Helicobacter pylori lipopolisaharid modifikacija, Lewis antigen izražanja in želodca kolonizacija so holesterol odvisni

Helicobacter pylori
lipopolisaharid sprememba, Lewis antigen izraz in želodca kolonizacija so holesterola odvisni
Abstract
Ozadje še
Helicobacter pylori
posebej zavzema holesterola in ga vključuje v bakterijske membrane, malo je trenutno je znano fiziološke vloge holesterola je. Primerjali smo fenotipe in vivo
kolonizacije sposobnost H. pylori
gojijo v določenem, rast srednje seruma, F12 z 1 mg /ml albumin, ki vsebuje 0 do 50 ug /ml holesterola.
Rezultatov
Medtem ko so bili podvojitev krat v veliki meri vpliva holesterola, so opazili druge očitne fenotipske spremembe. H. pylori
sev SS1 zrasla v določenem mediju s holesterolom uspešno kolonizirali želodec od peščene podgane, ker SS1 pridelujejo brez holesterola ni uspelo kolonizirati. H. pylori
lipopolisaharid pogosto prikazuje Lewis X in /ali Y antigene. Izražanje teh antigenov, merjeno po celih celic ELISA je bil precej izboljšan odziv na rast seva SS1, 26695, ali G27 holesterola. Poleg tega elektroforetsko analizo lipopolisaharid v vrsti G27 divji in v mutant primanjkuje O-verigo razkrila strukturne spremembe znotraj delov v A oligosaharidov core /lipidov. Ti odzivi na ravni Lewis antigenov in v lipopolisaharid profili dostopnosti holesterola so bili zelo specifična, ker ni bilo sprememb je prišlo, ko je bil holesterol substituirana z beta-sitosterol ali žolčnih soli. Motnje genov, ki kodirajo holesterol a-glukoziltransferaze ali lipidni A phosphoethanolamine transferazo imela nobenega učinka na Lewis izražanja niti na lipopolisaharid profilov, niti o odzivnosti holesterola teh lastnosti. Motnja lipidov gen A1-fosfataza izločen vpliv holesterola na lipopolisaharid profilov, vendar ne učinkuje na Lewis izražanja.
Sklepi
Vsi ti rezultati kažejo, da izčrpavanje holesterola vodi do odklonska oblike LPS, ki so odvisne od fosforilacijo lipida A na 1-položaju. Poskusni model opaženih učinkov holesterola je opisano v kateri zaporedni koraki lipopolisaharid BIOGENESIS ter neodvisno predstavitev antigena Lewis na celični površini, odvisni sestavo membrane. Nove ugotovitve kažejo, da je razpoložljivost holesterola omogoča H. pylori
spremeniti svojo celično ovojnico na načine, ki lahko vplivajo na naselitev gostiteljice tkiva in vivo
.
Ozadje
Helicobacter pylori
je zelo nišo -adapted patogen, ki naseljuje človeka želodec, se prenaša predvsem v družinah, in ni znano nobeno okolje rezervoar. Kronične okužbe je lahko asimptomatska ali povzročijo gastritis, razjede ali raka na želodcu. Ugotoviti okužbo, mora bakterija preživi prehod skozi kislem želodčnem predelu [1]. Prodre in vzpostavlja prebivališče v zaščitne sluzi plast, lipide in holesterola bogato okolje [2, 3]. V tej niši bakterija zaposluje različne mehanizme izogibanja predpisom gostitelja imunskega odziva.
