BRCAA1 monoklonale Antikörper fluoreszierende magnetische Nanopartikel für die in vivo gezielte magnetofluorescent Bildgebung von Magen cancer

BRCAA1 monoklonalen Antikörper konjugiert fluoreszierende magnetische Nanopartikel für die in vivo
gezielte magnetofluorescent Bildgebung von Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Magenkrebs konjugiert ist 2. am häufigsten auftretende Krebsart in China, und ist immer noch die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt. Wie zu erkennen frühen Zellen Magenkrebs ist nach wie vor eine große Herausforderung für die Früherkennung und Therapie von Patienten mit Magenkrebs. Ziel dieser Studie war eine Art von multifunktionalen Nanosonden für in vivo
gezielte magnetofluorescent Bildgebung von Magenkrebs zu entwickeln.
Methods
BRCAA1 monoklonaler Antikörper hergestellt wurde, wurde als erster Antikörper verwendet, um 50 Paare von Proben von Magen zu färben Krebs- und normale Magenschleimhaut Gewebe kontrollieren, und konjugiert mit fluoreszierenden magnetischen Nanopartikeln mit 50 nm im Durchmesser, die resultierenden BRCAA1 konjugierten fluoreszierenden magnetischen Nanosonden durch Transmissionselektronenmikroskopie und Photolumineszenz-Spektrometrie charakterisiert wurden, wie hergestellt Nanosonden wurden mit Magenkrebs MGC803 Zellen inkubiert, und wurden in Mäuse-Modell mit Magenkrebs von 5 mm im Durchmesser über die Schwanzvene injiziert geladen und dann durch fluoreszenzoptische Abbildungs ​​und Magnetresonanztomographie abgebildet wurden, wurde ihre Bioverteilung sucht. Die Gewebeschnitte wurden durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und die wichtigen Organen wie Herz, Lunge, Niere, Gehirn und Leber wurden durch Hämatoxylin und Eosin (HE) stain-Methode analysiert.
Ergebnisse
BRCAA1 monoklonale Antikörper wurde erfolgreich hergestellt, BRCAA1 Protein zeigte über~~POS=TRUNC in 64% Magenkrebsgewebe, keine Expression in normalen Kontrolle Magenschleimhaut Gewebe gibt es statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen (p
< 0,01). Die BRCAA1-konjugierten fluoreszierenden magnetischen Nanosonden zeigen eine sehr geringe Toxizität, niedrigere magnetische Intensität und geringere Fluoreszenzintensität mit Peak-Blauverschiebung als reine FMNPs, könnte durch Magenkrebs MGC803 Zellen Endozytose werden, könnten in vivo
Magenkrebsgewebe gezielt loaded von Mäusen und könnte zu Bildmagenkrebsgewebe durch Fluoreszenz-Bildgebung und Magnetresonanztomographie, und hauptsächlich in verteilten lokalen Magenkrebsgewebe innerhalb von 12 h nach der Injektion verwendet werden. HE-Färbung Analyse zeigte, dass keine offensichtlichen Schäden in wichtigen Organen beobachtet.
Schlussfolgerungen
Die High-Performance-BRCAA1 monoklonalen Antikörper-konjugierte fluoreszierende magnetische Nanopartikel gezielt in vivo
Magenkrebszellen können für die gleichzeitige magnetofluorescent verwendet werden Bildgebung und kann ein großes Potenzial in Anwendungen wie Dual-Modell Bildgebung und lokale thermische Behandlung von Magenfrühkarzinomen in naher Zukunft.
Hintergrund
Magenkrebs war einst die zweithäufigste Krebserkrankung in dem Wort [1]. Bis heute in den Vereinigten Staaten, Magen Bösartigkeit ist derzeit der 14. am häufigsten auftretende Krebsart und 2. am häufigsten auftretende Krebsart in China [2, 3]. Magenkrebs ist immer noch die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in der Welt und bleibt schwer zu heilen, weil die meisten Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung vorhanden. Deshalb, wie zu erkennen, verfolgen oder Magenfrühkrebszellen zu töten ist sehr Schlüssel für eine frühzeitige Diagnose und Therapie von Patienten mit Magenkrebs. Bis heute
, auf der Suche nach Biomarkern eng mit Magenkrebs assoziiert ist nach wie vor eine wichtige Aufgabe. Seit 1998 haben wir versucht worden ist, um eine Magenfrühkarzinomen vorwarnung System [4] zu etablieren, und hoffen, dass die Vorwarnzeit System zu verwenden, um Magenfrühkarzinomen Zellen erkennen, um die Patienten mit frühem Magenkrebs erkennen. Obwohl einige unterschiedlich exprimierter Gene mit frühen Magenkrebs assoziiert identifiziert wurden [5, 6], kann niemand Gen spezifisch sein Biomarkers von Magenkrebs bestätigt werden. Deshalb, um Magenfrühkarzinomen Zellen zu erkennen, nur wir potentielle Biomarker wählen mit Magenkrebs in Verbindung gebracht, und Nanopartikel und molekularen Bildgebungstechniken kombinieren, versuchen Sie, in vivo
frühen Magenkrebszellen durch in-vivo-
Tumor gezielt Bildgebung finden . In unserer bisherigen Arbeit, wir abgesiebt und geklont BRCAA1 Gen aus Brustkrebs-Zelllinie MCF-7cells (Brustkrebs-Antigen 1-Gen assoziiert) [AF208045, auch ARID4B (AT-reiche interaktiver Domäne-enthaltendes Protein 4B) genannt] und identifiziert ihre Antigen-Epitop-Peptid SSKKQKRSHK [7, 8]. Wir stellten auch BRCAA1 polyklonalen Antikörper, und beobachtet, dass die BRCAA1 Protein in fast 65% klinischen Proben von Magenkrebsgewebe Überexpression zeigte [9-11]. Wir beobachteten auch, dass BRCAA1 Antigen in Magenkrebszelllinien wie MKN-1, MKN-74, SGC-7901, KATO-III und MGC803 Zellen überexprimiert ist. Daher erwarten wir, dass BRCAA1 Protein Potential Targeting-Molekül sein kann für in vivo
Magenkrebszellen.
