modification de Helicobacter pylori lipopolysaccharide, Lewis expression de l'antigène et la colonisation gastrique sont le cholestérol dépendant

Helicobacter pylori
modification de lipopolysaccharide, Lewis expression de l'antigène et la colonisation gastrique sont le cholestérol dépendant
Résumé de l'arrière-plan encore
Helicobacter pylori
prend spécifiquement le cholestérol et l'incorpore dans la membrane bactérienne, peu est actuellement connu sur les rôles physiologiques de cholestérol. Nous avons comparé les phénotypes et les résultats de la colonisation in vivo
capacité de H. pylori
cultivées dans un sens, sans sérum croissance moyenne, F12 avec 1 mg /ml d'albumine contenant de 0 à 50 pg /ml de cholestérol.
Alors que le temps de doublement étaient largement épargnées par le cholestérol, d'autres changements phénotypiques manifestes ont été observées. H. pylori de la souche SS1 cultivées dans un milieu défini avec le cholestérol colonisé avec succès l'estomac de gerbilles, alors que SS1 cultivé sans cholestérol n'a pas réussi à coloniser. H.pylori
lipopolysaccharide affiche souvent Lewis X et /ou Y antigènes. L'expression de ces antigènes mesurées par la cellule entière ELISA a été nettement améliorée en réponse à la croissance de la souche SS1, 26695, ou G27 en cholestérol. En outre, l'analyse électrophorétique de lipopolysaccharide dans le type sauvage G27 et dans les mutants dépourvus de la O-chaîne a révélé des changements structurels dans le noyau oligosaccharide /lipide fragments A. Ces réponses dans les niveaux d'antigène Lewis et dans les profils de lipopolysaccharide à la disponibilité de cholestérol étaient très spécifiques, car aucun changement a eu lieu lorsque le taux de cholestérol a été remplacé par des sels bêta-sitostérol ou biliaires. Disruption des gènes codant pour le cholestérol α-glucosyl transférase ou lipide A phosphoéthanolamine n'a eu aucun effet sur l'expression de Lewis, ni sur les profils de lipopolysaccharide, ni sur la capacité de réaction du cholestérol de ces propriétés. Disruption du gène de lipide A 1 phosphatase élimine l'effet du cholestérol sur les profils de lipopolysaccharide mais pas son effet sur l'expression de Lewis.
Conclusions
Ensemble, ces résultats suggèrent que l'appauvrissement du cholestérol conduit à des formes aberrantes de LPS qui dépendent de la déphosphorylation du lipide A à la position 1. Un modèle expérimental pour les effets observés de cholestérol est discuté dans lequel les étapes successives consistant lipopolysaccharide biogenèse et, indépendamment, présentation d'un antigène de Lewis à la surface de la cellule, dépendent de la composition de la membrane. Ces nouveaux résultats démontrent que la disponibilité de cholestérol permet H. pylori
de modifier son enveloppe cellulaire d'une manière qui peut avoir un impact sur la colonisation des tissus de l'hôte in vivo
.
Fond
Helicobacter pylori
est une très niche pathogène Adapté de qui habite l'estomac humain, se transmet principalement au sein des familles, et n'a pas connu réservoir environnemental. Les infections chroniques peuvent être asymptomatiques ou provoquer une gastrite, l'ulcère, ou d'un cancer gastrique. Pour établir l'infection, la bactérie doit survivre au transit à travers le compartiment gastrique acide [1]. Il pénètre et établit sa résidence dans la couche de mucus protecteur, un environnement et des lipides riches en cholestérol [2, 3]. Dans cette niche la bactérie emploie une variété de mécanismes pour échapper à la réponse immunitaire de l'hôte.
