modificación Helicobacter pylori lipopolisacárido, la expresión del antígeno Lewis, y la colonización gástrica son el colesterol-dependent

Helicobacter pylori
modificación lipopolisacárido, la expresión del antígeno Lewis, y la colonización gástrica son colesterol dependen
Resumen Antecedentes

Helicobacter pylori
asumen expresamente el colesterol y lo incorpora en la membrana bacteriana, sin embargo, poco se sabe actualmente sobre las funciones fisiológicas del colesterol. Se compararon los fenotipos y vivo
capacidad de colonización de H. pylori en
crecido en un definido, medio de crecimiento libre de suero, F12 con 1 mg /ml de albúmina que contiene 0-50 mg de colesterol /ml
. Resultados
Si bien los tiempos de duplicación no se vieron afectados por el colesterol, no se observaron otros cambios fenotípicos manifiestos. H. pylori SS1
cepa crecido en medio definido con el colesterol colonizado con éxito el estómago de los jerbos, mientras SS1 cultiva sin colesterol no pudo colonizar. H. pylori
lipopolisacárido menudo muestra Lewis X y /o Y antígenos. La expresión de estos antígenos medidos por ELISA de células enteras fue notablemente mayor en respuesta al crecimiento de la cepa SS1, 26695, o G27 en colesterol. Además, el análisis electroforético de lipopolisacárido en G27 tipo salvaje y en los mutantes que carecen de la cadena O reveló cambios estructurales dentro de los restos de oligosacáridos de núcleo /lípido A. Estas respuestas en los niveles de antígeno Lewis y en los perfiles de lipopolisacárido a la disponibilidad de colesterol eran muy específica, ya que no hay cambios tuvieron lugar cuando el colesterol se sustituyó por sales de beta-sitosterol o biliares. La alteración de los genes que codifican el colesterol α-glucosiltransferasa o lípido A transferasa fosfoetanolamina no tuvo ningún efecto sobre la expresión de Lewis, ni en los perfiles de lipopolisacárido, ni sobre la capacidad de respuesta de colesterol de estas propiedades. La interrupción del gen de lípido A 1-fosfatasa eliminó el efecto del colesterol en los perfiles de lipopolisacáridos pero no su efecto sobre la expresión Lewis.
Conclusiones
conjunto, estos resultados sugieren que el agotamiento de colesterol conduce a formas aberrantes de LPS que dependen de la desfosforilación del lípido a en la posición 1. Un modelo provisional para los efectos observados de colesterol se discute en el que los pasos secuenciales de la biogénesis de lipopolisacárido y, de forma independiente, la presentación de antígeno de Lewis en la superficie celular, dependen de la composición de la membrana. Estos nuevos descubrimientos demuestran que la disponibilidad de colesterol permite que H. pylori
modificar su envoltura celular de las maneras que pueden afectar la colonización del tejido huésped in vivo
.
Antecedentes
Helicobacter pylori
es un nicho altamente -Adaptado patógeno que habita en el estómago humano, se transmite principalmente dentro de las familias, y no ha conocido reservorio ambiental. Las infecciones crónicas pueden ser asintomática o causar gastritis, úlcera o cáncer gástrico. Para establecer la infección, la bacteria debe sobrevivir el tránsito a través del compartimiento gástrico ácido [1]. Penetra y establece su residencia en la capa mucosa protectora, un entorno de lípidos y rica en colesterol [2, 3]. Dentro de este nicho de la bacteria emplea una variedad de mecanismos para evadir la respuesta inmune del huésped.