In den letzten Jahren die molekulare Bildgebung Technologien auf Basis von multifunktionalen Nanosonden haben große Fortschritte gemacht. Zum Beispiel Nanopartikel wie Quantenpunkte, magnetische Nanopartikel und Gold-Nanostäbchen etc. wurden für die molekulare Bildgebung [12-19] verwendet. Bisher mehrere kleine Tierbildgebungstechniken wie optische Abbildungs ​​entwickelt (OI) der Biolumineszenz (BLI), Fluoreszenz (FLI) und der Intravitalmikroskopie (IVM), Mikro-PET, MRI und CT [20-26]. Unter all diesen Technologien, wie sie ihre räumliche Auflösung und Gewebetiefe Empfindlichkeit zu verbessern, ist eine große Herausforderung. Bisher in vivo
Tumorgeweben mit mehr als 1 cm im Durchmesser leicht durch CT, MRI, PET und Biolumineszenz-Bildgebung identifiziert werden, Tumoren mit weniger als oder gleich 5 mm im Durchmesser ist sehr schwierig, in der klinischen Patienten gefunden werden. In unseren früheren Berichten Photosensibilisator-konjugierte magnetische Nanopartikel wurden in vivo
gleichzeitige magnetofluorescent Bildgebung und Targeting-Therapie [27] erfolgreich eingesetzt. Jedoch war die Targeting Fähigkeit von Nanosonden stark abhängig von magnetischen Nanopartikeln. Wir stellten auch eine multifunktionale Ribonuklease-A-konjugierte CdTe-Quantenpunktcluster Nanosystem für die synchrone Krebs-Bildgebung und Therapie [28], die zielgenaue Bindungsfähigkeit wie hergestellt Nanosonden ist auf RGD-Peptid abhängig. Einige Studien zeigen, dass HER-2-Protein abnormal Expression in 6-35% Magenkrebsgewebe zeigt [29, 30], und wurde als therapeutisches Ziel für die klinische Patienten mit Magenkrebs eingesetzt [31] daher HER-2-Protein besitzt ein großes Potenzial in der Bildgebung und Therapie von Magenkrebs. Doch auf dem neuesten Stand, zeigt keinen Bericht, dass eine gezielte Bildgebung und Therapie von in vivo
Magenkrebs basiert auf Biomarker mit Magenkrebs in Verbindung gebracht.
In den letzten Jahren haben wir kontrolliert vorbereitet Silikabeschichteten Quantenpunkte und superparamagnetischen Nanopartikel-Komposite (FMNPs) mit starken Fluoreszenzsignalen und hervorragenden magnetischen Eigenschaften, und haben sie für Bio-Kennzeichnung verwendet, Stammzellen-Tracking, Bio-Trennung, Targeting-Bildgebung und Hyperthermie von Tumoren [29-32], beobachteten wir auch, dass wie hergestellt Nanopartikel besitzen eine gute Biokompatibilität und Stabilität [33-38]. In diesem Papier
wir in vollem Umfang die Vorteile von FMNPs und BRCAA1 Antigen bereit, monoklonale Antikörper gegen BRCAA1 Protein verwenden, und bereit BRCAA1 monoklonalen Antikörper-konjugierten fluoreszierenden magnetischen Nanosonden (BRCAA1- FMNPs) eingesetzt Nacktmäuse-Modell geladen mit Magenkrebs von 5 mm im Durchmesser und IVIS Abbildungssystem und Magnetic Resonance Imaging, untersuchten die Möglichkeit der Herstellung als Nanosonden für nicht-invasive in vivo
gezielte dual modal Bildgebung von Magenkrebs. Die Ergebnisse zeigen, dass so hergestellte Nanosonden können für in vivo
Dual-Modell Abbildung von Magenkrebs verwendet werden, und in Anwendungen wie Dual-Modell Bildgebung und lokale thermische Behandlung von Magenfrühkarzinomen in naher Zukunft ein großes Potenzial haben.
