravené BRCAA1-FMNPs nanosondy môže vstúpiť do cytoplazmy MGC803 buniek po 4 hodinách inkubácie s MGC803 bunkami, ako je znázornené na obrázku 4A, FMNPs mohol označiť 25,23% MGC803 bunky sa stále 74.77% buniek nemôže byť označený. Ako je znázornené na obrázku 4B, 45,92% MGC803 bunky môžu byť označené pomocou BRCAA1-FMNPs nanosondami. Keď boli FMNPs a anti-BRCAA1-FMNPs Nanosondy respektíve inkubované s MGC803 buniek a ľudských fibroblastov po dobu 0,5 hodiny, sme pozorovali veľa anti-BRCAA1-FMNPs Nanosondy uzavretých MGC803 buniek, pár Nanosondy vstúpil do ľudských fibroblastov, mohol pár FMNPs vstúpiť do MGC803 buniek a ľudských fibroblastov, čo veľmi naznačujú, že anti-BRCAA1-FMNPs nanosondy môžu byť zacielené na MGC803 bunky špecificky. Magnetickej rezonancie MGC803 buniek a ľudských fibroblastových buniek inkubované s anti-BRCAA1-FMNPs počas 4 hodín bolo znázornené na obrázku 5, MGC803 bunky vykazovali silné magnetické pole, než ľudských fibroblastov (HDF), ktoré sa tiež ukázalo, že pripravené nanosondy môžu zacieliť MGC803 bunky konkrétne. Obrázok 3 In vitro fluorescenčné obrazy MGC 803 po liečení FMNPs a FMNPs-BRCAA1 nanočastíc (zväčšenie = x 200). Horná skupina obrazov je znázornené FMNPs náhodné distribúcie v cytoplazme, spodná skupina obrazov vykazovala FMNPs-BRCAA1 rozptýlené okolo jadierka a mal schopnosť k MGC803 dobre zacielenie.
Obrázok 4 FACSCalibur prietokovom cytometri analýzou MGC803 značeného FMNPs a FMNPs-BRCAA1. A: MGC803 spracuje s 50 ug /ml počas 24 hodín FMNPs vykazoval 25,23% bunky boli značené FMNPs. B: MGC803 spracuje s 50 ug /ml FMNPs-BRCAA1 za 24 hodín je ilustrované až boli označené FMNPs-BRCAA1 45,92% bunky
Obrázok 5 MR imaging MGC803 buniek a HDF buniek .. A: MGC803 bunky s anti-BRCAA1-FMNPs. B: HDF bunky s anti-BRCAA1-FMNPs. C :. MGC803 bunky len s FMNPs
As-pripravený nanosondy pre fluorescenčné zobrazovanie in vivo
rakovinové bunky žalúdočné
Zhodnotiť nádorové cielené vlastnosti anti-BRCAA1-FMNPs nanosondami, nahých modelov myší zaťažených MGC- 803 buniek karcinómu žalúdka boli pripravené a sledovaná na základe neinvazívnej spôsobom po dobu 12 hodín za použitia ivis fluorescencie zobrazovacieho systému.