Lipopolisacáridos (LPS) en la superficie de H. pylori
se modifican para mostrar ciertos antígenos de grupos sanguíneos humanos, principalmente Lewis antígenos X e Y [ ,,,0],4-7], y con menor frecuencia H tipo 1, i-antígeno, grupo sanguíneo A, o Lewis antígenos A o B [8-10]. Estos antígenos LPS superficie son necesarios para el establecimiento de la infección, ya que las cepas mutantes defectuosos para la síntesis de LPS O-antígeno o para la expresión Lewis X /Y no pueden colonizar ratones [11-13]. Hay pruebas de que Lewis antígenos expresados ​​en la superficie bacteriana contribuir a la adherencia de H. pylori a las células gástricas
epiteliales [10, 14], y juegan un papel en el tropismo tisular [15-17]. células epiteliales gástricas también expresan antígenos de Lewis [18, 19], lo que sugiere que la pantalla de Lewis antígenos en la superficie bacteriana puede servir como una estrategia de mimetismo. Los estudios de aislados clínicos [18, 20] y las infecciones experimentales en animales [21] son ​​compatibles con esta función para bacteriana Lewis antígenos en la evasión inmune. En la infección humana, H. pylori
antígenos de Lewis se han relacionado con la gravedad de la úlcera péptica y duodenitis [16, 22]. Otra característica importante de H. pylori
LPS es su modificado lípido A estructura, con acilación reducida y un menor número de grupos cargados que es típico de las enterobacterias [23]. Estas modificaciones lípido A minimizar endotóxico e inflamatorias propiedades de H. pylori
LPS (revisado en [24]).
El colesterol es un nutriente no esencial para H pylori
, a pesar de que promueve el crecimiento en medio libre de suero [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
incorporar específicamente el colesterol en la membrana bacteriana [27], al igual que un número limitado de bacterias patógenas y comensales incluyendo Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
., Y Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. El colesterol puede fortalecer la membrana en estos organismos [30-32]. H. pylori
también forma únicamente de colesterol α-glucósido [33, 34], y este metabolito se puede modificar adicionalmente por acilación o fosfatidilación [34]. colesterol Alpha-glucosilada subvierte anfitrión de respuesta inmune a la bacteria en un modelo de ratón, a través de la supresión de la fagocitosis y de la activación de células T [35]. Otros papeles para metabolitos de colesterol y de colesterol en la membrana bacteriana aún no se han explorado. En este informe, se demuestra que la biosíntesis de lipopolisacárido, incluyendo la expresión del antígeno Lewis y núcleo de LPS /Una modificación de lípidos, se alteran por la disponibilidad de colesterol en el medio de crecimiento. Se presentan los datos que indican que estos cambios en la dotación de células pueden influir significativamente en la interacción patógeno /huésped en un modelo animal de la infección.
Métodos
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
cepas de H. pylori
incluidos el ATCC43504 cepa de laboratorio (origen: Australia), 26695 (Reino Unido), G27 aislado clínico (Italia [36], proporcionado por N. Salama), y el ratón adaptado cepa SS1 (Australia; proporcionado por Adrian Lee [37]). Las bacterias se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera microaeróbica de 5% O 2/10% de CO 2 en agar sangre Campylobacter (CBA). Las bacterias se pasaron cada 2 a 3 días, y durante no más de 25 días, para minimizar la deriva genética. Para el crecimiento en un medio químicamente definido [26], las bacterias se inocularon de CBA en matraces de cultivo de tejidos que contienen F12 de Ham (Gibco) con 1 mg /ml de seroalbúmina bovina (libre de ácidos grasos, Sigma A7906), se hace referencia a lo largo de como medio definido. Los cultivos líquidos se pasaron a diario por dilución en medio fresco a densidades iniciales de 1-2 x 10 6 /ml, y se utiliza en el paso 3 a 5. Cell colesterol de grado de cultivo (> 99%, Sigma) se añadió a F12 como 10 × emulsión estable que contiene 500 mg /ml de colesterol dispersado en 10 mg de albúmina /ml, que se preparó de acuerdo con [38]. Los siguientes adiciones de medios de comunicación se llevaron a cabo de la misma manera: ß-sitosterol (sintético, 95%), taurocolato de sodio, glicocolato de sodio, β-estradiol, progesterona (todos de Sigma), dehidroepiandrosterona (Calbiochem), y β-coprostanol (Matreya) . se determinaron los tiempos de duplicación
durante el crecimiento de fase log cuantificando las células viables usando la célula reactivo Titer Glo (Promega) como validado y descrito [39]. Medición de la biomasa como CFU, como la proteína celular, o como ATP todos han producido resultados consistentes. Un valor de 1 attomol ATP por célula [40] Se supuso para el paso de rutina. Posible inexactitud de este valor no influye fundamentalmente interpretación de los datos.