Lipopolysaccharides (LPS) sur la surface de H. pylori
sont modifiés pour afficher certains antigènes de groupes sanguins humains, principalement Lewis antigènes X et Y [ ,,,0],4-7], et moins fréquemment H type 1, i-antigène, groupe sanguin A, ou Lewis antigènes A ou B [8-10]. Ces antigènes LPS de surface sont nécessaires pour l'établissement d'une infection, car les souches mutantes défectueuses pour la synthèse LPS O-antigène ou pour l'expression Lewis X /Y ne parviennent pas à coloniser des souris [11-13]. Il est prouvé que Lewis antigènes exprimés sur la surface bactérienne contribuer à l'adhérence de H. pylori
aux cellules épithéliales gastriques [10, 14], et de jouer un rôle dans le tropisme tissulaire [15-17]. les cellules épithéliales gastriques expriment également des antigènes de Lewis [18, 19], ce qui suggère que l'affichage de Lewis antigènes sur la surface bactérienne peut servir comme une stratégie de mimétisme. Des études sur des isolats cliniques [18, 20] et les infections expérimentales chez l'animal [21] soutiennent ce rôle pour Lewis bactérienne antigènes dans l'évasion immunitaire. En cas d'infection humaine, H. pylori des antigènes de Lewis ont été liés à la gravité de l'ulcère peptique et la duodénite [16, 22]. Une autre caractéristique importante de H. pylori
LPS est son lipide A structure modifiée, avec acylation réduite et moins de groupes chargés que ce qui est typique des entérobactéries [23]. Ces modifications du lipide A minimiser endotoxique et inflammatoires propriétés des LPS de H. pylori (revue dans [24]).
Le cholestérol est un nutriment non essentiel pour H pylori
, mais il favorise la croissance dans un milieu sans sérum [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
spécifiquement incorporer le cholestérol dans la membrane bactérienne [27], tout comme un nombre limité de bactéries pathogènes et commensaux dont Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia de la
., Et Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Le cholestérol peut renforcer la membrane dans ces organismes [30-32]. H. pylori
également former unique cholestérol α-glucoside [33, 34], et ce métabolite peut être encore modifié par acylation ou phosphatidylation [34]. cholestérol alpha-glucosylé corrompent hôte réponse immunitaire à la bactérie dans un modèle de souris, grâce à la suppression de la phagocytose et de l'activation des lymphocytes T [35]. D'autres rôles pour le cholestérol et le cholestérol métabolites dans la membrane bactérienne doivent encore être explorées. Dans ce rapport, nous démontrons que la biosynthèse de lipopolysaccharide, y compris Lewis expression de l'antigène et de noyau de LPS /lipide A modification, sont modifiés par la disponibilité de cholestérol dans le milieu de croissance. Nous présentons des données indiquant que ces changements dans l'enveloppe cellulaire peuvent influencer de manière significative l'interaction pathogène /hôte dans un modèle animal d'infection.
Méthodes
souches bactériennes et foulures de conditions de croissance de H pylori
inclus la souche de laboratoire ATCC43504 (origine: Australie), 26695 (UK), isolat clinique G27 (Italie [36], fourni par N. Salama), et la souris adaptés souche SS1 (Australie, fourni par Adrian Lee [37]). Les bactéries ont été maintenues à 37 ° C dans une atmosphère de 5% microaérobique O 2/10% de CO 2 sur gélose au sang de Campylobacter (CBA). Les bactéries ont été repiquées tous les 2 à 3 jours, et pas plus de 25 jours, afin de minimiser la dérive génétique. La croissance dans un milieu chimiquement défini [26], les bactéries ont été inoculées à partir CBA dans des flacons de culture de tissus contenant du milieu F12 de Ham (Gibco) à 1 mg /ml d'albumine de sérum bovin (sans acide gras, Sigma A7906), désignés dans tout comme milieu défini. Les cultures liquides ont été repiquées quotidiennement par dilution dans du milieu frais à des densités initiales de 1-2 x 10 6 /ml et utilisée au passage 3 à 5. Cellule cholestérol qualité culture (> 99%, Sigma) a été ajouté à F12 comme stable 10 × émulsion contenant 500 ug /ml de cholestérol dispersé dans 10 mg /ml d'albumine, qui a été préparé selon le point [38]. Les additions de supports suivants ont été effectués de la même manière: ß-sitosterol (synthétique, 95%), le taurocholate de sodium, glycocholate de sodium, le β-oestradiol, de la progestérone (tous de Sigma), la déhydroépiandrostérone (Calbiochem) et β-coprostanol (Matreya) . fois
Doubler ont été déterminées lors de la croissance en phase logarithmique en quantifiant cellules viables en utilisant la cellule réactif Titer Glo (Promega) comme validé et décrit [39]. Mesure de la biomasse en UFC, en tant que protéine cellulaire, ou sous forme d'ATP ont tous produit des résultats cohérents. Une valeur de 1 attomol ATP par cellule [40] a été supposé pour le passage de routine. inexactitude possible de cette valeur n'a pas d'influence fondamentalement l'interprétation des données.
