Helicobacter pylori lipopolysakkaridi muutos, Lewis antigeeniekspressiota, ja mahalaukun kolonisaatio ovat kolesterolia dependent

Helicobacter pylori
lipopolysakkaridi muutos, Lewis antigeeniekspressiota, ja mahalaukun kolonisaatio ovat kolesterolia riippuvaisia ​​
Abstract
tausta
helikobakteeri
nimenomaan vie kolesteroli ja sisältää sen osaksi bakteerimembraania, mutta vähän tiedetään nykyisin kolesteroli fysiologisia rooleja. Vertasimme fenotyyppejä ja in vivo
kolonisaatiokyky H. pylori
kasvanut määritelty, seerumittomassa kasvualustassa, F12, jossa 1 mg /ml albumiinia, joka sisälsi 0-50 ug /ml kolesterolia.
Tulokset
kaksinkertaistaminen ajat olivat paljolti riippumattoman kolesteroli, muu avoin fenotyyppisiä muutoksia havaittiin. Helikobakteeri
kanta SS1 kasvatettiin määritellyssä alustassa kolesterolin menestyksekkäästi asuttaneet vatsaan gerbiilit, kun taas SS1 kasvatettu ilman kolesterolia epäonnistui asuttaa. Helikobakteeri
lipopolysakkaridi usein näyttää Lewis X ja /tai Y antigeenejä. Expression näiden antigeenien mitattuna koko solun ELISA tehosti merkittävästi vastauksena kasvuun kannan SS1, 26695, tai G27 kolesterolia. Lisäksi elektroforeettinen analyysi lipopolysakkaridin villityypin G27 ja mutanttien, joilta puuttuu O-ketju paljasti rakenteelliset muutokset oligosakkaridiytimen /lipidi A-ryhmät. Nämä vasteet Lewis antigeenin tasoilla ja lipopolysakkaridi profiileja kolesterolin saatavuus olivat erittäin spesifisiä, koska ei tapahtunut muutoksia, kun kolesteroli vaihdettiin β-sitosterolia tai sappisuolojen. Häiriöt koodaavat geenit kolesterolia α-glukosyylitransferaasia tai lipidi A fosfoetanolamiinia transferaasin ei ollut vaikutusta Lewis ilme, eikä niiden lipopolysakkaridi profiileja, eikä kolesterolia reagointikykyä näistä ominaisuuksista. Häiriöt lipidi A 1-fosfataasin geenistä poistetaan vaikutus kolesterolin lipopolysakkaridin profiileja, mutta ei sen vaikutus Lewis ilmentymisen.
Päätelmät
Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että kolesterolin väheneminen johtaa poikkeavaan LPS: n muodoista, jotka ovat riippuvaisia ​​defosforylaatiota lipidi A on 1-asemassa. Alustavan malli havaitut vaikutukset kolesterolin käsitellään jossa peräkkäiset vaiheet lipopolysakkaridia biogeneesiä ja itsenäisesti esittely Lewis antigeenin solun pinnalla, riippuu kalvon koostumuksesta. Nämä uudet havainnot osoittavat, että kolesterolia saatavuus sallii helikobakteeri
muuttamaan solunkuoren tavoilla, jotka voivat vaikuttaa asuttaminen isännän kudoksen in vivo
.
Tausta
Helicobacter pylori
on erittäin kapealla -adapted taudinaiheuttaja, joka elää ihmisen mahalaukussa, lähetetään ensisijaisesti perheitä, ja ei ole tunnettuja ympäristön säiliö. Krooniset infektiot voivat olla oireeton tai aiheuttaa gastriitti, mahahaava, tai mahasyövän. Luoda infektio, bakteeri on hengissä kauttakulkua happaman mahan osasto [1]. Se tunkeutuu ja vahvistetaan asumaan suojaava lima kerros, joka on lipidejä ja kolesterolia rikas ympäristö [2, 3]. Tässä kapealla bakteeri työllistää erilaisia ​​mekanismeja kiertää isännän immuunivastetta.