Interrupciones de genes isogénicos se lograron mediante la inserción de un Campylobacter coli
elemento de resistencia a cloranfenicol (cat
) de acuerdo con la estrategia descrita por Chalker et al
[41]. Los cebadores se diseñaron con cuidado para la secuencia diana dentro de marcos de lectura abierta, y se enumeran en la Tabla 1. Las reacciones PCR de fusión utilizando el sistema Extender PCR (5Prime) contenía 2,3 nM cada plantilla se purificó en gel, 50 M de cebador, 1 x tampón de sintonización, 1,25 mM Mg adicional ++, 0,2 mM de cada dNTP, y 0,01 U /l polimerasa. las condiciones del ciclo de fusión fueron como sigue: 94 ° C 2,5 min, 10 ciclos de [94 ° C 15 seg, 45 ° C 60 seg, 68 ° C 60 segundos por kb], 25 ciclos [94 ° C 15 seg,-cebador específico Tm 30 seg, 68ºC 60 segundos por kb], extensión final a 68 ° C 6-8 min. productos de fusión se reamplificaron con Pfx50 (Invitrogen) para aumentar la cantidad, después se purificó usando el kit de purificación Qiaquick PCR (Qiagen). cepas receptoras cultivan 1 día en CBA se transformaron con 500 ng del amplicón final usando transformación natural [42, 43] seguido de la selección durante 7-10 días en CBA que contienen 15 mg /ml de cloranfenicol. Para garantizar la sustitución alélica, las cepas resultantes fueron evaluados por PCR del ADN genómico usando GoTaq (Promega) con los cebadores especificados en la Tabla 1. Estrategia de PCR y los resultados se muestran en la Figura 1.Table secuencias 1 Primer.
cebadores para la interrupción alélica
un
CAT fwd [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5B
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
cebadores adicionales para la confirmación de la alteración del gen
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective número de genes en las bases de datos públicas para 26695 y G27 son los siguientes: [CGT: hp0421, G27_952
], [PMI gratis (rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [epta:. hp0022, G27_21
]
columna bRighthand enumera las denominaciones breves de cebadores utilizados en la Figura 1. Figura 1
PCR verificación de interrupciones alélicas en H. pylori cepa G27. Se preparó ADN genómico a partir de cepas de gen fragmentado G27 siguientes tres pasajes en virtud de selección de cloranfenicol, a continuación, amplificado por PCR como se muestra en cada régimen. secuencias de cebadores se dan en la Tabla 1. A. La alteración de tbc. Cinco ejemplos se muestran de los siete clones individuales, todos los cuales dieron resultados idénticos en la pantalla. B. La alteración de PMI (rfbM). Toda la población resistente a cloranfenicol se pasó en cada ronda de selección, sin selección clonal. C. La alteración de lpxE y PAAT. Toda la población resistente al cloranfenicol se pasó en cada ronda de selección, sin selección clonal.