perturbations génétiques isogéniques ont été obtenus par l'insertion d'un Campylobacter coli
élément de résistance au chloramphénicol (chat
) selon la stratégie décrite par Chalker et al
[41]. Des amorces ont été conçues avec soin de manière à la séquence cible à l'intérieur des cadres de lecture ouverts, et sont listés dans les réactions Tableau 1. Fusion de PCR en utilisant le système d'extension PCR (5Prime) contenaient 2,3 nM de chaque modèle purifié sur gel, 50 uM d'amorce, 1 x tampon de mise au point, 1,25 mM de Mg supplémentaire ++, 0,2 mM de chaque dNTP et 0,01 U /ul de polymerase. des conditions de cycle de fusion sont les suivantes: 94 ° C 2,5 min, 10 cycles [94 ° C 15 sec, 45 ° C 60 sec, 68 ° C 60 secondes par kb], 25 cycles [94 ° C 15 sec, Tm spécifique à l'amorce 30 sec, 68 ° C 60 sec par kb], extension finale 68 ° C 6-8 min. les produits de fusion ont été réamplifiés avec Pfx50 (Invitrogen) pour augmenter la quantité, puis purifiée en utilisant le kit de purification PCR Qiaquick (Qiagen). souches bénéficiaires cultivées 1 jour sur ABC ont été transformées avec 500 ng de l'amplicon final en utilisant la transformation naturelle [42, 43] suivie par la sélection pendant 7-10 jours sur ABC contenant 15 ug /ml de chloramphenicol. Pour assurer le remplacement allélique, les souches résultantes ont été évaluées par PCR de l'ADN génomique en utilisant GoTaq (Promega) avec les amorces indiquées dans le tableau 1. stratégie de PCR et les résultats sont présentés sur la figure 1 1.Table des séquences d'amorces.
amorces pour rupture allélique
un
CAT FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE FWD
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
amorces supplémentaires pour la confirmation de la perturbation du gène
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
nombre de gènes aRespective dans les bases de données publiques pour 26695 et G27 sont les suivants: [tbc: hp0421, G27_952
], [
pmi (RFBM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [EPTA:. hp0022, G27_21
]
colonne Brighthand répertorie les brèves désignations d'amorces utilisées dans la figure 1. Figure 1
vérification PCR des perturbations alléliques chez H. pylori souche G27. On a préparé l'ADN génomique à partir de souches G27 gène perturbé suivantes trois passages sous sélection de chloramphénicol, puis amplifié par PCR comme indiqué dans chaque régime. Amorces séquences sont indiquées dans le tableau 1. A. Perturbation de tbc. Cinq exemples sont représentés sur les sept clones individuels, qui tous ont donné des résultats identiques à l'écran. B. Perturbation des pmi (RFBM). L'ensemble de la population de chloramphénicol résistant a été passé dans chaque cycle de sélection, sans sélection clonale. C. Perturbation des lpxE et EPTA. L'ensemble de la population de chloramphénicol résistant a été passé dans chaque cycle de sélection, sans sélection clonale.