Ergebnisse und Diskussion
Charakterisierung von anti-monoklonalem Antikörper BRCAA1
Wie in Tabelle 1 gezeigt, haben wir erfolgreich zwei positive Klon-Zellinien S-200-5, erhalten und S-335-5, deren Titer waren unterschiedlich, schließlich wir wählten das anti-BRCAA1 monoklonalen Antikörpers aus S-200-5-Zellinie als der erste Antikörper Magenkrebsgewebe und Kontrollgewebe zu färben. Wir fanden, dass BRCAA1 Protein in 64% Magenkrebsgewebe Überexpression zeigten, keine Expression in normalen Kontrollmagenschleimhautgewebe, wie in Figur 1 gezeigt ist, gibt die statistische Differenz zwischen zwei Gruppe existiert (P
< 0,01). Dieses Ergebnis ist fast identisch mit unseren früheren Bericht [4, 9-11], die stark vermuten, dass BRCAA1 Antigen kann als potentielles Ziel für die meisten Magenkrebs ausgewählt werden, wenn wie hergestellt Nanosonden 64% der Patienten mit frühem Magenkrebs erkennen kann, es wird für die Diagnose und Therapie von klinischen Magenkrebs patients.Table 1 Titer von BRCAA1 Monoclonal Antibodies in Aszitesflüssigkeit, induziert durch Hybridomklons Zellen durch ELISA
sehr nützlich sein,
Antikörpertiter *
Clone
BRCAA1 (C) OVA **
BRCAA1 (C) -BSA **
BSA **
OVA **
S-200-5
1.024.000
1.024.000
< 1000
< 1000
S-335- 5
128.000
512.000
< 1000
< 1000
* die reziproke von Aszites-Flüssigkeit Verdünnung, die erste Verdünnung von Aszites-Flüssigkeit war. 1: 1000
** die Antigene wurden auf ELISA-Platte beschichtet.
1 Expression von BRCAA1 Protein in Magenkrebsgewebe und normale Kontrolle Magenschleimhaut Gewebe Abbildung. A: Magenkrebsgewebe, × 100; B: normale Kontrollgeweben, × 50
Herstellung und Charakterisierung von BRCAA1- FMNPs Nanoprobes
Wie in 2A gezeigt ist, wurden hergestellt FMNPs bestehend aus Siliciumdioxid-wrapped CdTe und magnetische Nanopartikel, deren Größe waren 50 nm oder so in Durchmesser. Wie in 2D gezeigt, nach FMNPs mit anti-BRCAA1 Antikörper konjugiert wurden, wie hergestellt Nanosonden "Photolumineszenz (PL) war Intensität geringer als die von FMNPs linksVerschiebung von 40 nm aufweist, die durch war der Polarisationsrate zu verringern der umgebenden Moleküle und in der Abnahme der Stokes- Verschiebung resultierende schließlich in einer Blauverschiebung in den Emissionsspektren ergeben. In ähnlicher Weise war magnetische Intensität wie hergestellt Nanosonden auch niedriger als FMNPs. Figur 2: Charakterisierung von anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden. A: HR-TEM-Aufnahme von FMNPs; B: magnetische Eigenschaft von Anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden; C: Zeta-Potential von FMNPs mit Amino-Gruppe, COOH, Si-O-Gruppe; D:. PL-Spektren von FMNPs konjugiert mit und ohne BRCAA1 Antikörper
Im Zuge BRCAA1-FMNPs Nanosonden für die Vorbereitung, fanden wir, dass die Oberflächenfunktionalisierung von FMNPs sehr Schlüssel war anti-BRCAA1 mit FMNPs über kovalente Bindung Antikörper zu konjugieren. Wie in 2C gezeigt ist, verschiedene funktionelle Gruppen FMNPs unterschiedliche Zeta-Potentialwerte. FMNPs hatten negative Si-O-Gruppe, deren Zeta-Potential-Wert betrug -34,05 mV, die FMNPs mit Amino-Gruppe hatte positives Zeta-Potential-Wert von 24,80 mV, FMNPs mit Carboxylgruppe hatte negatives Zeta-Potential-Wert von -30,50 mV. Wir beobachteten, daß Carboxylgruppen auf der Oberfläche der FMNPs konjugiert mit anti-Antikörper BRCAA1 einfacher als Aminogruppen auf der Oberfläche des FMNPs. Wie in Tabelle 2 gezeigt, war die durchschnittliche Kopplungsrate von Anti-BRCAA1 Antikörper mit FMNPs-COOH 80,28% .Tabelle 2 Kupplungsfrequenzmessung von FMNPs-anti-BRCAA1 Antikörper

