anticorpo monoclonal BRCAA1 conjugado nanopartículas magnéticas fluorescentes para in vivo de imagens magnetofluorescent alvo do anticorpo monoclonal BRCAA1 cancer

gástrica conjugado nanopartículas magnéticas fluorescentes para in vivo
alvo de imagem magnetofluorescent de câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico é 2ª a maioria de cancro comum na China, e ainda é a segunda causa mais comum de morte por câncer no mundo. Como reconhecer células câncer gástrico precoce ainda é um grande desafio para o diagnóstico precoce e terapia de pacientes com câncer gástrico. Este estudo teve como objetivo desenvolver um tipo de nanosondas multifuncionais para in vivo
alvo de imagem magnetofluorescent de câncer gástrico.
Métodos
foi preparado anticorpo monoclonal BRCAA1, foi utilizado como primeiro anticorpo para manchar 50 pares de amostras de gástrica câncer e controlar mucosas gástricas normais, e conjugada com nanopartículas magnéticas fluorescentes com 50 nm de diâmetro, os nanosondas magnéticos fluorescentes BRCAA1 conjugados resultantes foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e espectrometria de fotoluminescência, nanosondas as-preparadas foram incubadas com células de câncer gástrico MGC803, e foram injetadas em ratos modelo carregado com câncer gástrico de 5 mm de diâmetro via veia da cauda, ​​e depois foram fotografadas pela imagem óptica de fluorescência e imagem por ressonância magnética, a sua biodistribuição foi investigada. As fatias de tecido foram observadas por microscopia de fluorescência, e os órgãos importantes, tais como coração, pulmão, rim, cérebro e fígado foram analisados ​​pelo método de hematoxilina e eosina (HE).
Resultados
BRCAA1 anticorpo monoclonal foi preparado com sucesso, proteína BRCAA1 exibiu sobre-expressão em 64% tecidos de câncer gástrico, nenhuma expressão no controle mucosas gástricas normais, não existe diferença estatística entre os dois grupos (P Art < 0,01). O BRCAA1 conjugado fluorescente magnético nanosondas exposição muito baixa toxicidade, baixa intensidade magnética e menor intensidade de fluorescência com pico-blue-shift que FMNPs puros, poderia ser endocitado por células gástricas cancerosas MGC803, poderia ter como alvo in vivo
tecidos com cancro gástrico loaded por ratos, e poderia ser usado para a imagem tecidos com cancro gástrico por imagens fluorescentes e ressonância magnética, e distribuídas principalmente em tecidos de câncer gástrico locais dentro de 12 horas após a injecção. HE análise mostrou que não há danos evidentes foram observados em órgãos importantes.
Conclusões Os
de alto desempenho BRCAA1 monoclonais fluorescentes nanopartículas magnéticas de anticorpo conjugado pode ter como alvo in vivo
células gástricas cancerosas, pode ser utilizada para magnetofluorescent simultânea de imagem, e pode ter um grande potencial em aplicações tais como imagens dual-modelo e terapia térmica local do câncer gástrico precoce no futuro próximo.
Fundo
o câncer gástrico já foi o segundo câncer mais comum na palavra [1]. Até à data, nos Estados Unidos, neoplasia de estômago é atualmente o 14º câncer mais comum, e 2ª câncer mais comum na China [2, 3]. O câncer gástrico ainda é a segunda causa mais comum de morte por câncer no mundo, e continua a ser difícil de curar porque a maioria dos pacientes apresentam doença avançada. Portanto, como reconhecer, faixa ou matar as células câncer gástrico precoce é muito fundamental para o diagnóstico precoce e terapia de pacientes com câncer gástrico.