la colonización gástrica
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo LSUHSCS Institucional. jerbos de Mongolia hembras se mantuvieron en la dieta ordinaria ad libitum
. Para preservar la motilidad, H. pylori SS1
cepa se cultivó durante la noche bajo condiciones microaeróbicas en matraces T75 que contenían 40 ml de medio F12 con 0,4 mg /ml de albúmina y 0 ó 50 mg de colesterol /ml. Las bacterias planctónicas móviles se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en solución salina isotónica. unidades formadoras de colonias (CFU) se midieron en estos inóculos por dilución en serie y en placas sobre CBA, y estas mediciones confirmaron igual dosis de bacterias viables entre las dos condiciones de crecimiento. Aproximadamente 10 8 UFC por 30 l se les dio a los animales por vía oral (n = 6 a 9 por grupo). Los animales se sacrificaron 11 días más tarde, y los estómagos se retiraron y se diseccionaron. H. pylori
presente en los homogeneizados de antro gástrico se cuantificaron mediante dilución en serie y en placas sobre CBA que contiene 5-fluorocitosina (5 g /ml), vancomicina (10 mg /ml), anfotericina B (5 g /ml), bacitracina ( 30 g /ml), polimixina B (10 U /ml), y trimetoprima (10 g /ml) [44]. Duplicados se hicieron determinaciones de CFU para múltiples diluciones de cada muestra de tejido.
-ELISA de células enteras
procedimientos estándar [6, 7, 45], se han adaptado para el uso de peroxidasa de anticuerpo secundario conjugado. Todos los anticuerpos se obtuvieron de Calbiochem. cultivos de una noche de bacterias se recogieron por centrifugación a 3500 × g
durante 10-15 min, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, y a sedimentar a 10.000 × g
durante 2 min, después se resuspendieron en 15% de glicerol /0,9% NaCl. Las suspensiones celulares se analizaron para el contenido de proteína y se almacenaron a -20 ° C. Las muestras de células que contienen cantidades conocidas de proteína se diluyeron rápidamente en bicarbonato de sodio 50 mM /pH carbonato de 9,55 y se dispensan inmediatamente en los pocillos de una placa de ELISA (Costar΅7). Las placas se sellaron y se refrigera durante la noche, a continuación se bloquearon durante 90 min en 3% de albúmina de suero bovino disuelta en el tampón de lavado que constaba de pH de fosfato de sodio 0,1 M 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% w /v de Tween-20. El anticuerpo primario, monoclonal anti-Lewis X (Signet clon P12) o anti-Lewis Y (Signet clon F3), se diluyó 1: 500 en tampón de lavado /1% de BSA, se añadió durante 2 horas, seguido de cuatro cambios de tampón de lavado. Se añadió la dilución 2500 de peroxidasa de rábano conjugada de cabra anti-IgM de ratón en tampón de lavado /1% BSA, durante 90 minutos, seguido por cuatro cambios de tampón de lavado: El anticuerpo secundario, un 1. El sustrato cromogénico tetrametilbencidina era 0,42 mM y 0,02% H 2O 2 en 50 mM de acetato /citrato de pH 5,5 [46]. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, la reacción se detuvo con 1 /quinta vol 2,5 N H 2SO 4, y el cambio de color se midió en un lector de placas a 450 nm. En los controles negativos omitiendo el anticuerpo primario o secundario, o con E. coli cepa HB101
sustituido por H. pylori
, cambio de color fue insignificante (A < 0,05). Los niveles de Lewis Y fueron insignificantes (A < 0,1) en la cepa 26695 o 43504, al igual que los niveles de Lewis X en SS1 analiza
electroforético de lipopolisacáridos
H. pylori se recogieron
cultivos como se describió anteriormente, y se lavan. sedimentos celulares se almacenaron a -70 ° C. Las células fueron lisadas en 60 mM Tris HCl pH 6,8 que contiene 2% de SDS a 95-98 ° C durante 10 min. El contenido de proteína se midió utilizando el ensayo de ácido bicinconínico (Pierce). Las muestras de lisados ​​de células se ajustaron a contenido de proteínas igual (1 mg /ml), a continuación, proteolizadas en reacciones que contienen (final) 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,67% SDS, y 0,67 mg /ml de proteinasa K a 60 ° C durante 2 horas [47]. Para eliminar los artefactos electroforéticos debido a la presencia de complejos de lípido /detergente, las muestras proteolizadas se extrajeron con fenol caliente [48]. Los experimentos de control verificaron que todas las bandas de LPS fueron recuperados a través del siguiente procedimiento de extracción cualitativa y sin prejuicios. muestras proteolizada se mezclaron con 1 volumen de fenol acuoso al 90% y se incubaron a 70 ° C durante 20 min. Después de enfriar a 10 ° C durante 1 min, las muestras se centrifugaron a 12.000 × g