Lipopolisaharidi (LPS) na površini H. pylori
so prirejeni za prikaz nekaterih antigenov človekove krvno skupino, predvsem Lewis antigeni X in Y [ ,,,0],07/04], manj pogosto H tipa 1, i-antigen, krvna skupina A, ali Lewis antigenov A ali B [8-10]. Te antigene površina LPS so potrebni za vzpostavitev okužbe, saj mutirane seve pomanjkljivi za sintezo LPS O-antigen ali Lewis X /Y izražanja ne naselijo miši [11-13]. Obstajajo dokazi, da antigeni Lewis, izraženo na bakterijski površini prispevajo k spoštovanju H. pylori
do epitelijskih celic želodca [10, 14], in igrajo vlogo pri tkiva tropizma [15-17]. Želodčne epitelne celice izražajo tudi Lewis antigene [18, 19], kar kaže, da je prikaz Lewis antigenov na bakterijski površini lahko služijo kot strategijo mimikrijo. Študije kliničnih izolatov [18, 20] in eksperimentalnih okužbah pri živalih [21], podpirajo to vlogo za bakterijsko Lewis antigenov v imunskem utaj. V človeški okužbi, so H. pylori
Lewis antigene povezane z resnostjo peptične razjede in duodenitis [16, 22]. Druga pomembna značilnost H. pylori
LPS je njena spremenjena lipid A struktura, z zmanjšano aciliranja in manj nabitimi skupinami, kot je značilno za enterobakterij [23]. Te spremembe lipid A zmanjša endotoksični in vnetnih lastnosti H. pylori
LPS (preverjal [24]).
Holesterol je nebistvene hranilo za H pylori
, čeprav spodbuja rast mediju brez seruma [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
posebej vključiti holesterola v bakterijske membrane [27], kot tudi omejeno število patogenih in komenzalnih bakterij, vključno Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
., In Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Holesterol lahko okrepi membrano v teh organizmov [30-32]. H. pylori
tudi unikatno oblikovanje holesterola alfa-glikozid [33, 34], in ta presnovek se lahko nadalje spremenjena z aciliranjem ali phosphatidylation [34]. Alpha-glucosylated holesterola uničuje gostil imunski odziv na bakterije v mišjem modelu, s pomočjo zatiranja fagocitozo in aktivacije celic T [35]. Druge vloge za holesterola in holesterola metabolitov v bakterijske membrane je treba še raziskati. V tem poročilu smo dokazati, da so biosintezo lipopolisaharid, vključno Lewis antigena izražanja in LPS jedro /lipidov A spremembo, spremenila razpoložljivost holesterola v gojišča. Predstavljamo podatke, ki kažejo, da se lahko te spremembe v celični ovojnici pomembno vplivajo interakcije patogenov /gostitelja na živalskem modelu okužbe.
Metode
bakterij in pogoje za rast
sevov H pylori
vključiti stanje laboratorijski sev ATCC43504 (izvor: Avstralija) (Italija [36], ki jih N. Salama), 26.695 (UK), klinični izolat G27 in miške prilagojen sev SS1 (Avstralija, pod pogojem, Adrian Lee [37]). Bakterije so se ohranili pri 37 ° C v microaerobic atmosferi 5% O 2/10% CO 2 agar Campylobacter krvi (CBA). Bakterije so pasaže vsake 2 do 3 dni in ne več kot 25 dni, da se zmanjša genetski drift. Za rast v kemično definiranem mediju [26], so bile bakterije nacepili iz CBA v kulturi bučke tkiva vsebujejo Ham je F12 (Gibco) z 1 mg /ml seruma albumina goveje (maščobne kisline brez Sigma A7906), iz vsej kot definiranem mediju. Tekoči kulture smo dnevno pasaže z razredčenjem v svežem mediju pri začetnih gostoti 1-2 x 10 6 /ml, in se uporabljajo pri prehodu 3 do 5. Cell kulture stopnje holesterola (> 99%, Sigma) dodamo k F12 stabilnega 10 x emulzijo, ki vsebuje 500 ug /ml holesterola razpršene v 10 mg /ml albumin, ki je bila pripravljena v skladu z [38]. Naslednji mediji dopolnitve so bile izvedene na enak način: beta-sitosterol (sintetično, 95%), natrijev tavroholat, natrijev glikoholat, beta-estradiol, progesteron (vsi od Sigma), dehidroepiandrosteron (Calbiochem) in beta-coprostanol (Matreya) .
podvojitev časi so v času rasti log fazo določi kvantificiranje žive celice z Cell Titer Glo reagenta (Promega), kot je potrjeno in opisan [39]. Merjenje biomase kot CFU, kot celične beljakovine, ali kot ATP so proizvedeni dosledne rezultate. Vrednost 1 attomol ATP na celico [40] je prevzel za rutinsko prehod. Možna netočnost te vrednosti bistveno ne vplivajo na razlago podatkov.