Até à data, procurando biomarcadores intimamente associados com câncer gástrico ainda é uma tarefa importante. Desde 1998, temos vindo a ser tentou estabelecer um sistema gástrico precoce do câncer de pré-aviso [4], e espero usar este sistema de pré-aviso para detectar células câncer gástrico precoce para reconhecer os pacientes com câncer gástrico precoce. Embora alguns genes diferencialmente expressos-associados com o cancro gástrico precoce foram identificados [5, 6], não um gene pode ser confirmado para ser biomarcador específico do cancro gástrico. Portanto, a fim de reconhecer as células câncer gástrico precoce, nós só selecionar biomarcadores potenciais associados com câncer gástrico, e combiná nanopartículas e técnicas de imagem molecular, tentar encontrar in vivo
células câncer gástrico precoce por in vivo
imagiologia tumor alvo . Em nosso trabalho anterior, exibido fora e gene BRCAA1 clonado (câncer de mama associado antígeno 1 gene) a partir de linhas celulares do cancro da mama MCF-7cells [AF208045, também chamado ARID4B (4B AT-rich interativa contendo domínio de proteína)], e identificou sua epitopo antigénico péptido SSKKQKRSHK [7, 8]. Nós também anticorpo policlonal preparado BRCAA1, e observou-se que a proteína BRCAA1 exibiram sobre-expressão em quase 65% dos espécimes clínicos de tecidos de cancro gástrico [9-11]. Observamos também que o antigénio BRCAA1 é sobre-expresso em linhas celulares de cancro gástrico, como MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO-III e MGC803 células. Portanto, prevemos que a proteína BRCAA1 pode ser uma molécula alvo potencial para in vivo
células cancerosas gástricas.
Nos últimos anos, as tecnologias de imagem molecular com base em nanosondas multi-funcionais têm feito grandes progressos. Por exemplo, as nanopartículas, tais como pontos quânticos, nanopartículas magnéticas e nanobastões de ouro, etc. têm sido utilizados para imagiologia molecular [12-19]. Até agora, várias tecnologias de imagem de pequenos animais têm sido desenvolvidos, como imageamento óptico (OI) da bioluminescência (BLI), fluorescência (FLI) e da microscopia intravital (IVM), micro-PET, MRI e CT [20-26]. Entre todas estas tecnologias, como melhorar a sua resolução espacial e sensibilidade profundidade do tecido é um grande desafio. Até agora in vivo
tecidos tumorais com mais de 1 cm de diâmetro podem ser facilmente identificados por CT, MRI, imagiologia PET e bioluminescência, tumores com menos do que ou igual a 5 mm de diâmetro é muito difícil de ser encontrado em doentes clínicos. Em nossos relatórios anteriores, nanopartículas magnéticas fotossensibilizador conjugado foram utilizadas com sucesso para in vivo
simultânea magnetofluorescent imagem e direcionamento da terapia [27]. No entanto, a capacidade de segmentação de nanossondas era altamente dependente das nanopartículas magnéticas. Nós também preparou um CdTe quantum nanosystem conjunto dot ribonuclease-A-conjugado multifuncional para a imagem latente câncer síncrona e terapia [28], a capacidade de segmentação de nanosondas como preparados depende peptídeo RGD. Alguns estudos mostram que a proteína HER-2 exibe expressão anormal de tecidos de cancro gástrico 6-35% [29, 30], e tem sido utilizado como o alvo terapêutico para pacientes com cancro gástrico clínicos [31], portanto, proteína HER-2 possui grande potencial em imagem e terapia do câncer gástrico. No entanto, até à data, nenhum relatório mostra que a imagem segmentada e terapia de vivo câncer gástrico em
é baseada em biomarcadores associados com câncer gástrico.
Nos últimos anos, nós controladamente preparadas pontos quânticos revestidos por sílica e super-paramagnética compósitos de nanopartículas (FMNPs) com sinais fluorescentes fortes e excelentes propriedades magnéticas, e tê-los usado para bio-rotulagem, acompanhamento de células-tronco, bio-separação, visando imagem e hipertermia de tumores [29-32], observamos também que as-preparada nanopartículas possui boa biocompatibilidade e estabilidade [33-38].
neste artigo, vamos utilizar plenamente as vantagens de FMNPs e antígeno BRCAA1, o anticorpo monoclonal preparado contra a proteína BRCAA1 e BRCAA1 preparado monoclonais nanosondas magnéticos fluorescentes anticorpos conjugada (BRCAA1- FMNPs), empregada modelo de ratos sem pêlo carregado com câncer gástrico de 5 mm de diâmetro e sistema de imagem IVIS e ressonância magnética, investigou a viabilidade de nanosondas como preparados para não-invasivo in vivo
alvo de imagem modal dupla de câncer gástrico. Os resultados mostram que nanosondas as-preparadas podem ser utilizadas para in vivo
dual-modelo de imagem de câncer gástrico, e pode ter um grande potencial em aplicações tais como imagens dual-modelo e terapia térmica local do câncer gástrico precoce no futuro próximo.