Gesamtkonzentration des Anti BRCAA1 Antikörper (ng /&mgr; l)
die Konzentration des Anti-Antikörpers in BRCAA1 Restreaktionsmischung (ng /&mgr; l)
Kopplungsrate (%)

1
1000.0
197.3
80.27
2
1000.0
191.2
80.88
3
1000.0
203.0
79.70
Wie präparierte Nanosonden für die in vitro
gezielte cytometer Magenkrebszellen
Targeting Fähigkeit als präparierte Nanosonden in vitro
wurden durch Fluoreszenzmikroskop beobachtet und berechnet durch FACSCalibur Fluss. Wie in Figur 3 gezeigt, FMNPs zufällig in das Innere des Cytoplasmas dispergiert und anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden existierte Nukleolus herum. Beide FMNPs und zubereitete BRCAA1-FMNPs Nanosonden in das Zytoplasma MGC803 Zellen nach 4 h Inkubation mit MGC803 Zellen eindringen kann, wie in 4A gezeigt, FMNPs 25,23% MGC803 Zellen bezeichnen könnte, bleiben die 74,77% der Zellen konnte nicht markiert werden. Wie in 4B gezeigt, 45,92% MGC803 Zellen konnte durch die BRCAA1-FMNPs Nanosonden markiert werden. Wenn FMNPs und anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden jeweils mit MGC803 Zellen und menschlichen Fibroblasten-Zellen für 0,5 Stunden inkubiert wurden, haben wir eine Menge von Anti-BRCAA1-FMNPs in MGC803 Zellen eingegeben Nanosonden beobachtet, wenige Nanosonden in menschliche Fibroblasten-Zellen eingegeben, konnte wenige FMNPs geben Sie in MGC803 Zellen und menschlichen Fibroblasten-Zellen, die sehr nahe legen, dass Anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden spezifisch MGC803 Zellen ausrichten können. Die Magnetresonanztomographie MGC803 Zellen und menschlichen inkubiert Fibroblastenzellen mit anti-BRCAA1-FMNPs für 4 h wurden in 5 gezeigt ist, MGC803 Zellen starkes magnetisches Signal als das menschliche Fibroblastenzellen (HDF) zeigten, die auch zeigten, daß die hergestellten Nanosonden ausrichten können MGC803 Zellen spezifisch. 3 In-vitro-Fluoreszenzbilder von MGC 803, nachdem sie mit FMNPs behandelt und FMNPs-BRCAA1 Nanopartikel (Vergrößerung = × 200). Die obere Gruppe von Bildern illustriert FMNPs zufällig in das Zytoplasma zu verteilen, die untere Gruppe von Bildern FMNPs-BRCAA1 um den Kernkörperchen verteilt ausgestellt und war gut auf die MGC803 Targeting-Fähigkeit.
4 FACSCalibur Durchflusszytometer Analyse von MGC803 mit FMNPs beschriftet Abbildung und FMNPs-BRCAA1. A: die MGC803 mit 50 ug /ml behandelt von FMNPs 24 h 25.23% Zelle zeigten, wurden mit FMNPs markiert. B: die MGC803 mit 50 ug /ml FMNPs-BRCAA1 behandelt für 24 h dargestellt bis zu 45,92% Zelle wurden mit FMNPs-BRCAA1 markiertem
5 MR Bildgebung von MGC803 Zellen und HDF-Zellen Abb.. A: MGC803 Zellen mit anti-BRCAA1-FMNPs. B: HDF-Zellen mit anti-BRCAA1-FMNPs. C:. MGC803 Zellen mit nur FMNPs
Wie vorbereitet Nanosonden für Fluoreszenz-Bildgebung von in vivo
Magenkrebszellen
Um Tumor gezielt Eigenschaften von Anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden, Nacktmäuse Modelle beladen mit MGC- bewerten 803 Magenkrebszellen wurden hergestellt und unter einer nicht-invasive Weise für 12 h überwacht durch IVIS Fluoreszenz-Bildgebungssystem. Videos Überwachung Echtzeit-Fluoreszenzintensität in den ganzen Körper, der Tumor-Targeting-Charakter des Anti BRCAA1- FMNPs Sonde wurde in den Nacktmäusen beladen mit Magenkrebs MGC803 Zellen leicht bestimmt. Wie in 6A gezeigt ist, erzeugt die ganze Tiere Fluoreszenzsignale innerhalb von 30 min nach der Injektion von Nanosonden könnten die subkutanen Tumorgewebe deutlich von dem umgebenden Hintergrundgewebe zwischen 1 h und 12 h nach Injektion abgegrenzt