Izogenimi genskih motenj z vstavitvijo Campylobacter coli bile dosežene
odpornost kloramfenikol element (kat
) po strategije, ki jo Chalker sod
[41]. Temeljni premazi so bili skrbno načrtovani tako, da ciljno zaporedje v odprtih bralnih okvirov, in so navedene v tabeli 1. Fusion PCR reakcije z uporabo PCR Extender sistem (5Prime) vsebuje 2,3 nM vsak gel očistimo predlogo, 50 LM-premaz, 1 x tuning buffer, 1.25 mM dodatnega Mg ++, 0,2 mM vsakega dNTP, in 0,01 U /ul polimeraza. Pogoji Fusion ciklusa so bili naslednji: 94 ° C 2,5 min, 10 ciklov [94 ° C 15 sekund, 45 ° C 60 sekund, 68 ° C 60 sekund na kb], 25 ciklov, [94 ° C 15 sec, primer specifične tm 30 sec, 68 ° C 60 sec na kb], končno razširitev 68 ° C 6-8 min. Fusion izdelki so bili ponovno pomnožili z Pfx50 (Invitrogen) povečati količino, nato pa očistimo z Purification Kit Qiaquick PCR (Qiagen). sevi prejemnice zrasla 1 dan na analizi stroškov in koristi so se spremenile s 500 ng končnega pomnožkov z uporabo naravne preoblikovanja [42, 43], ki mu sledi izbor za 7-10 dni na analizi stroškov in koristi, ki vsebujejo 15 ug /ml kloramfenikol. Zagotoviti alelov zamenjave so nastali seve ocenili s PCR z uporabo genomske DNA GoTaq (Promega) s primerji, navedenih v tabeli 1. PCR strategije in rezultati so prikazani na sliki 1.Table 1 primerjem sekvenc.
primerji za prekinitev alelov
na
CAT FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
dodatne primerji za potrditev motenj genov
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective genske številke v javnih bazah podatkov za 26695 in G27, so naslednji: [brt: hp0421, G27_952
], [pmi
(rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [EPTA. hp0022, G27_21
]
bRighthand stolpcu so navedene kratkih začetnih oligonukleotidov označb, ki se uporabljajo na sliki 1.
Slika 1 PCR preverjanje alelne motnjami v H. pylori sev G27. Genomsko DNA smo pripravili iz gena moten G27 sevov naslednje tri odlomke iz izbora kloramfenikola, nato pomnožili s PCR, kot je prikazano v vsakem sistemu. Primerji zaporedja so podane v tabeli 1. A. Moten brt. Pet primerov so prikazani iz sedmih posameznih klonov, ki so vsi dali identične rezultate na zaslonu. B. Prekinitev PMI (rfbM). Celotna kloramfenikol odporna populacija je vnesejo v vsakem krogu izbora, ne da bi klonske selekcije. C. Prekinitev lpxE in EPTA. Celotna kloramfenikol odporna populacija je vnesejo v vsakem krogu izbora, brez klonsko selekcijo.
Želodca kolonizacijo
so poskusi na živalih odobril odbor LSUHSCS institucionalnega varstva živali in uporabe. Ženska Mongolski peščene so se ohranili na redni prehrani ad libitum
. Ohraniti gibljivost je H. pylori
sev SS1 kultiviramo preko noči pod pogoji microaerobic v T75 bučke, ki vsebujejo 40 mL F12 mediju z 0,4 mg /ml albumin in 0 ali 50 ug /ml holesterola. V premikajoči planktonske bakterije požanjemo s centrifugiranjem in ponovno suspendirali v fiziološko raztopino. ki tvorijo kolonije (CFU), so bile izmerjene v teh inokulov ga serijsko redčenju in prevleka za analizo stroškov in koristi, in te meritve potrdili enako dozo živih bakterij med obema pogoji rasti. Približno 10 8 CFU na 30 ul bila dana oralno živali (n = 6-9 na skupino). Živali smo evtanazirali 11 dni pozneje, in želodcev smo odstranili in razrežemo. H. pylori
prisotna v želodčnih antruma homogenatih bile kvantificiramo s serijsko redčenju in prevleka na CBA, ki vsebuje 5-fluorocitozina (5 ug /ml), vankomicin (10 mg /ml), amfotericin B (5 mg /ml), bacitracin ( 30 ug /ml), polimiksin B (10 U /ml) in trimetoprim (10 ug /ml) [44]. Vzporedni meritvi CFU bile narejene za večkratne razredčitve vsakega vzorca tkiva.