resultados e Discussão
Caracterização de anticorpos anti-anticorpo monoclonal BRCAA1
Como mostrado na Tabela 1, foram obtidos com sucesso duas linhas de células positivas clone S-S-200-5 e 335-5, os títulos eram diferentes, finalmente selecionou-se o anticorpo monoclonal anti-BRCAA1 da linha de células S-200-5 como o primeiro anticorpo para corar tecidos de cancro gástrico e tecidos de controlo. Descobrimos que a proteína BRCAA1 exibiram sobre-expressão em 64% tecidos de cancro gástrico, nenhuma expressão em tecidos de controlo normais da mucosa gástrica, tal como mostrado na Figura 1, existe diferença estatística entre os dois grupos (P
< 0,01). Este resultado é quase idêntico ao nosso relatório anterior [4, 9-11], que sugerem fortemente que o antigénio BRCAA1 pode ser selecionado como alvo potencial para o câncer mais gástrica, se tão-preparados nanosondas pode reconhecer 64% dos pacientes com câncer gástrico precoce, ele vai ser muito útil para diagnóstico e terapia de clínicos patients.Table câncer gástrico 1 Títulos de BRCAA1 anticorpos monoclonais em fluido ascite induzida por células de hibridoma Clone por ELISA

O título de anticorpo *
Clone
BRCAA1 (C) -OVA **
BRCAA1 (C) BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1.024.000
1.024.000 Art < 1,000 Art < 1.000
S-335- 5
128.000
512.000 Art < 1,000 Art < 1.000 * a reciprocidade de ascite diluição de fluidos, a primeira diluição de fluido ascite foi de 1: 1.000.
** os antígenos foram usados ​​para revestir placas de ELISA.
Figura 1 Expressão da proteína BRCAA1 em tecidos de cancro gástrico e de controlo normais gástricas mucosas. A: tecidos de câncer gástrico, × 100; B: Os tecidos de controlo normais, × 50.
Preparação e Caracterização de BRCAA1- FMNPs nanossondas
Como mostrado na Figura 2A, foram preparadas FMNPs composto de CdTe e nanopartículas magnéticas envolto em sílica, o tamanho eram de 50 nm ou mais, em diâmetro. Como se mostra na Figura 2D, após FMNPs foram conjugados com o anticorpo anti-BRCAA1, fotoluminescência 'nanossondas AS-preparados (PL) intensidade foi menor do que a de FMNPs, exibindo deixou-deslocamento de 40 nm, o que era devido à diminuição da taxa de polarização das moléculas vizinhas, e resultando na diminuição de deslocamento de Stokes, finalmente resultando em um deslocamento para o azul nos espectros de emissão. Da mesma forma, a intensidade magnética de nanossondas preparados como também foi mais baixa do que FMNPs. Figura 2 Caracterização de nanossondas anti-BRCAA1-FMNPs. A: imagem HR-TEM de FMNPs; B: propriedade magnética do nanosondas anti-BRCAA1-FMNPs; C: potencial zeta de FMNPs com grupo amino, COOH, um grupo Si-O; D:. PL espectros de FMNPs conjugados com e sem anticorpos BRCAA1
No decurso da preparação BRCAA1-FMNPs nanosondas, descobrimos que funcionalização da superfície de FMNPs foi fundamental para conjugar o anticorpo anti-BRCAA1 com FMNPs via ligação covalente. Tal como mostrado na Figura 2C, diferentes grupos funcionais de FMNPs têm diferentes valores de potencial zeta. FMNPs tinha-O-Si grupo negativo, seu valor potencial zeta foi -34,05 mV, os FMNPs com grupo amino tinha valor potencial zeta positivo de 24,80 mV, FMNPs com grupo carboxilo tinha valor potencial zeta negativo de -30,50 mV. Observou-se que os grupos carboxilo sobre a superfície de FMNPs conjugados com o anticorpo anti-BRCAA1 mais fácil do que os grupos amino na superfície da FMNPs. Como mostrado na Tabela 2, a taxa de acoplamento média de anticorpo anti-BRCAA1 com FMNPs-COOH era 80,28% a medição da frequência de 2 Acoplamento .table FMNPs-anti-anticorpo BRCAA1