werden, mit maximalen Kontrastes auftritt bei 6 h nach der Injektion. Starkes Fluoreszenzsignal wurde noch in der Tumorstelle bei 6 h nach der Injektion festgestellt werden, was zeigte, dass die anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden wurden in den Tumorgeweben bevorzugt akkumuliert. Zwar basierend auf den Ergebnissen in 6B, die höhere Tumor zu Hintergrund-Verhältnis (TBR) Wert dringend empfohlen, wie hergestellt Nanosonden vorzugsweise in Tumorgeweben akkumuliert im Vergleich zu normalen Kontrollgewebe. Dies wurde in Fluoreszenzaufnahmen bestätigt, die zeigte, dass das Fluoreszenzsignal wie hergestellt Nanosonden in der Tumorstelle stärkste unter allen Mäusen Organen wurde wie in 6C gezeigt. Zusätzlich wird nach 12 h nach der Injektion von anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden, die Fluoreszenzintensität in Tumor wurde noch deutlich beobachtet, während die Aufnahme von vorbereiteten Nanosonden in normalen Organen nicht offensichtlich war. Diese Daten legen nahe, dass sehr bereit, Nanosonden Ziel hocheffizient Tumorgewebe innerhalb Nacktmäusen mit Magenkrebs geladen. Wir beobachteten auch, dass diese Nanosonden in der ganzen Maus Körper fast vollständig bei 12 h nach der Injektion verschwunden, wir erkannt auch die Nanosonden vom cholecyst System verlassen geführt (Daten nicht gezeigt), die zeitabhängige cholecyst Clearance von Nanosonden sehr empfehlen, dass zubereitet, Nanosonden können nicht in Nacktmäusen für längere Zeit bleiben, so, wie hergestellt Nanosonden gute biologische Sicherheit besitzen. 6 In-vivo-Fluoreszenzbilder von Tumorakkumulation und Gewebeverteilung für FMNPs-BRCAA1 Nanopartikel in MGC803 menschlichen Magentumortragenden Nacktmäusen ohne Thymus. A, In-vivo-
Fluoreszenzbilder von Nacktmäusen ohne Thymus tragen. MGC803 menschlichen Magentumor wurde nach der Injektion von FMNPs-BRCAA1 Nanopartikel zu unterschiedlichen Zeitpunkt erhalten. Die Tumorlokalisation ist mit einem Pfeil angegeben. A-1: 0 h, A-2: 0,5 h, A-3: 1 h, A-4: 3 h, A-5: 6 h, A-6: 12 h. B, TBR [Gewebe Hintergrund (Muskel) Verhältnis] Wert. Der TBR-Wert wurde wie folgt ermittelt: TBR = (Tumor-Signal-Hintergrundsignal) /(Hintergrundsignal). C, Ex-vivo-
Fluoreszenzbilder von seziert Organe und Tumor von Mäusen MGC803 menschlichen Magentumor Lager geopfert bei 12 Stunden nach der Injektion von FMNPs-BRCAA1 Nanopartikel. Die Fluoreszenzbilder von seziert Organe und Tumor wurden mit einem Fluoreszenz-Bildgebungstechnik mit einem 630 nm Emissionsfilter erhalten. D, Bioverteilung von Anti- BRCAA1-FMNPs bei Mäusen nach intravenöser Injektion. Mehreren Zeitpunkten nach der Injektion Eisenmengen in Gewebeproben wurden durch ICP-Massenspektrometrie untersucht (n = 3).
Pathologische Analyse von Tumor und wichtige Organe
In vitro
Bewertung der exzidierten Haupt Geweben, einschließlich Leber, Lunge , Milz, Niere und Herz, sowie der Tumor, angegeben, dass die anti-BRCAA1-FMNPs Sonden waren hauptsächlich-up aufgenommen von Tumorgewebe, die eine starke Fluoreszenzsignale zeigten, wie in 7, während andere Gewebe, einschließlich Leber gezeigt , Lunge, Milz und Herz up-nahm anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden sehr weniger, was furtherly zeigt an, dass als vorbereitete BRCAA1-FMNPs Nanosonden Magenkrebsgewebe ausrichten können. Wir haben auch HE-Färbung alle Organe zu überprüfen, keine offensichtlichen Schäden wurden in wichtigen Organen beobachtet [weitere Datei 1]. Abbildung 7 Ergebnis Immunfluoreszenzanalyse. A, Tumorgewebe. B, Leber. (Vergrößerung = × 200).