podľa sledovania v reálnom čase, intenzitu fluorescencie v celom tele, je tumor zacielenie charakter anti-BRCAA1- FMNPs sonda bola ľahko určiť v holých myší naloží s rakovinou žalúdka MGC803 buniek. Ako je znázornené na obrázku 6A, celá zvieratá vyrobené fluorescenčné signály v 30 minútach po injekcii nanosondami, podkožné nádorové tkanivá by mohlo byť jasne vymedzená od okolitej pozadia tkaniva medzi 1 h a 12 h po injekcii, s maximálnou kontrast vyskytujúce sa 6 h po injekcii. Silný fluorescenčný signál bol stále detekovaný v mieste nádoru v 6 hodín po injekcii, ktorá naznačila, že anti-BRCAA1-FMNPs Nanosondy boli prednostne hromadí v nádorových tkanivách. V skutočnosti na základe výsledkov na obrázku 6B, tým vyššia je nádor na hodnotu pozadí pomer (NOP), veľmi navrhol, že tak, ako pripravený nanosondy prednostne hromadí v nádorových tkanivách v porovnaní s normálnymi kontrolnými tkanív. To bolo potvrdené v fluorescenčných obrazov, ktoré ukazovali, že fluorescenčné signál ako pripravených nanosondami v mieste nádoru bol najsilnejší zo všetkých myšiach orgánov, ako je znázornené na obrázku 6C. Okrem toho sa po 12 hodín po injekcii anti-BRCAA1-FMNPs nanosondami, intenzita fluorescencie v nádore bol pozorovaný ešte jasne, zatiaľ čo absorpcia pripravených nanosondami v normálnych orgánov nebolo zrejmé. Tieto údaje naznačujú, že vysoko pripravené Nanosondy môžu cieliť veľmi efektívne nádorového tkaniva vnútri holých myší zaťažených s rakovinou žalúdka. Tiež poznamenať, že tieto nanosondy v celom tele myši takmer úplne zmizli pri 12 h po injekcii, tiež sme zistili, že nanosondy vystúpil von z cholecyst systému (dáta nie sú uvedené), je časovo závislé cholecyst klírens nanosondami veľmi naznačujú, že ako -pripravené nanosondy nemôže zostať vnútri holých myší dlhšiu dobu, tak, ako je pripravený nanosondy vlastnú dobrú biologickú bezpečnosť. Obrázok 6 In vivo fluorescencie obrazy akumulácie nádoru a tkanivové distribúciu pre FMNPs-BRCAA1 nanočastíc v MGC803 ľudských athymických nahých myší žalúdočným tumorom. A, In vivo
fluorescenčné obrazy athymických nahých myší nesúcich. MGC803 nádor žalúdka človeka bol získaný po injekcii FMNPs-BRCAA1 nanočastíc v inom časovom okamihu. Umiestnenie nádoru je špecifikovaný s šípkou. A-1: 0 h, A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 h, A-6: 12 hodín. B, TBR [Tissue na pozadí (svalov) pomer] hodnoty. Hodnota TBR bola stanovená nasledujúcim spôsobom: TBR = (tumor signál signál pozadia) /(signál pozadia). C, Ex vivo
fluorescenčné obrazy pitvali orgánov a nádoru myší nesúcich MGC803 ľudský nádor žalúdka usmrtená 12 hodín po injekcii FMNPs-BRCAA1 nanočastíc. Fluorescenčné obrazy pitvali orgánov a nádoru boli získané za použitia fluorescenčnej zobrazovacej techniky s emisným filtrom 630 nm. D, Biodistribúcia anti-BRCAA1 FMNPs u myší po intravenóznej injekcii. Niekoľko časových bodov po injekcii, železo v množstve tkanivových vzoriek boli hodnotené hmotnostnej spektrometrie ICP (n = 3).
Patologická analýza nádoru a dôležité orgány
In vitro
vyhodnotenie odrezanými hlavných tkanivách, vrátane pečene, pľúc , slezina, obličky a srdce, rovnako ako nádor, je uvedené, že anti-BRCAA1-FMNPs sondy boli hlavne up-zhotovená nádorovom tkanive, ktoré vystavené silné fluorescenčné signály, ako je znázornené na obrázku 7, zatiaľ čo v iných tkanivách, vrátane pečene , pľúca, slezina a srdce up-vzala anti-BRCAA1-FMNPs nanosondy veľmi menej, čo znamená, že furtherly ako pripravený môžu BRCAA1-FMNPs nanosondy zamerať rakovinou žalúdka tkaniva. Tiež sme použili HE farbenie skontrolovať všetky orgány, žiadne zjavné škody boli pozorované u dôležitých orgánov [pozri ďalší súbor 1]. Obrázok 7 Výsledok fluorescenčnou analýzu. A, nádorové tkanivo. B, pečeň. (Zväčšenie = x 200).