concentração total do anticorpo anti-BRCAA1 (ng /mL)
a concentração de anticorpos anti-BRCAA1 na mistura de reação residual (ng /mL)
taxa de Coupling (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Como preparado nanosondas para in vitro
alvo células cancerosas gástricas
segmentação capacidade de nanosondas como preparados in vitro
foram observadas por microscópio de fluorescência e calculados pelo citómetro de fluxo FACSCalibur. Como mostrado na Figura 3, FMNPs dispersos aleatoriamente no interior do citoplasma, e anti-BRCAA1-FMNPs nanossondas existia em torno do nucléolo. Ambos os FMNPs e preparou-BRCAA1 FMNPs nanossondas pode entrar no citoplasma das células MGC803 após 4 h de incubação com MGC803 células, como mostrado na Figura 4A, pode rotular FMNPs 25,23% MGC803 células, permanecem o 74,77% das células não pode ser rotulada. Como mostrado na Figura 4B, 45,92% MGC803 células podem ser marcadas por as nanossondas BRCAA1-FMNPs. Quando FMNPs e anti-BRCAA1-FMNPs nanossondas foram, respectivamente, incubados com MGC803 células e células de fibroblastos humanos durante 0,5 h, observou-se um lote de anti-BRCAA1-FMNPs nanossondas assumidos MGC803 células, alguns nanossondas entrou em células de fibroblastos humanos, alguns FMNPs poderia entrará em MGC803 células e células de fibroblastos humanos, que sugiro que o anti-BRCAA1-FMNPs nanosondas pode direcionar MGC803 células especificamente. A ressonância nuclear magnética do MGC803 células e células de fibroblastos humanos incubados com anti-BRCAA1-FMNPs durante 4 h foram mostrados na Figura 5, MGC803 células exibiram forte sinal magnético do que as células de fibroblastos humanos (HDF), que também mostraram que as nanossondas preparados podem alvejar MGC803 células especificamente. Figura 3 In vitro fluorescência imagens de MGC 803 depois tratada com FMNPs e nanopartículas FMNPs-BRCAA1 (ampliação = × 200). O grupo de topo de imagens ilustrado FMNPs distribuir aleatória no citoplasma, o grupo inferior de imagens exibiu FMNPs-BRCAA1 disperso em torno do núcleo e tinha capacidade de direccionamento bem ao MGC803.
Figura 4 citómetro de fluxo FACSCalibur análise de MGC803 e marcado com FMNPs FMNPs-BRCAA1. A: a MGC803 tratadas com 50 ug /mL de FMNPs durante 24 h exibiu 25,23% de células foram marcadas com FMNPs. B: a MGC803 tratadas com 50 ug /mL de FMNPs-BRCAA1 durante 24 h ilustrado até 45,92% de células foram marcadas com FMNPs-BRCAA1
Figura 5 RM MGC803 de células e células HDF.. A: MGC803 células com anti-BRCAA1-FMNPs. B: células HDF com anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 células com apenas FMNPs
nanosondas para imagens fluorescentes de in vivo
células cancerosas gástricas
Avaliar tumorais propriedades alvo de nanosondas anti-BRCAA1-FMNPs, modelos de ratos nus carregados com MGC- Como preparado 803 células cancerosas gástricas foram preparados e monitorados sob uma forma não-invasiva por 12 h usando o sistema de imagens de fluorescência IVIS.