Celocelično ELISA
Standard postopkov [6, 7, 45], so bili prilagojeni za uporabo peroksidaze konjugirana sekundarnega protitelesa. Vse protitelesa so bili pridobljeni iz Calbiochem. Prenočitve kulture bakterij zberemo s centrifugiranjem pri 3500 x g
za 10-15 minut, sprani v Dulbeccovem fosfatnim pufrom in repelleted pri 10.000 x g
2 minuti, nato ponovno suspendirane v 15% glicerol /0,9% NaCl. So celične suspenzije smo analizirali vsebnost beljakovin in shranili pri -20 ° C. Celične vzorce, ki vsebujejo znane količine beljakovin so hitro razredčimo v 50 mM natrijevega bikarbonata /karbonata pH 9.55 in takoj razdelimo v vdolbino ELISA plošče (Costar΅7). Plošče smo zamašili in v hladilniku preko noči, nato blokirali 90 minut pri 3% goveji serumski albumin, raztopljenega v izpiralnim pufrom, ki je obsegal 0,1 M natrijevega fosfata pH 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% w /v Tween-20. Primarno protitelo monoklonsko anti-Lewis X (Signet klon P12) ali anti-Lewis Y (Signet klon F3), razredčili 1: 500 v pranje pufer /1% BSA, dodamo 2 uri, nato pa štiri sprememb pralnega pufra. Sekundarni protitelo, 1: 2500 razredčitvijo hrenovo peroksidazo konjugirano kozje anti-miške IgM v pranje pufer /1% BSA, dodamo 90 minut, nato pa štiri sprememb pralnega pufra. Kromogenega substrata je bila 0,42 mM tetrametilbenzidina in 0,02% H 2O 2 v 50 mM acetat /citrat pH 5.5 [46]. Po 15 minutah pri sobni temperaturi smo reakcijo ustavili z 1 /5. vol 2,5 N H 2SO 4 in spremembo barve smo izmerili v čitalniku ploščo pri 450 nm. Negativne kontrole izpuščanje bodisi primarna ali sekundarna protitelesa, ali z E. coli
seva HB101 nadomestimo H. pylori
, je sprememba barve zanemarljiv (A < 0,05). Ravni Lewis Y zanemarljiva (A < 0,1) in sev 26695 ali 43504, saj so bile vrednosti Lewis X v SS1
Elektroforetskimi analize lipopolisaharidov
H. pylori
kulture so bili zbrani, kot je opisano zgoraj, in opere. celične pelete smo hranili pri -70 ° C. Celice smo lizirali v 60 mM Tris HCl, pH 6,8, ki vsebuje 2% SDS pri 95-98 ° C 10 min. Vsebnost proteinov je bila izmerjena z uporabo testa bicinchoninic kisline (Pierce). Vzorce celičnih lizatov bile prilagojene enako vsebnostjo proteinov (1 mg /ml), nato proteolyzed pri reakcijah, ki vsebujejo (končno) 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,67% SDS in 0,67 mg /ml proteinazo K pri 60 ° C 2 uri [47]. Za odpravo elektroforetske artefakte zaradi prisotnosti lipidov /detergentov kompleksov, so proteolyzed vzorce ekstrahirali z vročim fenolom [48]. Kontrolni poskusi preverjeno, da so bili vsi LPS trakovi vrniti po naslednjem postopku ekstrakcije kakovostno in brez predsodkov. Proteolyzed Vzorce zmešamo z 1 volumnom 90% vodne fenola in inkubiramo pri 70 ° C za 20 minut. Po ohladitvi na 10 ° C 1 min, smo vzorce centrifugirali pri 12.000 x g