colonisation gastrique
expériences sur les animaux ont été approuvés par le Comité des soins et l'utilisation des animaux LSUHSCS institutionnels. gerbilles de Mongolie femelles ont été maintenus sur le régime ordinaire ad libitum
. Pour préserver la motilité, la souche de H. pylori
SS1 a été cultivé pendant une nuit dans des conditions microaérobies dans des flacons T75 contenant 40 ml de milieu F12 avec 0,4 mg /ml d'albumine et 0 ou 50 ng /ml de cholestérol. Les bactéries planctoniques mobiles ont été récoltées par centrifugation et remises en suspension dans une solution saline isotonique. unités formant des colonies (UFC) ont été mesurés dans ces inoculums par dilution en série et placage sur ABC, et ces mesures ont confirmé égale dose de bactéries viables entre les deux conditions de croissance. Environ 10 8 UFC par 30 pi ont été administrés par voie orale à des animaux (n = 6 à 9 par groupe). Les animaux ont été euthanasiés 11 jours plus tard et les estomacs ont été prélevés et disséqués. cadeau de H. pylori dans des homogénats antre gastrique ont été quantifiée par dilution en série et placage sur CBA contenant du 5-fluorocytosine (5 ug /ml), vancomycine (10 ug /ml), de l'amphotéricine B (5 pg /ml), de la bacitracine ( 30 pg /ml), de la polymyxine B (10 U /ml) et du triméthoprime (10 pg /ml) [44]. Une double mesure UFC ont été faites pour plusieurs dilutions de chaque échantillon de tissu.
Cellules entières ELISA
procédures standard [6, 7, 45], ont été adaptés à l'utilisation de la peroxydase conjugué anticorps secondaire. Tous les anticorps ont été obtenus auprès de Calbiochem. cultures d'une nuit de bactéries ont été recueillies par centrifugation à 3500 x g
pendant 10-15 min, lavées dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco et repelleted à 10.000 xg
pendant 2 min, puis remises en suspension dans 15% de glycérol /0,9% NaCl. Les suspensions cellulaires ont été analysés pour déterminer la teneur en protéine et stockées à -20 ° C. Des échantillons de cellules contenant des quantités connues de protéines ont été diluées rapidement dans du bicarbonate de sodium à 50 mM /pH carbonate 9,55 et distribués immédiatement dans les puits d'une plaque ELISA (Costar 9017 °). Les plaques ont été scellées et réfrigérées pendant une nuit, puis bloqués pendant 90 minutes dans 3% d'albumine de sérum bovin dissoute dans le tampon de lavage qui est composée de phosphate de sodium 0,1 M pH 7,4 /NaCl 0,1 M /0,1% p /v de Tween-20. L'anticorps primaire, anticorps monoclonal anti-Lewis X (Signet clone P12) ou anti-Lewis Y (Signet clone F3), dilué à 1: 500 dans un tampon de lavage /1% de BSA, a été ajouté pendant 2 heures, suivi par quatre changements de tampon de lavage. L'anticorps secondaire, une dilution 1: 2500 de raifort conjuguée à la peroxydase de chèvre anti-IgM de souris dans un tampon de lavage /1% de BSA, a été ajouté pendant 90 min, suivi par quatre changements de tampon de lavage. Le substrat chromogène était tétraméthylbenzidine mM 0,42 et 0,02% H 2O 2 dans 50 mM d'acétate /citrate pH 5,5 [46]. Après 15 minutes à température ambiante, la réaction a été arrêtée avec 1 /5ème vol 2,5 N H 2SO 4, et le changement de couleur a été mesurée dans un lecteur de plaque à 450 nm. Dans les contrôles négatifs en omettant soit l'anticorps primaire ou secondaire, ou E. coli
souche HB101 substitué à H. pylori
, changement de couleur a été négligeable (A < 0,05). Les niveaux de Lewis Y étaient négligeables (A < 0,1) dans la souche 26695 ou 43504, de même que les niveaux de Lewis X dans SS1
électrophorétique analyse des lipopolysaccharides de H. pylori
cultures ont été recueillies comme décrit ci-dessus, et on les lave. culots cellulaires ont été stockés à -70 ° C. Les cellules ont été lysées dans 60 mM de Tris HCl, pH 6,8 contenant 2% de SDS à 95-98 ° C pendant 10 min. La teneur en protéines a été mesurée en utilisant l'essai à l'acide bicinchoninique (Pierce). Des échantillons de lysats de cellules ont été ajustées à la teneur en protéines égale (1 mg /ml), puis protéolysée dans des réactions contenant (finale) 60 mM de Tris HCl, pH 6,8, 0,67% de SDS, et 0,67 mg /ml de proteinase K à 60 ° C pendant 2 heures [47]. Afin d'éliminer les artefacts électrophorétiques en raison de la présence de complexes lipide /détergent, des échantillons protéolyse ont été extraites avec du phénol chaud [48]. Des expériences de contrôle ont vérifié que toutes les bandes de LPS ont été récupérés par la procédure d'extraction suivant qualitativement et sans parti pris. protéolysée échantillons ont été mélangés avec 1 volume de phénol à 90% aqueux et on fait incuber à 70 ° C pendant 20 min. Après avoir refroidi à 10 ° C pendant 1 min, les échantillons ont été centrifugés à 12 000 xg