através do monitoramento em tempo real intensidade de fluorescência em todo o corpo, o personagem-alvo tumor do anti-BRCAA1- sonda FMNPs foi facilmente determinada nos ratos nus carregados com câncer gástrico MGC803 células. Como mostrado na Figura 6A, inteiros dos animais produzidos sinais de fluorescência dentro de 30 min de pós-injecção de nanossondas, os tecidos tumorais subcutâneos pode ser claramente delineados a partir do tecido circundante fundo entre 1 h e 12 h pós-injecção, com contraste máximo ocorrendo a 6 h pós-injecção. sinal de fluorescência forte foi ainda ser detectada no local do tumor às 6 horas após a injecção, o que indica que as nanossondas anti-BRCAA1-FMNPs foram preferencialmente acumulado nos tecidos tumorais. Na verdade com base nos resultados apresentados na Figura 6B, o maior valor do tumor a proporção fundo (TBR) altamente sugerido que, como preparado nanossondas preferencialmente acumulado em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais de controlo. Isto foi confirmado em imagens de fluorescência, que mostrou que o sinal de fluorescência de nanossondas como preparadas no local do tumor foi mais forte entre todos os órgãos ratos tal como mostrado na Figura 6C. Além disso, após 12 h pós-injecção de anticorpos anti-BRCAA1-FMNPs nanossondas, intensidade de fluorescência no tumor foi ainda observada claramente, enquanto que a absorção de nanossondas preparados em órgãos normais não era óbvia. Estes dados sugerem fortemente que nanosondas preparados podem direcionar de forma altamente eficiente tecidos tumorais dentro ratinhos nus carregados com câncer gástrico. Observou-se também que essas nanossondas em todo o corpo do rato quase desapareceu completamente em 12 h pós-injecção, também detectada as nanossondas saiu para fora a partir do sistema cholecyst (dados não mostrados), a folga cholecyst dependente do tempo de nanossondas altamente sugerem que como nanosondas -colas não pode ficar ratos dentro nu por mais tempo, assim, como preparado nanosondas possui boa bio-segurança. Figura 6 in vivo da acumulação de fluorescência de imagens de tumores e de distribuição de tecido de nanopartículas FMNPs-BRCAA1 MGC803 em ratinhos portadores de tumor gástrico humano atímicos nus. A, In vivo
fluorescência imagens de ratinhos nus atimicos com. MGC803 tumor gástrico humano foi obtida após injecção de nanopartículas FMNPs-BRCAA1 no ponto de tempo diferente. A localização do tumor é especificado com uma seta. A-1: 0 h, A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 h, A-6: 12 h. B, TBR [Tissue ao fundo (músculo) rácio] valor. O valor em causa foi determinada como se segue: TBR = (sinal de sinal de fundo do tumor) /(sinal de fundo). C, ex vivo
fluorescência imagens de órgãos e tumores dissecados de ratinhos portadores de tumor gástrico humano MGC803 sacrificados às 12 h após a injecção de nanopartículas FMNPs-BRCAA1. As imagens de fluorescência de órgãos e tumores dissecados foram obtidos usando uma técnica de imagiologia de fluorescência com um filtro de emissão de 630 nm. D, Biodistribuição de BRCAA1-FMNPs anti em ratos após injecção intravenosa. Vários pontos de tempo após a injecção, as quantidades de ferro em amostras de tecidos foram avaliadas por espectrometria de massa ICP (n = 3).
Análise patológico do tumor e dos órgãos importantes
in vitro
avaliação dos principais tecidos excisados, incluindo fígado, pulmão , baço, rim, e coração, assim como o tumor, indicou que o anti-BRCAA1-FMNPs sondas eram principalmente-se-tomado pelos tecidos tumorais, que exibiam sinais de fluorescência forte, tal como mostrado na Figura 7, ao passo que outros tecidos, incluindo fígado , pulmão, baço e coração up-tomou anti-BRCAA1-FMNPs nanosondas muito menos, o que indica que furtherly como preparado BRCAA1-FMNPs nanosondas pode atingir tecidos com câncer gástrico. Nós também utilizamos coloração HE para verificar todos os órgãos, não há danos evidentes foram observados em órgãos importantes [ver arquivo adicional 1]. Figura 7 Resultado da Análise de imunofluorescência. Um, o tecido do tumor. B, o fígado. (Ampliação = × 200).