Wie vorbereitet Nanosonden für die MR-Bildgebung von Nacktmäusen mit Magenkrebs geladen
In vivo
MR-Bildgebung auf Nacktmäusen durchgeführt wurde, mit subkutanen Magenkrebs geladen bei 12 Stunden nach der Injektion . Repräsentative Bilder von T2 Karten wurden in 8 gezeigt, nachdem die Nanosonden Injizieren, eine wesentliche Änderung in der Signalintensität wurde in einigen Regionen von Tumoren beobachtet, was darauf hinweist, dass es Akkumulation der Nanosonden in Tumorstelle existiert, wie in Figur 8B gezeigt ist, wie der Pfeil gezeigten zeigte. Als Kontrolle, nachdem die Mäuse-Modell mit Magenkrebs wurden injiziert FMNPs 12 h wurden die Mäuse MR-Bildgebung durchgeführt, die nicht intensiv Signal in Tumorbereich (8A) aufwies. Abbildung 8 MRT-Bild von Mäusen. A, FMNPs ohne BRCAA1 B Kupplung, FMNPs gekoppelt mit BRCAA1
möglicher Mechanismus der Bildgebung
In den letzten Jahren Targeting, molekulare Bildgebung Technologien wurden für die Echtzeit und nicht-invasive Bildgebung von in vivo
Tumorgewebe verwendet [39-43]. Beispielsweise Quantenpunkte aufgrund ihrer einzigartigen Photolumineszenzeigenschaften wurden für bio-Kennzeichnung und Fluoreszenz-Bildgebung [11-13, 33, 43], aber quantum dots "Toxizität beschränkt ihre Anwendung im menschlichen Körper, so weit etwas sicheren Quanten verwendet Punkte entwickelt werden. Magnetische Nanopartikel sind auch als Kontrast Reagenz zur MR-Bildgebung [15, 33, 36] verwendet. Zur gleichen Zeit, eine Kombination von zwei Bildgebungsverfahren bietet die Vorteile von beiden als die Verwendung einer Methode, die umfassende Informationen über die Lokalisation von Tumoren, Umwelt und Status bieten würde.
In dieser Studie entwickelten wir und bereit, eine neuartige Bildgebungssonde, die wurde von Silizium-wrapped Quantenpunkten zusammengesetzt und magnetische Nanopartikel mit dem Ziel, ihre Biokompatibilität zu verbessern. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die vorbereitete Silizium-wrapped Quantenpunkte und magnetische Nanopartikel sind sehr stabil, und eigene starke Fluoreszenzsignale und magnetische Intensität. Verwendung der starken Fluoreszenzsignalen wie hergestellt Nanosonden, erhalten wir erfolgreich die Fluoreszenzbilder von in vivo
Magenkrebsgewebe mit 5 mm Durchmesser in Nacktmäuse-Modell. Verwendung der starken magnetischen Signale wie hergestellt Nanosonden wir auch erhalten erfolgreich MR-Bilder von in vivo
Magenkrebsgewebe mit 5 mm Durchmesser in Nacktmäuse-Modell. Im Vergleich zu früheren Berichten, größere Größe von Tumorgewebe (> 5 mm) leicht unter Verwendung Fluoreszenz-Bildgebung und MRT-Bildgebung, als Kontrast abgebildet werden konnten, unsere Ergebnisse zeigen, dass wie hergestellt Nanosonden kleinere Größe von Tumorgewebe nachweisen kann (weniger 5 mm im Durchmesser), die wesentlich die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens verbessert. Unser Ergebnis ist auch das erste Mal, Dual-modal-Targeting Bildgebung in vivo
Magenkrebsgewebe zu berichten.
Wie in vivo
Magenkrebs an Zielgewebe ist auch ein anfechtbarer Problem. Bis heute wurden keine spezifischen Magenkrebs Biomarker berichtet. Obwohl HER-2-Proteins bestätigt wurde in 6-35% der Magenkrebsgewebe positiven Ausdruck zu haben [28-31], HER-2-Protein zeigt auch eine Überexpression in vielen Tumorgeweben, wie Brustkrebs, Lungenkrebs, Darmkrebs, etc daher HER-2 sollte nicht spezifische Biomarker für Magenkrebs sein. Unsere Ergebnisse zeigten, dass BRCAA1 Antigen nur überexprimiert in 64% oder so von Magenkrebsgewebe aus klinischen Chirurgie-Patienten, haben wir auch bestätigt, dass BRCAA1 Antigen in einigen Magenkrebszelllinien wie MKN-1 überexprimiert, MKN-74 , SGC-7901, KATO-III und MGC803 [6-9]. Wir verwendeten MGC803 Zellen Nacktmäuse Modell vorbereiten mit Magenkrebs geladen und beobachtet erfolgreich, dass wie hergestellt Nanosonden bevorzugt in Tumorgeweben akkumuliert im Vergleich zu normalen Kontrollgewebe, und wie die Nacheinspritzung Zeit erhöht. Wir beobachteten auch, dass Nanosonden in den ganzen Körper injiziert, um die zeitabhängige Clearance zeigten und die Fluoreszenzsignale allmählich verringert, wie die durch die Leber-cholecyst Ausscheidungssystem und Niere Klarheit der Herstellung als Nanosonden verstrichene Zeit. Mehrere Berichte zeigten, dass Niere nur klare Nanopartikel mit 5 nm im Durchmesser, in unserer Studie haben wir festgestellt, dass wie hergestellt Nanosonden mit 50 nm Durchmesser auch innerhalb von 12 Stunden gelöscht werden konnte. Diese konkrete Mechanismus ist im Gange.