As-pripravený nanosondy pre MR zobrazovanie nahých myší naloží s rakovinou žalúdka
In vivo
MR imaging bola vykonaná na holých myší naloží s podkožným rakoviny žalúdka u 12 h po injekcii , Reprezentatívne obrazy T2 máp bolo znázornené na obrázku 8, po vstrekovanie nanosondy, bola pozorovaná významná zmena intenzity signálu v niektorých oblastiach nádorov, čo ukazuje, že existuje hromadenie nanosondami nádorové mieste, ako je znázornené na obrázku 8B, ako šípky ukázal. Ako kontrola, po myšiam modelu s karcinómom žalúdka boli injikované FMNPs po dobu 12 hodín, myši boli vykonané MR zobrazovanie, bez toho aby na nej intenzívne signál v oblasti nádoru (obrázok 8A). Obrázok 8 MRI obraz myšou. A, FMNPs bez spojky BRCAA1 B, FMNPs spojené s BRCAA1
potenciálny mechanizmus cieľovaniu zobrazovacie
V posledných rokoch boli použité technológie molekulárneho zobrazovania v reálnom čase a neinvazívne zobrazovanie in vivo
nádorovom tkanive [39-43]. Napríklad kvantové bodky vďaka svojim unikátnym vlastnostiam photoluminescent, boli použité pre bio-značenie a fluorescenčné zobrazovanie [11-13, 33, 43], ale kvantovej bodky 'toxicita obmedzená ich použitie v ľudskom tele, doteraz nejaký bezpečný kvantum bodky sú vyvíjané. Magnetické nanočastice boli tiež použité ako kontrastné činidlá pre MR [15, 33, 36]. V rovnakej dobe, kombinácia dvoch zobrazovacích metód poskytuje výhody oboch ako pri použití jednej metódy, ktorá by poskytovala celkové informácie o lokalizácii nádoru, životné prostredie, a postavenie.
V tejto štúdii sme navrhli a pripraví nový zobrazovacie sondy ktorý bol zložený z kremíkovej zabalené kvantových bodiek a magnetických nanočastíc s cieľom zvýšenia ich biokompatibility. Naše výsledky ukazujú, že pripravené kremíka zabalené kvantovej bodky a magnetické nanočastice sú veľmi stabilné a vlastné silné fluorescenčné signály a intenzita magnetického. Za použitia silné fluorescenčné signály ako pripravených nanosondami sme úspešne získať fluorescenčné obrazy in vivo
žalúdočné rakovinové tkanive s 5 mm v priemere v modeli nahých myší. Za použitia silné magnetické signály ako pripravených nanosondami sme tiež úspešne získaný MR obrazy in vivo
žalúdočné rakovinové tkanive 5 mm v priemere u nahých myšiam modelu. V porovnaní s predchádzajúcimi správami, väčšiu veľkosť nádorového tkaniva (viac ako 5 mm), ktorú možno ľahko zobrazovaných pomocou fluorescenčného zobrazovania a MRI zobrazovanie, ako kontrast, naše výsledky ukazujú, že ako pripravené nanosondy môže detekovať menšiu veľkosť nádorového tkaniva (menej 5 mm v priemere), ktoré výrazne zlepšila citlivosť metódy detekcie. Náš výsledok je tiež prvýkrát hlásiť dual-modálne cielenie zobrazovanie in vivo
rakovinou žalúdka tkanív.