durante 20 min a 10 ° C, y recogió la fase acuosa. Las fases fenólicos fueron re-extrajeron con 1 volumen de H 2O a 70 ° C durante 10 min, y la centrifugación repetida. Los extractos acuosos combinados se ajustaron a 0,5 M NaCl y se precipitaron con etanol 10 vol en el refrigerador durante la noche, después se centrifugó a 20.000 × g
durante 20 min a 10 ° C y se secó al aire. muestras de LPS purificado se redisolvieron en tampón de muestra Laemmli [49] a 95 ° C durante 5 min. Las muestras se aplicaron a 15% de poliacrilamida /0,9% bis minigeles que contenían 3,2 M de urea con la formulación Laemmli discontinua buffer [49], y un gel de apilamiento 5%. Después de la electroforesis a 150 V durante 75 minutos, los geles se fijaron durante la noche ya sea para la tinción de plata [50] o transferidos a difluoruro de polivinilideno membrana utilizando tampón de transferencia Tris /glicina [51]. Las transferencias se bloquearon durante la noche en 3% de albúmina de suero bovino y 0,03% NaN 3 en el tampón de lavado descrito anteriormente para el ELISA. El anticuerpo primario (anti-Lewis X o anti-Lewis Y, 1: 200) y el anticuerpo secundario (de cabra conjugado con peroxidasa anti-IgM de ratón, 1: 1000) se diluyeron en tampón de lavado que contiene 0,5% de BSA. detección colorimétrica utiliza 3,3'-diaminobencidina con la mejora de cobalto [52]. La densitometría se realizó con la aplicación de dominio público la imagen J, disponible en http:.... //Rsb información NIH gov /ij
Resultados
Poco se sabe acerca de las funciones fisiológicas de colesterol en H .
pylori. Para investigar las respuestas de H. pylori
a colesterol, adoptamos una, medio de cultivo definido libre de suero, F12 con 1 mg /ml de albúmina, en la que esta bacteria puede ser pasado de forma estable [26]. Este modesto concentración de albúmina aumenta el crecimiento [25, 26] y alivia la adherencia ajustado a las superficies de cultivo que se produce en medio libre de proteína [53]. En este medio definido, la adición de colesterol /ml 50 mg no alteró significativamente la tasa de crecimiento (Figura 2). La ausencia de efectos de crecimiento en las condiciones de cultivo elegidas era ventajosa para la investigación de la importancia fisiológica de colesterol en H. pylori
. Por lo tanto, hemos sido capaces de comparar la colonización gástrica de jerbos por la cepa SS1 que habían sido cultivadas en el medio definido que contiene diversas cantidades de colesterol (Figura 3). Once días después de la inoculación oral, H. pylori Hoteles en antro gástrico se sembraron y se cuantificó de forma selectiva. Sorprendentemente, los jerbos se colonizaron sólo por los cultivos desarrollados en un medio que contiene colesterol, pero no por H. pylori
crecido en medio libre de colesterol (En cada experimento, P < 0,0001 para la comparación de log (CFU /g) entre los grupos utilizando la prueba t de Student de dos colas). Por lo tanto, el colesterol es un componente esencial del medio de crecimiento a fin de establecer H. pylori
infección en este modelo animal. Figura 2 La adición de colesterol al medio definido no afecta a la tasa de crecimiento H. pylori. cultivos paralelos de cada cepa se cultivaron durante la noche en F12 /albúmina (1 mg /ml) en ausencia (barras blancas) o presencia (sombreado bares) de 50 mg de colesterol /ml. La densidad de población inicial fue de 2 x 106 /ml. tiempos de duplicación se calcularon a partir del aumento medido en la biomasa. Los valores mostrados representan la media ± desviación estándar de cinco o más mediciones independientes. n
. s
. prueba t de dos colas de Student para datos por pares no mostró significación estadística.