Nanoprobe Biosicherheit ist auch ein wichtiges Problem, [44], die die Anwendung in Aussicht wie hergestellt Nanosonden entscheidet. Unsere Ergebnisse zeigten, vollständig, dass als vorbereitete Nanosonden nicht wichtige Organe einschließlich Leber, Niere, Herz, Lunge, etc hat beschädigt, auch nicht langfristig haben zeigen in wichtigen Organen zu bleiben, was sehr nahe legen, dass als hergestellte Nanosonden besitzen eine gute Biokompatibilität und haben ein großes Potenzial in Anwendungen wie duale Modell Bildgebung und selektive Therapie von Magenfrühkarzinomen.
Fazit
Wir haben erfolgreich ein neuartiges anti-BRCAA1-FMNPs Nanosonden vorbereitet, die für in vivo
zwei modalen Bildgebung verwendet werden können eine offensichtlich spezifische Targeting Fähigkeit zu einem Magenkrebsgewebe mit 5 mm Durchmesser bei 0,5 h und 12 h nach der Injektion und eigene gute Biokompatibilität wie Fluoreszenz-Bildgebung und Magnetresonanztomographie, und besitzen. Dies sollte erste Bericht sein. Die so vorbereitete multifunktionale Nanosonden können auch unter in vitro
alternierendes Magnetfeld Bestrahlung zur Hyperthermie-Therapie von Magenkrebs verwendet werden und haben ein großes Potential in Anwendungen wie beispielsweise die gleichzeitige Bildgebung und Targeting-Therapie von klinischen Magenkrebs in naher Zukunft.
Material und Vorbereitung
Methoden der Anti-BRCAA1 monoklonalen Antikörper
Tierversuche gemäß Richtlinien für die Tierpflege und Use Committee, Shanghai Jiao Tong University durchgeführt wurden. Monoklonale Antikörper wurden gegen gereinigtes Fusionsprotein BRCAA1 hergestellt. Balb /c weibliche Mäuse, 4-6 Wochen alt, wurden von der Shanghai LAC Labortier Co. Ltd., Chinesische Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion mit 50 ug gereinigtem BRCAA1 Protein immunisiert, das mit einem gleichen Volumen von komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert wurde. Drei weitere Injektionen wurden mit unvollständigem Adjuvans alle zwei Wochen verabreicht. Drei Tage nach der letzten Injektion wurden die Milzzellen der Mäuse wurden mit der Sp 2/0 Maus-Myelom-Zelllinie geerntet und fusioniert. Nach 10-14 Tagen wurden die Kulturüberstände mit einem ELISA-Test gescreent, in der die feste Phase mit dem rekombinanten BRCAA1 Protein (2 &mgr; g /mL) verwendet zur Immunisierung beschichtet. Im Screening-Prozess, zu binden die monoklonalen Antikörper mit beschichteten BRCAA1 Protein ausgewählt wurden. Durch zweimaliges Grenzverdünnung wurden positive Kolonien subkloniert. Aszites-Flüssigkeiten wurden aus den Mäusen geerntet grundiert mit einer 0,5 mL intraperitoneale Injektion von Pristan und dann mit 10 6 Hybridoma-Zellen injiziert. Die Klasse und Unterklasse jedes mAb wurden mit einem monoklonalen Maus-Antikörper Isotypisierungskits (Hy Cult Biotechnology B.V., Niederlande) bestimmt. Die mAbs wurden von der Maus ascetic Flüssigkeiten gereinigten Komponenten unter Verwendung einer Protein-G-Sepharose 4FF (Pharmacia, Uppsala, Schweden) Säule gemäß den Anweisungen des Herstellers zu entfernen, die mit den Experimenten Biopanning stören könnten. Die Antikörpertiter wurden durch ELISA-Verfahren bestimmt [45]. Schließlich eine präparierte anti-BRCAA1 monoklonale Antikörper wurde als erster Antikörper verwendet, um 50 Proben von Magenkrebs zu färben und Magenschleimhaut Gewebe steuern, die von Changzheng Hospital und No.1 Menschen Hospital in Shanghai und identifiziert durch pathologische Untersuchung gesammelt wurden.