20 minut pri 10 ° C in vodno fazo zberemo. Faze fenolne smo ponovno ekstrahirali z 1 obsega H 2O pri 70 ° C za 10 minut in centrifugiranja ponovimo. Združene vodne ekstrakte naravnamo na 0,5 M NaCl in oborili s 10 vol etanola v hladilniku preko noči, nato pa centrifugiramo pri 20,000 kratni g
20 minut pri 10 ° C in sušimo na zraku. Očiščene LPS vzorce smo ponovno raztopili v Laemmli vzorčnem pufru [49] pri 95 ° C 5 min. Vzorci so bili uporabljeni za 15% poliamidnem /0,9% bis minigels, ki vsebujejo 3,2 M sečnino s Laemmli nezvezne varovalnem oblikovanje [49], in 5% zlaganje gel. Po elektroforezi na 150 V za 75 minut, so geli fiksne čez noč za srebrno obarvanje [50] ali prenese polyvinylidenedifluoride membrano s pomočjo prenosa Tris /glicin buffer [51]. Blots smo preko noči blokirali v 3% goveji serumski albumin in 0,03% NaN 3 v izpiralnim pufrom zgoraj opisan za ELISA. Primarna protitelesa (anti-Lewis X in anti-Lewis Y, 1: 200) in sekundarno protitelo (peroksidaza konjugiranega kozjega proti-miš IgM, 1: 1000) smo razredčili v pranje pufru, ki vsebuje 0,5% BSA. Kolorimetrijska odkrivanje uporablja 3,3'-diaminobenzidine z izboljšanjem kobalta [52]. Denzitometrija je bilo izvedeno z javno dostopnega aplikacij Image J, na voljo na spletni strani http:.... //RSB info nih gov /ij
Rezultati
malo znanega o fizioloških vlogi holesterola v H . pylori
. Raziskati odgovore H. pylori
do holesterola, smo sprejeli definirano, serumu brez gojišča, F12 z 1 mg /ml albumina, v katerem se ta bakterija lahko trajno pasaže [26]. Ta skromna koncentracija albumina povečuje rasti [25, 26] in blaži tesen spoštovanje kulturnih površin, ki se pojavlja v beljakovinskih brez medijev [53]. V tem definiranem mediju, dodajanje 50 ug /ml holesterola ni pomembno spremenila hitrost rasti (slika 2). Odsotnost učinkov rastnih pod izbranimi pogoji gojenja bila ugodna za preiskavo fiziološkega pomena holesterola v H. pylori
. Tako smo lahko primerjali želodčni kolonizacijo peščene po seva SS1, ki so bili kultivirani v definiranem mediju, ki vsebuje različne količine holesterola (slika 3). Enajst dni po peroralni okužbi, so H. pylori
želodčnega antruma selektivno prevlečen in kvantificiramo. Presenetljivo je bilo peščene kolonizirali le kultur, gojenih v mediju, ki vsebuje holesterol, vendar ne s H. pylori PODJETJA
gojimo v holesterola brez mediju (V vsakem poskusu, P < 0,0001 za primerjavo log (CFU /g) med skupinami, ki uporabljajo Študent dve zimske t-test). Zato je holesterol bistveni sestavni del gojišča, da se ugotovi H. pylori
okužbo v tem živalskem modelu. Slika 2 Dodatek holesterola v definiranem mediju ne vpliva na H. pylori stopnjo rasti. Vzporedni kulture vsakega seva gojimo preko noči pri F12 /albumin (1 mg /ml) v odsotnosti (odprto barov) ali prisotnosti (zasenčeni barov) 50 ug /ml holesterola. Začetna gostota prebivalstva je 2 x 106 /ml. Podvojitev časi so bili izračunani iz izmerjenega povečanja biomase. Prikazane vrednosti predstavljajo povprečje ± SD pet ali več neodvisnih meritev. n
. s
. Študentska dve tailed t-test za parne podatkov ni pokazala statistično pomembnost.