Figura 3 H. pylori cultiva sin colesterol dejar de colonizar los jerbos. H. pylori SS1
cepa se cultivó durante la noche en medio definido que contiene 0 ó 50 mg de colesterol /ml. Jerbos fueron inoculados por vía oral con 3,5 x 108 UFC (experimento A) o 1 × 108 UFC (experimento B). H. pylori Hoteles en antro gástrico se cuantificó a los 11 días. Cada barra vertical representa la media de determinaciones por duplicado de un animal, y las líneas horizontales dan la mediana para cada grupo de tratamiento. Donde no se recuperaron colonias, los valores se registraron como 5 × 102 UFC /g de tejido, el límite de detección estimado.
Ciertas cepas de H. pylori
exhibió diferencias significativas en la adhesión a recipientes de cultivo siguientes pasaje de colesterol, lo que sugiere alteraciones en sus propiedades de la superficie celular (Hildebrandt & McGee, observaciones no publicadas). Por esta razón, se decidió investigar los lipopolisacáridos, que constituyen el principal componente de la envoltura celular, y servir para presentar los antígenos de Lewis biológicamente importantes. Empleamos un procedimiento de ELISA de células enteras bien establecido para cuantificar los antígenos predominantes de Lewis, Lewis X e Y (Figura 4). De acuerdo con la literatura [54, 55], principalmente Lewis X se detectó en la cepa 26695, solamente Lewis Y se detectó en SS1, y se detectaron niveles significativos de tanto en G27. En cada caso, las lecturas de absorbancia fueron no lineal con respecto a la muestra de carga, un hecho que no es inusual en los ensayos de ELISA [56], y que ha sido observado por otros investigadores que utilizan estos mismos anticuerpos monoclonales [7]. Por lo tanto, con el fin de comparar los niveles de antígeno en muestras de H. pylori
cultivaron en ausencia o presencia de colesterol, se realizó titulaciones paralelas sobre una gama de cargas de muestra que varían de 20 a 500 ng de proteína de la célula por pocillo. Estas titulaciones reproducible mostraron un marcado aumento en la cantidad de Lewis X y /o el antígeno Lewis Y detectada en la superficie celular cuando H. pylori
cepas 26695, SS1 o G27 se cultivaron en la presencia de colesterol (Figura 4). En experimentos independientes en paralelo, los aumentos medios de colesterol dependiente fueron estadísticamente significativas (Tabla 2). También se han obtenido resultados comparables para Lewis X en la cepa 43504 (datos no mostrados). El clavar muestras con colesterol al final del periodo de crecimiento no alteró la cantidad de antígeno Lewis detectado por ELISA (Figura 5A). En otro experimento de control se verificó para los cuatro de estas cepas que la cantidad de proteína de la célula unido a los pozos no se vio afectada por el crecimiento de colesterol (Figura 5B). El ELISA resultados así establecido que el aumento de la expresión de superficie de antígenos de Lewis era una respuesta biológica legítimo al colesterol que se produjo en todas las cepas probadas. Esta respuesta fue específica para el colesterol, ya que la sustitución de colesterol en el medio de crecimiento con los análogos estructurales de beta-sitosterol o sodio taurocolato no tuvo efecto sobre Lewis X o Y por expresión G27 (Figura 4, paneles derecha, y en la Tabla 3). La respuesta antígeno Lewis al colesterol todavía se mantuvo después de la interrupción del gen para el colesterol α-glucosiltransferasa (tbc
