Helicobacter pylori lipopolysackarid modifiering, Lewis antigenuttryck, och gastrisk kolonisering är kolesterolberoende

Helicobacter pylori
lipopolysackarid modifiering, Lewis antigenuttryck, och gastrisk kolonisering är kolesterolberoende Bild Sammanfattning
Bakgrund
Helicobacter pylori
specifikt tar upp kolesterol och innehåller det i bakteriemembranet, men lite är för närvarande känt om kolesterol fysiologiska roller. Vi jämförde fenotyper och in vivo
koloniseringsförmåga av H. pylori
odlas i ett definierat, serumfritt tillväxtmedium, F12 med 1 mg /ml albumin innehållande 0 till 50 pg /ml kolesterol.
Resultat
Medan fördubblingstider var i stort sett opåverkad av kolesterol, har andra uppenbara fenotypiska förändringar observerades. H. pylori
stam SS1 odlas i definierat medium med kolesterol framgångsrikt koloniserat magen av gerbiler, medan SS1 odlas utan kolesterol misslyckades att kolonisera. H. pylori
lipopolysackarid ofta visar Lewis X och /eller Y-antigener. Expression av dessa antigener mäts genom helcells-ELISA markant förbättrat svar på tillväxten av stammen SS1, 26695, eller G27 i kolesterol. Dessutom, elektro analys av lipopolysackarid i vild typ G27 och mutanter som saknar O-kedjan avslöjade strukturella förändringar inom oligosackarid kärna /lipid A-enheterna. Dessa svar i Lewis antigennivåer och i lipopolysackarid profiler kolesterol tillgänglighet var mycket specifika, eftersom inga förändringar skett när kolesterol ersattes av p-sitosterol eller gallsalter. Störning av de gener som kodar för kolesterol α-glukosyltransferas eller lipid A fosfoetanolamin transferas hade ingen effekt på Lewis uttryck, inte heller på lipopolysackarid profiler, inte heller på kolesterol lyhördhet av dessa egenskaper. Rubbning av lipid A 1-fosfatas-genen elimineras effekten av kolesterol på lipopolysackarid profiler men inte dess effekt på Lewis-expression.
Slutsatser
Tillsammans antyder dessa resultat att kolesterol utarmning leder till avvikande former av LPS som är beroende av defosforylering av lipid A i 1-positionen. Ett preliminärt modell för de observerade effekterna av kolesterol diskuteras i vilket sekventiella steg av lipopolysackarid biogenes och, oberoende av varandra, presentation av Lewis-antigen vid cellytan, är beroende av membransammansättningen. Dessa nya rön visar att kolesterol tillgänglighet tillåter H. pylori
att ändra sin cell kuvert på ett sätt som kan påverka kolonisering av värdvävnad in vivo
.
Bakgrund
Helicobacter pylori
är en mycket nisch -adapted patogen som bebor den mänskliga magen, överförs främst inom familjer och har inga kända miljö reservoar. Kroniska infektioner kan vara asymtomatisk eller orsaka gastrit, magsår, eller magcancer. Att etablera infektion, måste bakterien överleva transit genom den sura magsäcken fack [1]. Det tränger och bosätter sig i det skyddande slemlager, ett lipid- och kolesterol rik miljö [2, 3]. Inom denna nisch bakterien använder en mängd olika mekanismer för att undgå värdens immunsvar.