Slika 3 H. pylori pridelujejo brez holesterola ne kolonizirati peščene. H. pylori
sev SS1 smo gojili preko noči pri definiranem mediju, ki vsebuje 0 ali 50 ug /ml holesterola. Peščene podgane so bile ustno inokulirali s 3,5 × 108 CFU (eksperiment A) ali 1 × 108 CFU (eksperiment B). H. pylori
želodčnega antruma so kvantificiramo na 11 dni. Vsak navpična črta predstavlja povprečje vzporednih določitev za eno žival, in vodoravne črte daje mediana vsako tretirano skupino. Kjer so bili izterjani nobenih kolonij, so vrednosti prikazane kot 5 × 102 CFU /g tkiva, ocenjeni mejo detekcije.
Nekateri sevi H. pylori
razstavljene velike razlike v spoštovanju posodah za kulture naslednja odlomka holesterola, kar kaže, spremembe v svojih celičnih površinskih lastnosti (Hildebrandt & McGee, neobjavljeni opažanja). Zaradi tega smo se odločili, da razišče lipopolisaharidov, ki predstavljajo glavno komponento celične ovojnice in služijo predstaviti biološko pomembnih Lewis antigene. Smo uporabili uveljavljeno celih celic postopek ELISA za kvantitativno prevladujoče Lewis antigene, Lewis X in Y (slika 4). V skladu z literaturo [54, 55], predvsem Lewis X je bila odkrita v sevu 26695, le bila odkrita Lewis Y v SS1, pa so odkrite znatne ravni tako v G27. V vsakem primeru so absorbcijske branja nelinearna glede na vzorec obremenitve, pojav, ki ni nenavadno, ELISA testi [56], in da je bilo ugotovljeno z drugimi raziskovalci, ki uporabljajo te iste monoclonals [7]. Tako, da se primerjajo antigenov ravni v vzorcih H. pylori
kultiviramo v odsotnosti ali prisotnosti holesterola, smo izvedli vzporedne titracij v območju vzorčnih obremenitvah, ki variirajo od 20 do 500 ng celične beljakovine na jamico. Te titracije ponovljivo pokazali izrazito povečanje v višini Lewis X in /ali Y Lewis antigen zaznan na celični površini, ko H. pylori
sevov 26.695 bili SS1 ali G27 kultiviramo v prisotnosti holesterola (slika 4). V ponovitvenih neodvisnih poskusih, so bile povprečne povečanje holesterola odvisni statistično pomembna (tabela 2). Primerljive rezultati so bili doseženi tudi Lewis X v sev 43504 (podatki niso prikazani). Vozlanje vzorcev s holesterolom na koncu obdobja rasti ni spremenila količino Lewisove antigena z ELISA (slika 5A) zaznano. V drugi nadzorni poskusu smo preverili pri vseh štirih teh sevov, da je bil znesek celične beljakovine vezani na vodnjakov ne vpliva na porast holesterola (slika 5B). ELISA Rezultati tako ugotovili, da je večja površina izraz Lewis antigenov legitimni biološki odziv holesterola, ki je nastal v vseh testiranih sevov. Ta odziv je specifičen za holesterol, ker substitucija holesterola v gojišču s strukturnimi analogi beta-sitosterola ali natrijev tavroholat imela nobenega učinka na Lewis X in Y izražanja G27 (slika 4, desnemu plošče in tabeli 3). Odgovor Lewis antigen holesterola je še vedno ostal po motnje gena za holesterol a-glukoziltransferaze (brt
) v sev G27 (tabeli 2, in glej spodaj) in 26695 (podatki niso prikazani), izključuje udeležbo a -glycoside presnovki cholesterol.Table 2 izboljšavi celični površinski Lewis izražanja antigena po rasti kultur v prisotnosti cholesterol.a

povečanje krat v primerjavi z vzporednim holesterola brez kulture

Lewis X
Lewis Y

pomeni ± SEM (n)
P vrednost
srednja vrednost ± SEM (n)
P vrednost
26.695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
niso storili
SS1 PODJETJA
niso storili
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 divjega tipa
2.85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 brt :: cat
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: cat
2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± 0,43 (7)
0.014
a Lewis antigeni so kvantificiramo v ponovitvah celoceličnimi ELISA analize seznanjenih vzorcev, ki rastejo v prisotnosti ali odsotnosti 50 ug /ml holesterola. Obremenitev antigen 300 ng celične proteine ​​na jamico. Razmerja za plus: minus holesterola so bili izračunani iz podvojenih neto absorbance branja v vsakem testu, in razmerja, določeni v petih do osmih neodvisnih ELISA tekov so bili takrat v povprečju. P vrednosti so bile izračunane v dveh zimske Student t-testov za ničelno hipotezo, da je razmerje enaka 1.