Vorbereitung und Oberflächenfunktionalisierung von FMNPs
Herstellung von Fe 3O 4-Nanopartikel wurde basierend auf Co-Ausfällung von Eisen- und Eisen-III-Ionen-Lösungen (1: 2 Molverhältnis) [46-49]. CdTe-Nanokristalle wurden wie folgt synthetisiert nach unserem früheren Bericht: CdCl 2 (5 mmol) wurde in 110 ml Wasser gelöst und 12 mmol des TGA wurden unter Rühren zugegeben, gefolgt von der pH auf 11 durch Zutropfen Einstellen von 1 M NaOH-Lösung. Die gemischte Lösung wurde in einen Dreihalskolben entgast durch N 2 Sprudeln für 30 min plaziert. Unter Rühren werden 2,5 mmol des sauerstofffreien nähte Lösung wurde in den Dreihalskolben eingespritzt wird, die frisch aus Tellur Pulver wurde hergestellt und NaBH 4 (molares Verhältnis 1: 2) in Wasser bei 0 ° C. Die resultierende Lösung wurde etwa 4 mg /ml, und die 3,5 nm Durchmesser Produkt mit einem Maximum um 630 nm emittiert. Fluoreszierende magnetische Nanopartikel (FMNPs) wurden unter Verwendung des Reverse-Mikroemulsions Ansatz vorbereitet. Vor dem Ankoppeln der FMNPs mit dem BRCAA1, funktionalisiert wir zuerst die Oberfläche funktionelle Gruppe von FMNPs als Carboxylgruppe. 95 ml Ethanol und 2 ml 3-Aminopropyltriethoxysilan (APS) wurden hinzugefügt, um eine gemischte Lösung zu bilden, und für 24 h bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Aminosilan-modifizierten FMNPs wurden durch Dauermagneten getrennt und wurden mit deionisiertem Wasser dreimal gewaschen. Dann redispergiert das FMNPs-NH 2 in 100 ml Dimethylformamid (DMF), hinzugefügt übermßige Bernsteinsäureanhydrid um eine gemischte Lösung zu bilden, und reagieren bei Raumtemperatur für 24 h. Die carboxylmodifizierten FMNPs wurden erneut durch Permanentmagneten getrennt und mit entsalztem Wasser dreimal gewaschen.
Herstellung und Charakterisierung von BRCAA1 antikörperkonjugierten FMNPs kaufen Wir verwendeten zweistufigen Prozess stabile anti-BRCAA1-FMNPs Konjugation zu erhalten [ ,,,0],48, 49]. 1,5 mg FMNPs-COOH Lösung wurde in 2 ml PBS pH7-Puffer dispergiert und wurde 10 min beschallt. Dann vermischt man 1 ml frischen 400 mM EDC und 100 mM NHSS in pH 6,0 MES-Puffer und gedreht, um ihn bei Raumtemperatur für 15 min. Danach wurde die resultierende Lösung durch magnetisches Feld getrennt und 1 mg /mL BRCAA1 monoklonaler Antikörper wurden zu der obigen Mischung hinzugefügt, in dunklen Ort für 2 h gerührt. So entfernen Sie wurde frei BRCAA1, das restliche Reaktionsgemisch durch Magnetfeld abgetrennt und der verbleibende Feststoff wurde gewaschen mit 1 ml PBS dreimal puffern. Schließlich wurde 1 ml 0,05% Tween-20 /PBS wurde zu der BRCAA1-FMNPs Konjugation gegeben, und die endgültige bio-Konjugation wurde bei 4 ° C gelagert. Wenn wir verwendet, diese BRCAA1-FMNPs conjugation sollte mit PBS /0,05% Tween-20 verdünnt werden. Dann haben wir den Nano-Tropfen-Gerät die Kopplungsrate von BRCAA1 Antikörper mit FMNPs-COOH zu quantifizieren. Vor der Kupplungsreaktion, maßen wir die Gesamtkonzentration an BRCAA1 Antikörpers. Nach der Kupplungsreaktion, maßen wir die Antikörperkonzentration in BRCAA1 Restreaktionsmischung und die Kopplungsrate gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
Kupplung (%) = (1-Konzentration des Antikörpers in BRCAA1 Restreaktionsmischung /Gesamtkonzentration von BRCAA1 Antikörper) × 100.
Die Herstellung als Nanosonden und reine FMNPs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie und Photolumineszenz (PL) Spektrometrie und Zetapotential Analysator aus.
Nanosonden für in-vitro-
Targeting-Bildgebung von Magenkrebszellen
Magenkrebs-Zelllinie MGC803 Zellen mit überexprimiert BRCAA1 Protein als Zielzellen verwendet wurden, humanen Fibroblasten-Zellen ohne ausgedrückt BRCAA1 Protein als Kontrolle verwendet wurde, wurden kultiviert und gesammelt, und wurden dann mit 50 ug /ml BRCAA1-FMNPs Nanosonden behandelt und kultiviert in einem befeuchteten 5% CO 2 symmetrische Luft Inkubator bei 37 ° C für 4 h unterdessen die MGC803 und humanen Fibroblast-Zellen wurden mit FMNPs als Kontrollgruppe behandelt. Danach wurden die Zellen dreimal mit PBS gespült und dann fixierten Zellen mit 2,5% Glutaraldehyd-Lösung 30 min. Für Kern Gegenfärbelösung wurden MGC803 mit 1 mM Hoechst 33258 in PBS für 5 min inkubiert. Die Zellen wurden durch Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurden (NIKON TS100-F), und abgebildet durch GE HDX 3.0T MR-Abbildungsinstruments mit Paravision 3.0-Software.
Wir verwendeten auch das Durchflusszytometer die Magenkrebszelle Fähigkeit BRCAA1- Targeting zu bewerten FMNPs Nanosonden.

• Tief Sequenzierung des Magenkarzinoms zeigt somatische Mutationen relevant personalisierte Medizin
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