pendant 20 min à 10 ° C et on recueille la phase aqueuse. Les phases phénoliques ont été ré-extraites avec 1 volume de H 2 O à 70 ° C pendant 10 min et centrifugation répétée. Les extraits aqueux combinés ont été ajustés à 0,5 M de NaCl et précipitées avec 10 volumes d'éthanol dans le réfrigérateur pendant une nuit, puis on centrifuge à 20 000 x g
pendant 20 min à 10 ° C et séché à l'air. les échantillons de LPS purifiés ont été redissoutes dans du tampon d'échantillon de Laemmli [49] à 95 ° C pendant 5 min. Les échantillons ont été appliqués à 15% de polyacrylamide /0,9% de bis minigels contenant 3,2 M d'urée avec la formulation discontinue tampon de Laemmli [49], et un gel d'empilement à 5%. Après électrophorèse à 150 V pendant 75 minutes, les gels ont été soit fixés pour la nuit coloration à l'argent [50] ou transférés à polyvinylidène membrane en utilisant le transfert Tris /glycine tampon [51]. Les transferts ont été bloqués pendant la nuit dans 3% d'albumine de sérum bovin et 0,03% de NaN 3 dans le tampon de lavage décrit ci-dessus pour le test ELISA. L'anticorps primaire (anti-Lewis X et anti-Lewis Y, 1: 200) et de l'anticorps secondaire (chèvre conjugué à la peroxydase anti-souris IgM, 1: 1000) ont été dilués dans du tampon de lavage contenant 0,5% de BSA. détection colorimétrique utilisé 3,3'-diaminobenzidine avec du cobalt amélioration [52]. Densitométrie a été réalisée avec le domaine public demande Image J, disponible à l'adresse http:.... Résultats de //rsb infos nih gov /ij
peu est connu sur les rôles physiologiques de cholestérol dans H . pylori
. Pour étudier les réponses de H. pylori
au cholestérol, nous avons adopté, un milieu de culture défini sans sérum, F12 avec 1 mg /ml d'albumine, dans laquelle cette bactérie peut être stable repiqué [26]. Cette modeste concentration d'albumine stimule la croissance [25, 26] et soulage l'adhérence étanche aux surfaces de culture qui se produit dans un milieu exempt de protéines [53]. Dans ce milieu défini, l'addition de 50 pg /ml de cholestérol n'a pas modifié de façon significative le taux de croissance (Figure 2). L'absence d'effets de croissance dans les conditions de culture choisies était avantageuse pour l'étude de l'importance physiologique de cholestérol dans H. pylori
. Ainsi, nous avons pu comparer la colonisation gastrique des gerbilles par la souche SS1 qui avaient été mises en culture dans le milieu défini contenant des quantités variées de cholestérol (Figure 3). Onze jours après l'inoculation par voie orale, H. pylori
dans l'antre gastrique ont été sélectivement plaqué et quantifiée. Est frappant de constater que les gerbilles ont été colonisés par les cultures cultivées dans un milieu contenant du cholestérol, mais pas par H.pylori
cultivées dans un milieu exempt de cholestérol (Dans chaque expérience, P < 0,0001 pour la comparaison de log (UFC /g) entre les groupes à l'aide de Student bilatéral t-test). Par conséquent, le taux de cholestérol est une composante essentielle du milieu de croissance afin d'établir l'infection de H. pylori dans ce modèle animal. Figure 2 Addition de cholestérol vers le milieu défini ne modifie pas le taux de croissance de H. pylori. cultures parallèles de chaque souche ont été cultivées pendant une nuit dans F12 /albumine (1 mg /ml) en l'absence (barres ouvertes) ou en présence (barres ombragée) de 50 pg /ml de cholestérol. La densité de population initiale était de 2 × 106 /ml. Les temps de doublement ont été calculées à partir de l'augmentation mesurée de la biomasse. Les valeurs indiquées représentent la moyenne ± sd de cinq ou plus indépendants mesures. n
. s
. deux queues test t de Student pour les données appariées n'a montré aucune signification statistique.