Lipopolysackarider (LPS) på ytan av H. pylori
modifieras för att visa vissa mänskliga blodgruppsantigener, främst Lewis antigener X och Y [ ,,,0],4-7], och mindre ofta H typ 1, i-antigen, blodgrupp A, eller Lewis antigener A eller B [8-10]. Dessa yta LPS-antigener är nödvändiga för fastställandet av infektion, eftersom mutantstammar defekta för LPS O-antigen syntes eller Lewis X /Y uttryck misslyckas att kolonisera möss [11-13]. Det finns bevis för att Lewis antigener uttryckta på bakterieytan bidra till vidhäftning av H. pylori
till gastric epitelceller [10, 14], och spelar en roll vid vävnads tropism [15-17]. Gastriska epitelceller uttrycker också Lewis-antigener [18, 19], vilket tyder på att visningen av Lewis-antigener på bakterieytan kan tjäna som en mimicry strategi. Studier av kliniska isolat [18, 20] och experimentella infektioner hos djur [21] stödja denna roll för bakteriell Lewis antigener i immunundandragande. I mänsklig infektion, har H. pylori
Lewis antigener kopplade till hur allvarligt magsår och duodenit [16, 22]. En annan viktig egenskap hos H. pylori
LPS är dess modifierade lipid A-struktur, med reducerad acylering och färre laddade grupper än vad som är typiskt för enterobakterier [23]. Dessa lipid A modifieringar minimera endotoxiska och inflammatoriska egenskaperna hos H. pylori
LPS (översikt i [24]).
Kolesterol är en icke-essentiell näringsämne för H pylori
, fast den främjar tillväxt i serumfritt medium [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
specifikt införliva kolesterol i bakteriemembranet [27], liksom ett begränsat antal patogena och kommensala bakterier inklusive Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
., Och Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Kolesterol kan stärka membranet i dessa organismer [30-32]. H. pylori
också unikt bildar kolesterol α-glykosid [33, 34], och denna metabolit kan modifieras ytterligare genom acylering eller fosfatidyleringsprocess [34]. Alfa-glukosylerade kolesterol subverts värd immunsvar mot bakterien i en musmodell, genom undertryckande av fagocytos och av T-cellaktivering [35]. Andra roller för kolesterol och kolesterol metaboliter i bakteriemembranet ännu på att utforskas. I denna rapport visar vi att biosyntesen av lipopolysackarid, däribland en Lewis-antigen-expression och LPS-kärna /lipid En modifikation, ändras genom tillgängligheten av kolesterol i tillväxtmediet. Vi presenterar data som indikerar att dessa förändringar i cellväggen avsevärt kan påverka patogen /värd interaktion i en djurmodell för infektion.
Metoder
Bakteriestammar och odlingsbetingelser
stammar av H pylori
inkluderade laboratoriestam ATCC43504 (ursprung: Australien), 26695 (UK), kliniskt isolat G27 (Italien [36], som tillhandahålls av N. Salama), och mus anpassade stammen SS1 (Australien, under förutsättning av Adrian Lee [37]). Bakterier upprätthölls vid 37 ° C i en mikroaerob atmosfär av 5% O 2/10% CO 2 på Campylobacter biodagar (CBA). Bakterier passerades var två till tre dagar, och inte mer än 25 dagar, för att minimera genetisk drift. För tillväxt i kemiskt definierat medium [26], har bakterier inokulerades från CBA in i vävnadsodlingskolvar innehållande Hams F12 (Gibco) med 1 mg /ml bovint serumalbumin (fettsyrafritt, Sigma A7906), som avses genomgående som definierat medium. Vätskekulturer passerades dagligen genom spädning i färskt medium vid initial densiteter av 1-2 x 10 6 /ml och användes vid passage 3 till 5. Cellodlings grade kolesterol (> 99%, Sigma) tillsattes till F12 som en stabil 10 × emulsion innehållande 500 ^ g /ml kolesterol dispergerad i 10 mg /ml albumin, som framställdes i enlighet med [38]. Följande media tillsatser utfördes på liknande sätt: p-sitosterol (syntetisk, 95%), natriumtaurokolat, natriumglykocholat, β-östradiol, progesteron (alla från Sigma), dehydroepiandrosteron (Calbiochem), och β-koprostanol (Matreya) .
Fördubblingstider tider~~POS=HEADCOMP bestämdes under logfastillväxt genom kvantifiering viabla celler med användning av Cell Titer Glo-reagens (Promega) som validerats och beskrivits [39]. Mätning av biomassa som CFU, som cellulärt protein, eller som ATP har alla producerat konsekventa resultat. Ett värde på 1 attomol ATP per cell [40] antogs för rutinmässig passage. Eventuellt var felaktiga detta värde inte i grunden påverkar tolkning av data.