Tabela 3 Enhanced celični površini Lewis antigen izraz holesterol specifične

kratno povečanje v primerjavi z vzporednim holesterola brez kulture

Lewis X
Lewis Y


pomeni ± SEM (n)
P vrednost
pomeni ± SEM (n)
P vrednost

holesterola
2,96 ± 0,22 (5)
.0008
2,48 ± 0,10 (4)
.0007
β- sitosterol
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0,28
tavroholat
0,64 ± 0,16 (4)
0,12
0.84 ± 0,20 (3)
0,52
Lewis antigeni so kvantificiramo v posnetek celotne celične ELISA analize parne kultur H. pylori
G27, ki rastejo v prisotnosti ali odsotnosti 130 iM holesterola, ali pa je šlo enaka koncentracija beta-sitosterola in natrijev tavroholat. Obremenitev antigen 300 ng celične proteine ​​na jamico. Razmerja za plus: minus holesterola so bili izračunani iz podvojenih neto absorbance branja v vsakem testu, in razmerja, določeni v treh do petih neodvisnih ELISA tekov so bili takrat v povprečju. P vrednosti so bile izračunane v dveh zimske Student t-testov za ničelno hipotezo, da je razmerje enaka 1.
Slika 4 Rast holesterola posebej povečuje celični površinski prikaz Lewis antigenov. Cela celica ELISA teste smo opravili na vzorcih H. pylori
sev 26695 (zgornji levi), SS1 (spodaj levo) ali G27 (zgornja in spodnja desno). Vzporedni kulture smo gojili preko noči v določenem mediju, ki vsebuje 130 mikrometrov naslednjih dodatkov: kroge, brez dodatka; kvadratov, holesterol; trikotniki, β-sitosterol; X, tavroholat. so bile uporabljene različne količine suspenzije celic, ki ustrezajo znanih količin celičnega proteina dve vdolbinici ELISA plošč in immunoassayed prisotnosti Lewisove X ali Lewisova Y antigena, kot je opisano v metodah
. Negativni kontrolni vzorci E. coli
HB101, ali samo za omilitev prazne, je padla na pikčasto črto. Absorbcijske branja posameznih vrtin so narisane. Večkratni poskusi s tremi ali več samostojno zrasla kultur so dali v bistvu enake rezultate.