Nanosondas para RM de camundongos nus carregados com câncer gástrico Como preparado
In vivo
ressonância magnética foi realizada em ratos pelados carregado com câncer gástrico subcutânea, às 12 h após a injecção . Imagens representativas de mapas T2 foram mostrados na Figura 8, depois de injectar as nanossondas, foi observada uma alteração significativa da intensidade do sinal em algumas regiões de tumores, indicando que não existia acumulação das nanossondas em local do tumor como se mostra na Figura 8B, como a seta mostrou. Como um controlo, após o modelo de ratos com o cancro gástrico foram injectados FMNPs durante 12 h, os ratinhos foram realizadas ressonância magnética, que não mostram sinal intenso na área do tumor (Figura 8A). Figura 8 imagem de ressonância magnética de camundongos. A, FMNPs sem acoplamento BRCAA1 B, FMNPs juntamente com BRCAA1
mecanismo potencial de segmentação de imagem
Nos últimos anos, as tecnologias de imagem molecular têm sido utilizados em tempo real e de imagem não invasiva da in vivo
tecidos tumorais [39-43]. Por exemplo, os pontos quânticos, devido às suas propriedades fotoluminescentes únicas, têm sido utilizados para bio-rotulagem e imagens fluorescentes [11-13, 33, 43], mas os pontos quânticos "toxicidade limita a sua aplicação no corpo humano, até agora alguns quantum segura pontos estão a ser desenvolvidas. As nanopartículas magnéticas também têm sido utilizados como reagente de contraste para ressonância magnética [15, 33, 36]. Ao mesmo tempo, a combinação dos dois métodos de imagem fornece as vantagens de ambos do que usando um método, que iria fornecer informações completas sobre a localização do tumor, meio ambiente e status.
Neste estudo, nós projetamos e preparou uma sonda de imagem novela, que era composto de pontos quânticos envolveu-silício e nanopartículas magnéticas com o objectivo de melhorar a sua biocompatibilidade. Nossos resultados mostram que preparados pontos quânticos envolveu-silício e nanopartículas magnéticas são muito estáveis, e própria sinais fluorescentes fortes e intensidade magnética. Usando os fortes sinais fluorescentes de nanosondas como preparados, obtivemos êxito as imagens fluorescentes de in vivo
tecidos de câncer gástrico com 5 mm de diâmetro no modelo de ratos sem pêlo. Usando os fortes sinais magnéticos de nanosondas como preparados, também obtivemos sucesso imagens de RM in vivo
tecidos de câncer gástrico com 5 mm de diâmetro no modelo de ratos sem pêlo. Em comparação com relatórios anteriores, o maior tamanho de tecidos tumorais (> 5 mm), pode ser facilmente fotografadas usando imagens fluorescentes e as imagens de ressonância magnética, como contraste, os nossos resultados mostraram que, como preparado nanossondas pode detectar o tamanho menor de tecidos tumorais (menos cinco mm de diâmetro), o que aumentou claramente a sensibilidade do método de detecção. Nosso resultado também é a primeira vez para relatar imagem segmentação dual-modal de in vivo
tecidos de câncer gástrico.
Como alvo in vivo
tecidos com câncer gástrico também é um problema impugnável. Até à data, não foram relatados biomarcadores de câncer gástrico específicos. Embora proteína HER-2 foi confirmada a ter expressão positiva em 6-35% dos tecidos com cancro gástrico [28-31], proteína HER-2 também apresenta a sobre-expressão em muitos tecidos tumorais, tais como o cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do cólon, etc, portanto, HER-2 não deve ser biomarcador específico para o câncer gástrico. Os nossos resultados mostraram que o antigénio BRCAA1 só é sobre-expresso em 64% ou mais de tecidos de cancro gástrico a partir de pacientes submetidos a cirurgia clínicos, que também confirmou que o antigénio BRCAA1 é sobre-expresso em algumas linhas celulares de cancro gástrico, tais como MKN-1, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III e MGC803 [6-9]. Foram utilizados para preparar células MGC803 modelo de ratinhos nus carregado com cancro gástrico, e com sucesso observado que, como preparado nanossondas preferencialmente acumulado em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais de controlo, e como o tempo de pós-injecção aumentada. Observou-se também que injectado nanossondas em todo o corpo exibiu a depuração dependente do tempo e os sinais de fluorescência diminuída gradualmente como o tempo decorrido devido ao sistema de excreção hepática-cholecyst clareza e rim de nanossondas como preparados. Vários relatórios mostraram que rins apenas nanopartículas claras com 5 nm de diâmetro, em nosso estudo, observou-se que, como preparado nanosondas com 50 nm de diâmetro também pode ser apagada dentro de 12 h. Este mecanismo concreto está em curso.