Figure 3 H. pylori cultivé sans cholestérol ne parviennent pas à coloniser les gerbilles. la souche de H. pylori SS1 a été cultivé pendant une nuit dans un milieu défini contenant 0 ou 50 pg /ml de cholestérol. Les gerbilles ont été inoculés par voie orale avec 3,5 × 108 UFC (expérience A) ou 1 × 108 UFC (expérience B). H. pylori
dans l'antre gastrique ont été quantifiée à 11 jours. Chaque barre verticale représente la moyenne de déterminations en double pour un animal, et les lignes horizontales donnent la médiane pour chaque groupe de traitement. En l'absence de colonies ont été récupérées, les valeurs ont été enregistrées en tant que 5 × 102 UFC /g de tissu, la limite de détection estimée.
Certaines souches de H. pylori
présentait des différences significatives dans le respect des récipients de culture après passage du cholestérol, ce qui suggère altérations de leurs propriétés de surface cellulaire (Hildebrandt & McGee, observations non publiées). Pour cette raison, nous avons décidé d'enquêter sur lipopolysaccharides, qui constituent la principale composante de l'enveloppe cellulaire, et servent à présenter les antigènes biologiquement importants de Lewis. Nous avons utilisé une cellule entière procédure bien établie ELISA pour quantifier les antigènes prédominants de Lewis, Lewis X et Y (figure 4). Conformément à la littérature [54, 55], principalement Lewis X a été détectée dans la souche 26695, seuls Y de Lewis a été détectée dans SS1 et des taux significatifs à la fois ont été détectés dans G27. Dans chaque cas, les lectures d'absorbance étaient non linéaire par rapport à la charge de l'échantillon, un événement qui est pas inhabituel dans les tests ELISA [56], et qui a été noté par d'autres chercheurs qui utilisent ces mêmes anticorps monoclonaux [7]. Ainsi, afin de comparer les niveaux d'antigène dans les échantillons de H. pylori
cultivées en l'absence ou en présence de cholestérol, nous avons effectué des titrages en parallèle sur une plage de charges d'échantillon variant de 20 à 500 ng de protéine cellulaire par puits. Ces titrages ont démontré de manière reproductible une augmentation marquée de la quantité de Lewis X et /ou l'antigène Y de Lewis détecté sur la surface cellulaire lorsque des souches de H. pylori
26695, SS1 ou G27 ont été cultivées en présence de cholestérol (figure 4). Dans des expériences indépendantes répétées, les augmentations moyennes de cholestérol dépendant étaient statistiquement significatives (Tableau 2). Des résultats comparables ont également été obtenus pour Lewis X dans la souche 43504 (données non présentées). Spiking échantillons avec du cholestérol à la fin de la période de croissance ne modifie pas la quantité d'antigène de Lewis détecté par ELISA (figure 5A). Dans une autre expérience de contrôle, nous avons vérifié pour tous les quatre de ces souches que la quantité de protéine cellulaire liée aux puits n'a pas été affectée par la croissance du cholestérol (figure 5B). Le test ELISA résultats ainsi établi que l'augmentation de l'expression de surface de Lewis antigènes est une réponse biologique légitime de cholestérol qui est produite dans toutes les souches testées. Cette réponse était spécifique pour le cholestérol, car la substitution du cholestérol dans le milieu de croissance avec les analogues structuraux de la ß-sitostérol ou du taurocholate de sodium n'a aucun effet sur Lewis X ou de l'expression Y par G27 (figure 4, les panneaux que droite, et dans le tableau 3). La réponse de l'antigène Lewis au cholestérol restait après la rupture du gène de cholestérol α-glucosyltransférase (de
tbc) dans la souche G27 (tableau 2, voir ci-dessous) et 26695 (données non présentées), ce qui exclut la participation de α métabolites -glycoside de cholesterol.Table 2 Amélioration de la surface cellulaire Lewis expression de l'antigène par la croissance des cultures en présence d'cholestérol.Composition

multiplication par rapport à la culture sans cholestérol parallèle

Lewis X
Lewis Y

moyenne ± SEM (n)
valeur P
moyenne ± SEM (n)
valeur de P
26695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
pas fait
SS1
pas fait
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 de type sauvage
2.85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 tbc :: chat
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: chat
2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± 0,43 (7)
0,014
a des antigènes de Lewis ont été quantifiées dans la cellule entière répliquée ELISA analyse des échantillons appariés cultivées en présence ou en l'absence de 50 pg /ml de cholestérol. La charge de l'antigène était de 300 ng protéine cellulaire par puits. Ratios pour plus: moins de cholestérol ont été calculées à partir de double lectures d'absorbance nettes dans chaque essai, et les ratios établis dans cinq à huit essais ELISA indépendants étaient alors en moyenne. Les valeurs de P ont été calculées en deux-tailed t-tests de Student pour l'hypothèse nulle que le rapport est égal à la surface cellulaire 1.