Ako cieliť na in vivo
rakovinou žalúdka tkaniva je tiež napadnuteľný problém. Až do dnešného dňa neboli hlásené žiadne špecifické rakovinové biomarkery žalúdka. Aj keď HER-2 proteín bolo potvrdené, že má pozitívny expresie v 6-35% žalúdočných rakovinové tkanive [28-31], HER-2 proteín tiež vykazuje nadmerné expresie v mnohých nádorových tkanivách, ako je rakovina prsníka, rakoviny pľúc, rakoviny hrubého čreva, atď, teda HER-2 by nemal byť špecifický biomarker pre karcinóm žalúdka. Naše výsledky ukazujú, že BRCAA1 antigén je len nadmerne exprimovaný v 64% alebo tak žalúdočných rakovinové tkanive od pacientov s klinickými chirurgia, tiež potvrdila, že BRCAA1 antigén je exprimovaný v niektorých žalúdočných nádorových bunkových línií, ako je MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III a MGC803 [6-9]. Použili sme MGC803 buniek pre prípravu modelu nahých myší naložené s rakovinou žalúdka, a úspešne pozorovať, že pripravená nanosondy prednostne hromadí v nádorových tkanivách v porovnaní s normálnymi kontrolnými tkanivami, a postupom času po injekcii zvýšil. Ďalej poznamenal, že injekčne Nanosondy v celé telo vykazovalo klírens závislé na čase a fluorescenčné signály postupne znižovať ako čas, ktorý uplynie v súvislosti vylučovací systém pečeň a obličky cholecyst priechodnosť ako pripravených nanosondami. Niekoľko správ vyplynulo, že s obličkami iba jasné nanočastice s 5 nm v priemere, v našej štúdii sme pozorovali, že ako pripravená nanosondy 50 nm v priemere tiež mohol byť vymazaný počas 12 hodín. Tento konkrétny mechanizmus je v plnom prúde.
Nanosondami biologickej bezpečnosti je dôležitým problémom [44], ktorý rozhodne vyhliadky aplikačný ako pripravených nanosondami. Naše výsledky plne preukázali, že tak, ako pripravené nanosondy ani poškodiť dôležité orgány, vrátane pečene, obličiek, srdca, pľúc, atď, tiež nevykazujú dlhodobý pobyt v dôležitých orgánov, ktoré sa veľmi naznačujú, že je pripravený nanosondy vlastné dobrú biokompatibilitu, a majú veľký potenciál v aplikáciách, ako je duálne zobrazovanie modelu a selektívne liečba včasného karcinómu žalúdka.
Záver
sme úspešne pripravila nové anti-BRCAA1-FMNPs nanosondy, ktoré môžu byť použité pre in vivo
dva modálne zobrazovanie ako je napríklad fluorescenčné zobrazovanie a zobrazovanie magnetickou rezonanciou a vlastniť samozrejme špecifické cielenie schopnosť voči žalúdočnej rakovinové tkanive s 5 mm v priemere počas 0,5 hodiny a 12 h po injekcii a vlastné dobrú biokompatibilitu. To by malo byť prvá správa. AS-pripravené multifunkčný nanosondy môžu byť taktiež použité pre hypertermia liečbe karcinómu žalúdka v rámci in vitro
striedavo ožarovanie magnetického poľa, a majú veľký potenciál v aplikáciách, ako je simultánne zobrazovanie a cielenie terapiu klinickej rakovinou žalúdka v blízkej budúcnosti.