Isogena gen störningar uppnåddes genom insättning av en Campylobacter coli
kloramfenikolresistens element (katt
) enligt den strategi som beskrivs av Chalker et al
[41]. Primrar noggrant utformade så att de riktar in sekvens inom öppna läsramar, och listas i Tabell 1. Fusion PCR-reaktioner med användning av PCR-Extender System (5Prime) innehöll 2,3 nM varje gel-renat mall, 50 pM primer, 1 × tuning buffert, 1,25 mM ytterligare Mg ++, 0,2 mM vardera dNTP och 0,01 U /ul-polymeras. Fusionscykelförhållanden var som följer: 94 ° C 2,5 min, 10 cykler [94 ° C 15 sek, 45 ° C 60 sek, 68 ° C 60 sek per kb], 25 cykler [94 ° C 15 sek, primer specifik Tm 30 sek, 68 ° C 60 sek per kb], slutlig förlängning 68 ° C 6-8 min. Fusionsprodukter återamplifierades med Pfx50 (Invitrogen) för att öka kvantiteten, renades därefter med användning av Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Mottagande stammar odlades en dag på CBA transformerades med 500 ng av den slutliga amplikonen genom att använda naturlig transformation [42, 43] följt av selektion i 7-10 dagar på CBA innehållande 15 pg /ml kloramfenikol. Att säkerställa allelisk ersättning ades de resulterande stammarna utvärderades genom PCR av det genomiska DNA med användning GoTaq (Promega) med primrar som anges i tabell 1. PCR-strategi och resultaten visas i Figur 1.Table 1 Primersekvenser.
primers för allelisk störningar
en
CAT FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
LPXe fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
ytterligare primrar för bekräftelse av genavbrott
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective gen nummer i offentliga databaser för 26695 och G27 är följande: [cgt: hp0421, G27_952
], [pmi
(rfbM
): hp0043, G27_38
], [LPXe: hp0021, G27_20
], [EPTA. hp0022, G27_21
]
bRighthand kolumnen listar de korta primer beteckningar som används i Figur 1.
Figur 1 PCR kontroll av alleliska störningar i H. pylori stam G27. Genomisk DNA bereddes från gen-stört G27 stammar följande tre passager under kloramfenikol val, då PCR-amplifieras som visas i varje system. Primers sekvenser ges i tabell 1. A. Störningar av cgt. Fem exempel visas av sju individuella kloner, av vilka alla gav identiska resultat i skärmen. B. Störningar av PMI (rfbM). Hela kloramfenikol-resistent befolkningen passerades i varje omgång av urval, utan klonurvalet. C. Störningar av LPXe och EPTA. Hela kloramfenikol-resistent befolkningen passerades i varje omgång av urval, utan klonurvalet.
Gastric kolonisering
Djurförsök godkändes av LSUHSCS Institutional Animal Care och användning kommittén. Kvinnliga mongoliska gerbiler hölls på vanlig diet efter behag
. Att bevara motilitet, var H. pylori-
stam SS1 odlas över natten under mikroaerob betingelser i T75-kolvar innehållande 40 ml av F12-medium med 0,4 mg /ml albumin och 0 eller 50 pg /ml kolesterol. De motila planktonbakterier skördades genom centrifugering och återsuspenderades i isotonisk saltlösning. Kolonibildande enheter (CFU) mättes i dessa inokula genom seriespädning och utstrykning på CBA, och dessa mätningar bekräftade lika dosering av livsdugliga bakterier mellan de båda odlingsbetingelser. Cirka 10 8 CFU per 30 ul gavs oralt till djur (n = 6-9 per grupp). Djuren avlivades 11 dagar senare, och magarna avlägsnades och dissekerades. H. pylori
närvarande i gastriska antrum homogenat kvantifierades genom seriespädning och utstrykning på CBA innehållande 5-fluorcytosin (5

• Nyttan av cytokeratiner 7 och 20 (CK7 /20) immunohistokemi i skillnaden av korta etapper Barrett esofagus från gastric intestinal metaplasi: Är det pålitlig
• Tillsats av en pH-känslig gel förbättrar mikroemulsionsstabilitet för målinriktad avlägsnande av kolon ammonia