Tableau 3 Enhanced Lewis expression de l'antigène est

fois plus par rapport à la culture sans cholestérol parallèle

Lewis X
Lewis Y


moyenne ± SEM (n)
valeur P
moyenne ± SEM (n)
valeur P

cholestérol
2,96 ± 0,22 (5)
0,0008
2,48 ± 0,10 (4)
0,0007
β- sitostérol
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3) 0,28

taurocholate
0,64 ± 0,16 (4)
0,12
0,84 ± 0,20 (3) 0,52

Lewis antigènes ont été quantifiés dans la cellule entière répliquée analyses ELISA des cultures de H. pylori par paires
G27 cultivées en présence ou en absence de 130 uM de cholestérol, ou concentration égale de β-sitostérol ou le taurocholate de sodium. La charge de l'antigène était de 300 ng protéine cellulaire par puits. Ratios pour plus: moins de cholestérol ont été calculées à partir de double lectures d'absorbance nettes dans chaque essai, et les ratios établis dans trois à cinq essais ELISA indépendants étaient alors en moyenne. Les valeurs de P ont été calculées dans les tests t de Student bilatéral pour l'hypothèse nulle que le rapport est égal à 1.
Figure 4 Croissance du cholestérol améliore spécifiquement l'affichage de la surface cellulaire des antigènes de Lewis. Whole tests ELISA cellulaire ont été effectuées sur des échantillons de H. pylori
souche 26695 (en haut à gauche), SS1 (en bas à gauche) ou G27 (supérieur et inférieur droit). cultures parallèles ont été cultivées pendant une nuit dans un milieu défini contenant 130 uM des ajouts suivants: cercles, pas d'addition; carrés, le cholestérol; triangles, β-sitostérol; X, le taurocholate. Des quantités variables de la suspension cellulaire correspondant à des quantités connues de protéine cellulaire ont été appliqués à des puits en double de plaques ELISA, et immunoassayed pour la présence de l'antigène de Lewis X ou Y de Lewis tel que décrit dans les Méthodes
. échantillons de contrôle négatif de E. coli
HB101, ou tampon uniquement blancs, est tombé sur la ligne pointillée. Les lectures d'absorbance pour les puits individuels sont tracés. Répéter les expériences avec trois ou plus indépendamment grandi cultures ont donné des résultats sensiblement identiques.