materiály a metódy
Príprava anti-BRCAA1 monoklonálnych protilátok
pokusy na zvieratách sa vykonávali podľa pokynov pre starostlivosť o zvieratá a používania výboru, Shanghai Jiao Tong University. Boli pripravené monoklonálne protilátky proti čistenej fúzny proteín BRCAA1. BALBI /c myší samičky, 4-6 týždňov staré, boli zakúpené od Šanghaja LAK Laboratory Animal Co. Ltd., čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína). Myši imunizovaných intraperitoneálnou injekciou 50 ug purifikovaného BRCAA1 proteínu, ktorý sa emulguje s rovnakým objemom Freundovho kompletného adjuvans. Tri ďalšie injekcie boli podávané za použitia neúplného adjuvans každé dva týždne. Tri dni po poslednej injekcii, slezinnej bunky myší boli zozbierané a fúzovania s SP 2/0 myšou myelómové bunkové línie. Po 10-14 dňoch boli supernatanty kultúry boli testované pomocou ELISA testu, v ktorom sa pevná fáza potiahnuté rekombinantným BRCAA1 proteínu (2 ug /ml) na imunizáciu. V procese skríningu, Monoklonálne protilátky, ktoré sa viažu s povlakom BRCAA1 proteínu boli vybrané. Dvakrát limitným riedením, pozitívne kolónie boli subklonovány. Ascitický tekutiny boli získané z myší očkovaných s intraperitoneálnou injekciou 0,5 ml pristanem a potom sa vstrekuje 10 6 hybridomové bunky. Trieda a podtrieda každej mAb boli určené za použitia myší monoklonálne protilátky isotyping kit (Hy Cult Biotechnology B.V., Holandsko). Tieto mAb boli purifikované z myších asketické tekutín pomocou proteín G-Sepharose 4FF kolóny (Pharmacia, Uppsala, Švédsko), podľa inštrukcií výrobcu za účelom odstránenia zložiek, ktoré by mohli interferovať s experimenty biopanningu. Titre protilátok boli stanovené pomocou ELISA metódy [45]. Nakoniec jeden z pripravených anti-BRCAA1 monoklonálnej protilátky bol použitý ako prvý protilátky na zafarbenie 50 vzoriek rakoviny žalúdka a ovládať žalúdočné sliznicou, ktoré boli zhromaždené z Changzheng nemocnice a ľudia nemocnice No.1 v Šanghaji a zistených patologickým vyšetrením.
príprava a povrchová Funkcionalizace FMNPs
príprava Fe 3O 4 nanočastice bola založená na spoločné zrážanie železa a železitých iónov roztokov (1: 2 molárny pomer) [46-49]. CdTe nanokryštály boli syntetizované nasledujúcim spôsobom v súlade s našou predchádzajúcej správe: CDCI 2 (5 mmol) sa rozpustí v 110 ml vody a pridá sa 12 mmol TGA za miešania, a následne úpravou pH na hodnotu 11 pridaním po kvapkách 1 M roztoku hydroxidu sodného. Miešaný roztok sa umiestni do tříhrdlé banky s obsahom umiestnená v N 2 prebublávania po dobu 30 minút. Za miešania, 2,5 mmol nechtoch roztoku bez kyslíka sa vstrekuje do tříhrdlé banky, ktorá bola čerstvo pripraveného telúriový prášku a Nabha 4 (molárna pomere 1: 2) vo vode pri teplote 0 ° C. Výsledný roztok sa asi 4 mg /ml, a priemer 3,5 nm produkt emitované s maximom okolo 630 nm. Fluorescenčné magnetické nanočastice (FMNPs) boli pripravené za použitia prístupu reverznej mikroemulzné. Pred pripojením na FMNPs s BRCAA1, najprv Funkcionalizované funkčnú skupinu povrchu FMNPs ako karboxylové skupiny. 95 ml etanolu a 2 ml 3-silán (APS) bol pridaný za vzniku zmesového roztoku a nechá sa reagovať pri teplote miestnosti po dobu 24 hodín. Tieto FMNPs aminosilan modifikované boli oddelené permanentným magnetom a premyjú sa deionizovanou vodou trikrát. Potom sa znova disperguje v FMNPs-NH 2 v 100 ml dimetylformamidu (DMF), pridaný anhydrid kyseliny jantárovej nadmernej za vzniku zmesového roztoku a reagovať pri teplote miestnosti po dobu 24 hodín. Tieto FMNPs karboxylovej modifikované boli oddelené permanentným magnetom a znovu sa premyje deionizovanou vodou trikrát.