) en G27 cepa (Tabla 2, y ver a continuación) y en 26695 (datos no mostrados), descartando la participación de α metabolitos -glycoside de cholesterol.Table 2 aumento de la superficie de la célula expresión del antígeno Lewis por el crecimiento de los cultivos en presencia de cholesterol.a

veces de incremento en comparación con el cultivo libre de colesterol en paralelo

Lewis X
Lewis Y

media ± SEM (n)
valor de p
media ± SEM (n)
P valor
26695
4,32 ± 0,36 (6): perfil del 0,0002
no
hecho
SS1 no
hecho
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 tipo salvaje
2.85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 CGT :: cat
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5): perfil del 0,0034
G27 lpxE :: cat
2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± (7) 0,43
0,014

un antígenos de Lewis se cuantificaron en la replicación de células enteras análisis de ELISA de muestras pareadas cultivadas en presencia o ausencia de 50 mg de colesterol /ml. La carga antigénica de 300 ng de proteína celular por pocillo. Proporción para más: el colesterol, menos se calcularon a partir de las lecturas de absorbencia neta duplicados en cada ensayo, y las proporciones determinadas de cinco a ocho carreras ELISA independientes fueron en promedio. Los valores de p se calcularon en dos colas pruebas t de Student para la hipótesis nula de que la razón es igual a 1. superficie celular sobre Table 3 mejorado la expresión del antígeno Lewis es el colesterol específico

veces de incremento en comparación con el cultivo libre de colesterol en paralelo

Lewis X
Lewis Y


media ± SEM (n)
valor de p
media ± SEM (n)
P valor
colesterol
2,96 ± 0,22 (5): perfil del 0,0008
2,48 ± 0,10 (4) .0007

β- sitosterol
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3): perfil del 0,28
taurocolato
0,64 ± 0,16 (4)
0,12 0,84
± 0,20 (3)
0.52
antígenos de Lewis se cuantificaron en la replicación de células enteras ELISA análisis de las culturas por pares de H. pylori G27
cultivadas en presencia o ausencia de 130 colesterol mu M, o un igual concentración de β-sitosterol o taurocolato de sodio. La carga antigénica de 300 ng de proteína celular por pocillo. Proporción para más: el colesterol, menos se calcularon a partir de las lecturas de absorbencia neta duplicados en cada ensayo, y las proporciones determinadas de tres a cinco carreras ELISA independientes fueron en promedio. Los valores de p se calcularon en pruebas t de Student de dos colas para la hipótesis nula de que la razón es igual a 1.
Figura 4 Crecimiento en el colesterol aumenta específicamente presentación en la superficie celular de los antígenos de Lewis. Los ensayos de ELISA de células enteras se realizaron en muestras de H. pylori cepa 26695
(superior izquierda), SS1 (inferior izquierda), o G27 (superior e inferior derecha). cultivos paralelos se cultivaron durante la noche en medio definido que contiene 130 mM de las siguientes adiciones: círculos, sin adición; plazas, colesterol; triángulos, β-sitosterol; X, taurocolato. Se aplicaron cantidades variables de suspensión de células que corresponden a cantidades conocidas de proteína celular a pocillos duplicados de placas de ELISA, y immunoassayed la presencia de Lewis X o antígeno Lewis Y tal como se describe en Métodos
. muestras de control negativas de E. coli HB101
, o tampón de sólo espacios en blanco, cayeron en la línea punteada. Las lecturas de absorbancia de los pocillos individuales se representan gráficamente. Repetir los experimentos con tres o más independientemente crecido culturas han dado resultados esencialmente idénticos.