Slika 5 ELISA kontrolne poskuse. A. Težava pri primešanju s holesterolom ob koncu rastne dobe ne spreminja Lewisa antigen izraz. Kulture H. pylori
gojimo preko noči pri definiranem mediju brez (kontrolo) ali 50 ug /ml holesterola (holesterola zrasla). Tretji bučko (holesterol obogatenih) smo gojili v odsotnosti holesterola, ohlajeno na ledu in dodamo ekvivalentno količino holesterola, preden smo zbrali celice. Lewis antigeni so kvantificiramo v dveh izvodih, ki ga cela celic ELISA, nakladanje 300 ng celične beljakovine, na dobro. Razmerja za plus: minus holesterola so bili izračunani iz povprečnih neto absorbance branja v vsakem testu, in prikaže parceli pomeni razmerja ± SEM tri do pet neodvisni ELISA teče. P vrednosti so bile izračunane v dveh zimske Student t-testov za ničelno hipotezo, da je razmerje enako 1. Za primerjave z oznako ns, P > 0,05. B. ekvivalentna vezavo celic ELISA plošče. Vzorci H. pylori
, ki so bile gojene v vzporednih kulturah v odsotnosti (bele palice) ali prisotnosti 50 ug /ml holesterola (sivi stolpci), so bili uporabljeni za multiwell plošč na enak način kot pri Lewis antigen ELISA testih dodajanje 500 ng celičnega proteina na jamico. Po noči vezave smo vdolbinice sprali dvakrat s Dulbeccovem fosfatnim pufrom, nato beljakovine v oprijetih celicah kvantificiramo z BCA reagenta. so prikazane povprečne vrednosti ± SD četverk vdolbin.
odkrivanje Lewis X in Y, ki jih imunoblotanju z enakimi monoklonskih protiteles, proizvedenih drugačen rezultat (slika 6). V več poskusih, ki uporabljajo to tehniko, mi ni zaznal nobenih holesterola odvisna od razlike v stopnjah Lewis X in Y, razen majhnega povečanja Lewis X v 43504, ki je bila le malo pomembna. Postopek odtisi zaposleni LPS vzorcev pridobljeni iz celičnih lizatov, in načeloma morali odkriti celotno celično Lewis antigen bazen, medtem ko je celotna celice ELISA metoda namenjen odkrivanju le to predstavljeno na zunajcelični površini. Zanimiva razlika v rezultatih med naše analize in immunoblots ELISA predlaga spremembe v celični sektorjev antigena Lewis odvisno od razpoložljivosti holesterola v gojišča. Slika 6 Lewis X in Y antigena profiliranje z imuno. Vzorci LPS izoliranih iz vzporednih kultur, ki rastejo v odsotnosti (-) ali prisotnosti (+) 50 ug /ml holesterola je bilo rešenih na 15% urea geli. Količine naloženo na stezi, kot ug začetnega lizata proteina, so podani na vrhu vsakega pasu. Po prenosu smo antigene immunodetected z monoklonskih protiteles, specifičnih za Lewis X (zgornji panel) in Lewis Y (nižji plošča). Predstavnik primer vsak prikazano. Stranski pasovi vsebujejo prestained proteinskih označevalcev (M) ali 400 ng E. coli
O111: B4 LPS. Antigenski signala pojavil samo v O-verige regijah teh H. pylori
sevov; prazne področja so obrodile ven ustrezno. V immunoblots so neodvisno ponovili z več vzorcev sklopov, in denzitometrija je bila uporabljena za kvantitativno antigena signal v vsaki stezi. Razmerja so paroma plus: vzorci minus holesterola so bile izračunane, in pomenijo razmerja ± SEM za (n) blot analiz so podani v modrem. Ničelne hipoteze, da je razmerje znaša 1 so ocenjevali v dvorepe Student t-test.
Poleg merjenja antigenov Lewis, smo neposredno primerjali profile lipopolisaharid med vzporednih kulturah, ki rastejo v prisotnosti ali odsotnosti holesterola, z uporabo gel elektroforeza in obarvanje s srebrom. V vseh H. pylori
sevov smo pregledali, so LPS pas profili enaki med kulturami, ki rastejo v določenem mediju s holesterolom ki se jo dobi v mediju, ki vsebuje serum ali na krvni agar (podatki niso prikazani), in kot je bilo pričakovano [5 je bilo 24, 55, 57] ti profili visoko sev specifično. Na teh gelov so holesterola odzivna LPS trakovi najbolj jasno rešiti za sev G27, klinično izolat (sliki 7, 8).

• Uporabnost citokeratinov 7 in 20 (CK7 /20) imunohistokemija v razlikovanju kratkega odseka Barrett požiralniku iz želodca intestinalno metaplazijo: Ali je zanesljiv?
• Dodatek pH občutljiv gel izboljšuje mikroemulzija stabilnost za ciljno odstranitev debelega ammonia