Figure 5 expériences de contrôle ELISA. R. Spiking avec le cholestérol à la fin de la période de croissance ne modifie pas l'expression des antigènes de Lewis. Les cultures de H. pylori
ont été cultivées pendant une nuit dans un milieu défini sans (témoin) ou avec 50 ug /ml de cholestérol (cholestérol augmenté). Un troisième ballon (cholestérol supplémentée) a été cultivé en l'absence de cholestérol, refroidi sur de la glace, et une quantité équivalente de cholestérol a été ajouté avant que les cellules ont été récoltées. antigènes de Lewis ont été quantifiées en double exemplaire par cellule entière ELISA, en chargeant 300 protéine cellulaire ng par puits. Ratios pour plus: moins de cholestérol ont été calculés à partir des lectures d'absorbance net moyen dans chaque essai, et les affichages de tracés signifient ratios ± ETM de trois à cinq indépendants ELISA fonctionne. Les valeurs de P ont été calculées dans les tests t de Student bilatéral pour l'hypothèse nulle que le rapport est égal à 1. Pour les comparaisons marquées ns, P > .05. B. liaison des cellules à des plaques ELISA équivalent. Des échantillons de H. pylori
qui ont été cultivées dans des cultures parallèles, en l'absence (barres blanches) ou en présence de 50 pg /cholestérol ml (barres grises) ont été appliqués sur des plaques multipuits de la même manière que pour les essais de Lewis antigène ELISA, en ajoutant 500 ng de protéine cellulaire par puits. Après la fixation du jour au lendemain, les puits ont été lavés deux fois avec un tampon phosphate salin de Dulbecco, puis la protéine dans des cellules adhérentes a été quantifiée en utilisant le réactif BCA. Les valeurs moyennes ± écart-type de puits quadruples sont représentés.
Détection de Lewis du type X et Y par immunotransfert avec les mêmes anticorps monoclonaux produits à un résultat différent (figure 6). Dans plusieurs tentatives en utilisant cette technique, nous ne détectons aucune différence de cholestérol dépendant des niveaux de Lewis X ou Y, à part une petite augmentation de Lewis X 43504 qui était seulement marginalement significative. La procédure de buvardage utilise des échantillons de LPS extraits de lysats cellulaires, et, en principe, doit détecter l'antigène entier piscine Lewis cellulaire, alors que la méthode ELISA de cellules entières est conçu pour détecter seulement que présenté à la surface extracellulaire. La différence entre les résultats intéressants nos analyses ELISA et immunoempreintes suggère un changement de compartimentage cellulaire de l'antigène de Lewis en fonction de la disponibilité du cholestérol dans le milieu de croissance. La figure 6 Lewis X et Y, l'antigène de profilage par immunotransfert. Les échantillons de LPS isolé à partir de cultures parallèles cultivées en l'absence (-) ou en présence (+) de 50 ug /ml de cholestérol ont été résolus sur des gels à 15% d'urée. Les quantités chargées par voie, comme pg de protéine de lysat de départ, sont données dans la partie supérieure de chaque voie. Après le transfert, les antigènes ont été immunodétectés avec des anticorps monoclonaux spécifiques de Lewis X (panneau supérieur) ou Lewis Y (panneau inférieur). Un exemple représentatif de chacun d'eux est représenté. voies latérales contiennent des marqueurs précolorés de protéines (M) ou 400 ng de E. coli O111
: B4 LPS. le signal antigéniques est apparu que dans les régions O-chaîne de souches de ces H. pylori; zones vierges ont été coupées en conséquence. Les immunoempreintes ont été reproduits de manière indépendante avec plusieurs ensembles d'échantillons et densitométrie a été utilisé pour quantifier le signal d'antigène dans chaque voie. Ratios pour pairwise en plus: des échantillons de cholestérol moins ont été calculés et les rapports moyenne ± ETM pour (n) blots sont donnés en bleu. L'hypothèse nulle que le rapport est égal à 1 a été évaluée dans un test t de Student bilatéral.
En plus de Lewis mesure de l'antigène, nous directement comparé les profils de lipopolysaccharide entre les cultures parallèles cultivées en présence ou en absence de cholestérol, en utilisant du gel électrophorèse et coloration à l'argent. Dans toutes les souches de H. pylori of the Nous avons examiné les profils de bandes de LPS étaient identiques entre les cultures cultivées dans un milieu défini avec du cholestérol à celle obtenue dans un milieu contenant du sérum ou sur gélose au sang (données non représentées), et comme prévu [5 , 24, 55, 57] ces profils étaient très spécifique de la souche. Sur ces gels, des bandes de LPS cholestérol-sensibles ont été le plus clairement résolus pour la souche G27, un isolat clinique (figures 7, 8).

• L'utilité de cytokératines 7 et 20 (CK7 /20) immunohistochimie dans la distinction du court segment de l'oesophage de Barrett de métaplasie intestinale gastrique: Est-il fiable
• L'addition d'un gel sensible au pH améliore la stabilité de la micro-émulsion pour le prélèvement ciblé d'ammoniac colonique