Figura 5 experimentos de control de ELISA. A. El clavar con colesterol al final del periodo de crecimiento no altera la expresión del antígeno Lewis. Los cultivos de H. pylori
se cultivaron durante la noche en medio definido sin (control) o con 50 mg /ml de colesterol (colesterol crecido). Una tercera matraz (colesterol enriquecida) se cultivó en ausencia de colesterol, se enfrió en hielo, y se añadió una cantidad equivalente de colesterol antes de que se recogieron las células. antígenos de Lewis se cuantificaron por duplicado mediante ELISA de células enteras, la carga de proteína celular 300 ng por pocillo. Proporción para más: el colesterol, menos se calcularon a partir de las lecturas de absorbancia neto medio en cada ensayo, y la trama se muestra significan proporciones ± SEM de tres a cinco ejecuta independientemente de ELISA. Los valores de p se calcularon en pruebas t de Student de dos colas para la hipótesis nula de que la razón es igual a 1. Para las comparaciones marcadas ns, P > 0.05. B. unión de las células a placas de ELISA equivalente. Las muestras de H. pylori
que se cultivaron en cultivos paralelos en ausencia (barras blancas) o en presencia de 50 mg /ml de colesterol (barras grises) se aplicaron a placas de múltiples pocillos en la misma manera que para los ensayos de Lewis antígeno ELISA, añadiendo 500 ng de proteína celular por pocillo. Después de la unión durante la noche, los pocillos se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, a continuación, la proteína en las células adherentes se cuantificó utilizando el reactivo BCA. Se muestran los valores medios ± DE de pocillos por cuadruplicado.
Detección de Lewis X e Y por inmunotransferencia con los mismos anticuerpos monoclonales producidos resultado diferente (Figura 6). En varios intentos utilizando esta técnica, que no detectó ninguna diferencia de colesterol dependiente en los niveles de Lewis X o Y, aparte de un pequeño aumento de Lewis X en 43504 que fue sólo marginalmente significativa. El procedimiento de borrones de emplear muestras de LPS extraídos de lisados ​​de células, y, en principio, debería detectar toda la piscina celular antígeno Lewis, mientras que el método ELISA de células enteras está diseñado para detectar solamente que presenta en la superficie extracelular. La diferencia interesante en los resultados entre nuestros análisis e inmunotransferencias ELISA sugiere un cambio de compartimentación celular del antígeno Lewis dependiendo de la disponibilidad de colesterol en el medio de crecimiento. Figura 6 Lewis X e Y antígeno de perfiles por inmunotransferencia. Las muestras de LPS aislado de cultivos paralelos cultivadas en ausencia (-) o presencia (+) de 50 mg de colesterol /ml se resolvieron en 15% en geles de urea. Cantidades cargadas por carril, como g de proteína lisado inicial, se dan en la parte superior de cada carril. Después de la transferencia, los antígenos se immunodetected con anticuerpos monoclonales específicos para Lewis X (panel superior) o Lewis Y (panel inferior). Se muestra un ejemplo representativo de cada uno. carriles laterales contienen marcadores de proteínas precoloreados (M) o 400 ng de E. coli O111
: LPS B4. señal antigénica apareció sólo en las regiones de cadena O de estas cepas de H. pylori
; áreas en blanco han sido recortados en consecuencia. Las inmunotransferencias se replican de forma independiente con varios conjuntos de la muestra, y densitometría se utilizó para cuantificar la señal de antígeno en cada carril. Las relaciones para parejas más muestras de colesterol: menos se calcularon, y las relaciones medias ± SEM (n) para transferencias se dan en azul. La hipótesis nula de que la razón es igual a 1 se evaluó en una prueba t de Student de dos colas.
Además de la medición del antígeno Lewis, se comparó directamente los perfiles de lipopolisacárido entre cultivos paralelos cultivadas en la presencia o ausencia de colesterol, utilizando gel electroforesis y tinción con plata. En todos los H. pylori
cepas que hemos examinado, los perfiles de la banda de LPS fueron idénticas entre cultivos desarrollados en medio definido con el colesterol a la obtenida en medio que contiene suero o en agar sangre (datos no mostrados), y como se esperaba [5 , 24, 55, 57] estos perfiles fueron altamente cepa específica.

• La utilidad de citoqueratinas 7 y 20 (/20 CK7) inmunohistoquímica en la distinción de corto segmento de esófago de Barrett de metaplasia intestinal gástrica: ¿Es fiable
• La adición de un gel sensible al pH mejora la estabilidad de la microemulsión para la eliminación selectiva de ammonia