Príprava a charakterizácia FMNPs protilátok konjugovaných s BRCAA1
Použili sme dvojstupňový proces na získanie stabilnej anti-BRCAA1-FMNPs konjugácii [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg FMNPs-COOH Roztok sa disperguje v 2 ml PBS pufra pH 7, a sa vystaví pôsobeniu ultrazvuku po dobu 10 minút. Potom sa zmieša 1 ml čerstvého 400 mM EDC a 100 mM NHSS pH 6,0 MES pufra a otáča sa pri izbovej teplote po dobu 15 minút. Potom sa výsledný roztok sa oddelí od magnetického poľa a 1 mg /ml BRCAA1 monoklonálne protilátky boli pridané do vyššie uvedenej zmesi, mieša v tme po dobu 2 hodín. Pre odstránenie voľné BRCAA1, zvyšná reakčná zmes sa oddelila za pomoci magnetického poľa a pevný zvyšok sa premyje 1 ml PBS pufra trikrát. Konečne, 1 ml 0,05% Tween-20 /PBS bol pridaný do konjugácie BRCAA1-FMNPs a konečné bio-konjugácii bol uložený pri teplote 4 ° C. Keď sa používa, to BRCAA1-FMNPs konjugácie sa riedi PBS /0,05% Tween-20. Potom sme použili prístroj Nano Drop určiť rýchlosť kopulácie BRCAA1 protilátky s FMNPs-COOH. Pred kopulačné reakcie, sme merali celkovú koncentráciu BRCAA1 protilátky. Po kopulačnej reakcii, sme merali koncentráciu BRCAA1 protilátky vo zvyškovej reakčnej zmesi a vypočíta spojky miera podľa rovnice:
spojky (%) = (1-Koncentrácia protilátky v BRCAA1 zvyškovej reakčnej zmesi /Celková koncentrácia BRCAA1 protilátky) × 100.
ako pripravených nanosondami a čistými FMNPs boli charakterizované transmisný elektrónové mikroskopie a fotoluminiscenčná (PL) spektrometria, a Zeta potenciálny analyzátora.
nanosondy pre zobrazovanie in vitro
zacielenie nádorových buniek žalúdka
žalúdka bunková línia rakoviny MGC803 bunky s nadmerne exprimované BRCAA1 proteínu boli použité ako cieľové bunky, ľudské fibroblastové bunky bez exprimovaného BRCAA1 proteín bol použitý ako kontrola, boli kultivované a zhromažďujú, a potom sa spracuje s 50 ug /ml BRCAA1-FMNPs nanosondami a kultivované vo zvlhčenej 5% CO 2 vyvážené vzduchu inkubátora pri teplote 37 ° C počas 4 hodín, medzitým MGC803 a ľudské fibroblastové bunky boli ošetrené s FMNPs ako u kontrolnej skupiny. Potom boli bunky opláchnuté PBS, trikrát, a potom sa pripevní buniek s 2,5% roztokom glutaraldehydu po dobu 30 min. V prípade nukleárnej kontrastným, MGC803 boli inkubované s 1 mM Hoechst 33258 v PBS po dobu 5 minút. Bunky boli pozorované pomocou fluorescenčného mikroskopu (Nikon TS100-F), a imaged GE HDX 3.0T MR prístroj vybavený softvérom ParaVision 3.0.
Tiež sme použili prietokový cytometer vyhodnotiť žalúdočné rakovina bunky schopnosť BRCAA1- zacielenia FMNPs nanosondy.

• Hlboká sekvenovania karcinómu žalúdka odhaľuje somatické mutácie sú relevantné pre personalizované medicine
• BariSurg trial: Rukávy gastrektómia proti Roux-en-Y žalúdočnej bypass u obéznych pacientov s BMI 35-60 kg /m2 - multicentrickej, randomizovanej pacienta a pozorovateľ slepý neinferioritu trial