Nanoprobe biossegurança também é um importante problema de [44], que decide a perspectiva aplicação de nanosondas como preparados. Nossos resultados mostraram plenamente que nanosondas como preparados não danificar órgãos importantes, incluindo fígado, rim, coração, pulmão, etc, também não apresentaram a longo prazo ficar em órgãos importantes, que altamente sugerem que, como preparado nanosondas possui boa biocompatibilidade, e têm grande potencial em aplicações tais como imagens modelo dual e terapia selectiva de câncer gástrico precoce.
Conclusão
Nós preparados com sucesso um romance anti-BRCAA1 FMNPs-nanosondas, que podem ser utilizados para in vivo
dois imagem modal tais como imagens fluorescentes e ressonância magnética, e possui uma capacidade de segmentação, obviamente, específica para um gástricas tecidos cancerosos com 5 mm de diâmetro durante 0,5 h e 12 h de pós-injeção, e próprio bem biocompatibilidade. Este deve ser o primeiro relatório. Os nanossondas multifuncionais preparados como também pode ser utilizado para a terapia de hipertermia de cancro gástrico in vitro sob
alternando a irradiação do campo magnético, e tem um grande potencial em aplicações tais como imagiologia simultânea e segmentação terapia clínica do cancro gástrico no futuro próximo.
Materiais e métodos
preparação de anticorpos monoclonais anti-BRCAA1
experimentos em animais foram realizados de acordo com as Diretrizes para a animal Care e do Comitê Use, Shanghai Jiao Tong University. Os anticorpos monoclonais foram preparados contra uma proteína de fusão purificada BRCAA1. BALB /c ratos fêmeas, 4-6 semanas de idade, foram adquiridos a partir de Xangai LAC Laboratório animal Co. Ltd., da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). Os ratinhos foram imunizados por injecção intraperitoneal com 50 jig de proteína purificada BRCAA1 o qual foi emulsionado com um volume igual de adjuvante completo de Freund. mais três injeções foram administradas utilizando adjuvante incompleto cada duas semanas. Três dias após a última injecção, as células de baço dos ratinhos foram colhidos e fundidos com a linha celular de mieloma de rato Sp 2/0. Após 10-14 dias, os sobrenadantes de cultura foram rastreados com um teste ELISA em que a fase sólida foi revestido com a proteína recombinante BRCAA1 (2 ug /mL) utilizada para a imunização. No processo de triagem, os anticorpos monoclonais para se ligarem com a proteína BRCAA1 revestido foram selecionados. Ao limitar a duas vezes a diluição, as colónias positivas foram subclonadas. fluidos de ascites foram colhidas a partir de ratinhos vacinados com uma injecção intraperitoneal de 0,5 ml de Pristane e depois injectado com 10 6 células de hibridoma. A classe e subclasse de cada mAb foram determinadas utilizando um kit de isotipagem de anticorpos monoclonal de ratinho (Hy Cult Biotecnologia B.V., Holanda). Os mAbs foram purificados a partir dos fluidos ascético de ratinho usando uma proteína G-Sepharose 4FF (Pharmacia, Uppsala, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante para remover componentes que possam interferir com as experiências de bioprospecção. Os títulos de anticorpos foram determinados por métodos de ELISA [45]. Finalmente, um dos anticorpos monoclonais anti-BRCAA1 preparadas foi utilizado como primeiro anticorpo para manchar 50 espécimes de câncer gástrico e controlar os tecidos da mucosa gástrica, que foram recolhidos a partir de Changzheng Hospital e No.1 Pessoas Hospital em Xangai e identificadas por exame patológico.
preparação e superfície funcionalização de FMNPs
preparação de Fe 3O 4 nanopartículas foi baseada na co-precipitação de soluções ferrosos e férricos iões (proporção de 1: 2 molar) [46-49]. nanocristais de CdTe foram sintetizados como se segue de acordo com o nosso relatório anterior: CdCl 2 (5 mmol) foi dissolvido em 110 ml de água, e 12 mmol de TGA foram adicionados sob agitação, seguido por ajustamento do pH a 11 por adição gota a gota de solução 1 M de NaOH. A solução misturada foi colocada num balão de três tubuladuras desarejado por N 2 borbulhar durante 30 min. Sob agitação, 2,5 mmol da solução NaHTe livre de oxigénio foi injectado no balão de três tubuladuras, que foi preparada de fresco a partir de pó de telúrio e NaBH 4 (taxa molar de 1: 2) em água a 0 ° C. A solução resultante foi de cerca de 4 mg /ml, e o produto de 3,5 nm de diâmetro emitida com um máximo de cerca de 630 nm. Fluorescentes nanopartículas magnéticas (FMNPs) foram preparadas usando a abordagem de microemulsão inversa. Antes de acoplar as FMNPs com o BRCAA1, primeiro funcionalizado o grupo funcional superfície de FMNPs como grupo carboxilo. 95 ml de etanol e 2 mL de 3-Aminopropyltriethoxysilane (EPA) foram adicionados para formar uma solução misturada e deixada a reagir à temperatura ambiente durante 24 h. Os FMNPs modificado com aminossilano foram separados por íman permanente e lavaram-se com água desionizada três vezes. Em seguida, o redispersas FMNPs-NH 2 em 100 ml de dimetilformamida (DMF), adicionou-se anidrido succínico excessiva para formar uma solução mista e reagir à temperatura ambiente durante 24 h. Os FMNPs modificado com carboxilo foram separados por íman permanente e novamente lavado com água desionizada três vezes.
Preparação e caracterização de anticorpos BRCAA1 FMNPs conjugado
nós utilizadas processo de dois passos para se obter a conjugação anti-estável BRCAA1-FMNPs [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg solução FMNPs-COOH foi dispersa em 2 ml de tampão pH 7 PBS, e foi sonicada durante 10 min. Em seguida, misturou-se 1 ml de fresco EDC a 400 mM e 100 mM NHSs em tampão de pH 6,0 e rodado MES-la à temperatura ambiente durante 15 min. Após isso, a solução resultante foi separado por campo magnético e 1 mg /mL de anticorpo monoclonal BRCAA1 foram adicionados à mistura anterior, agitou-se em local escuro durante 2 h. Para remover BRCAA1 livre, a mistura de reacção residual foi separado por campo magnético e o sólido remanescente foi lavado com 1 mL de tampão PBS três vezes. Finalmente, 1 ml de 0,05% de Tween-20 /PBS foi adicionado à conjugação BRCAA1-FMNPs eo foi guardada a 4 ° C bio-conjugação final. Quando usado, este conjugação BRCAA1-FMNPs devem ser diluídas com PBS /0,05% de Tween-20. Em seguida, usamos o dispositivo Nano Gota quantificar a taxa de acoplamento do anticorpo BRCAA1 com FMNPs-COOH. Antes de reacção de acoplamento, que mediu a concentração total de anticorpos BRCAA1. Após a reacção de acoplamento, que mediu a concentração de anticorpo na mistura de reacção BRCAA1 residual e calculou-se a taxa de acoplamento de acordo com a equação:
acoplamento (%) = (1-A concentração do anticorpo na mistura de reacção BRCAA1 residual /concentração total de anticorpos BRCAA1) × 100.
Os nanosondas como preparados e FMNPs puras foram caracterizados por microscopia eletrônica de transmissão e fotoluminescência espectrometria (PL), e analisador de potencial Zeta.
nanosondas para imagiologia in Vitro
direcionamento das células cancerosas gástricas
a linha gástrico célula cancerosa MGC803 células com sobre-expresso de proteína BRCAA1 foram usadas como células alvo, as células de fibroblastos humanos sem proteína BRCAA1 expresso foi utilizado como controlo, foram cultivados e colhidos, e em seguida foram tratadas com 50 ug /ml de BRCAA1-FMNPs nanossondas e cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 incubadora de ar equilibrado a 37 ° C durante 4 h, enquanto isso, a MGC803 e células de fibroblastos humanos foram tratados com FMNPs como o grupo de controlo. Depois, as células foram lavadas três vezes com PBS, e as células, em seguida, fixadas com solução de glutaraldeído a 2,5% durante 30 min. Para contracoloração nuclear, MGC803 foram incubadas com Hoescht 33258 1 mM em PBS durante 5 min. As células foram observadas por microscópio de fluorescência (Nikon TS100-F), e fotografada por instrumento de imagem GE HDX 3.0T MR equipado com software ParaVision 3.0.
Nós também utilizado citômetro de fluxo para avaliar a célula cancerosa gástrica segmentação capacidade de BRCAA1- FMNPs nanosondas.

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