Lipopolysakkaridit (LPS) pinnalla helikobakteeri
muutetaan näyttämään tiettyjä ihmisen veriryhmäantigeenejä ensisijaisesti Lewis antigeenejä X ja Y [ ,,,0],4-7], ja harvemmin H tyypin 1, i-antigeeni, veriryhmä A, tai Lewis antigeenejä A tai B [8-10]. Nämä pinta-LPS antigeenejä ovat välttämättömiä perustamista infektio, koska mutanttikannat viallisina LPS O-antigeenin synteesi tai Lewis X /Y lauseke eivät asuttaa hiirille [11-13]. On näyttöä siitä, että Lewis antigeenejä ekspressoidaan bakteerin pinnalla osaltaan kiinnittyminen H. pylori
mahalaukun epiteelisolujen [10, 14], ja osansa kudostropismi [15-17]. Mahalaukun epiteelisolut ilmentävät myös Lewis antigeenejä [18, 19], mikä viittaa siihen, että näyttö Lewis-antigeenien bakteerin pinnalla voi toimia mimicry strategiaa. Tutkimukset kliinisistä isolaateista [18, 20] ja koe-eläinten infektioiden [21] tukevat tätä asemaa bakteeri Lewis antigeenejä immuuni kiertämistä. Ihmisen infektio, helikobakteeri
Lewis antigeenejä on liitetty vakavuutta mahahaava ja pohjukaissuolitulehdus [16, 22]. Toinen tärkeä piirre Helikobakteeri
LPS muutetussa lipidi rakenne, joilla on alentunut asylointi- ja vähemmän veloitetaan ryhmiä kuin on tyypillistä enterobakteerit [23]. Nämä lipidi A muutokset minimoidaan endotoksiset ja inflammatoriset ominaisuudet helikobakteeri
LPS (tarkistetaan [24]).
Kolesteroli on tarpeetonta ravintoaine H pylori
, vaikka se edistää kasvua seerumittomassa tiedotusvälineet [ ,,,0],25, 26]. Helikobakteeri
nimenomaisesti sisällytetty kolesteroli osaksi bakteerimembraania [27], kuten myös rajoitettu määrä patogeenisten ja commensal bakteerit kuten Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
., Ja Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Kolesteroli voi vahvistaa kalvon nämä organismit [30-32]. Helikobakteeri
myös ainutlaatuisesti muodostavat kolesterolia α-glykosidin [33, 34], ja tämä metaboliitti voidaan edelleen muokata asyloimalla tai phosphatidylation [34]. Alfa-glukoitua kolesterolin heikentävät isännän immuunivasteen bakteerin hiirimallissa, kautta tukahduttaminen fagosytoosia ja T-solujen aktivaation [35]. Muut roolit kolesteroli ja kolesterolin aineenvaihduntatuotteiden bakteerimembraania ovat vielä löytäjäänsä. Tässä raportissa, osoitamme, että biosynteesin lipopolysakkaridin, mukaan lukien Lewis antigeeniekspressiota ja LPS core /lipidi A muutos, muuttuvat, saatavuus kolesterolin kasvualustan. Esitämme data osoittaa, että nämä muutokset solun kirjekuoren voi vaikuttaa merkittävästi taudinaiheuttaja /isäntä vuorovaikutus eläinmallissa infektion. Tool Menetelmät
Bakteerikannat ja kasvuolosuhteet
kantoja H pylori
sisältyi laboratoriokannan ATCC43504 (alkuperä: Australia), 26695 (UK), kliininen isolaatti G27 (Italia [36], edellyttäen N. Salama), ja hiiren mukautettu kannan SS1 (Australia, edellyttäen Adrian Lee [37]). Bakteerit pidettiin 37 ° C: ssa mikroaerobisen ilmakehässä 5% O 2/10% CO 2 kampylobakteerin veriagar (CBA). Bakteerit siirrostettiin välein 2-3 päivää, ja enintään 25 päivää, minimoida geneettinen ajautuminen. Kasvun kemiallisesti määritellyssä alustassa [26], bakteerit ympättiin CBA osaksi kudosviljelypulloihin, jotka sisältävät Hamin F12 (Gibco), 1 mg /ml naudan seerumin albumiinia (rasvahappo-vapaata, Sigma A7906), johon viitataan kaikkialla määritelty väliaine. Nestemäisiä viljelmiä siirrostettiin päivittäin laimentamalla tuoreeseen alustaan ​​alkuperäisen tiheydet 1-2 x 10 6 /ml ja käytetään kanavan 3 5. Soluviljely luokka kolesterolia (> 99%, Sigma) lisättiin F12 vakaana 10 x emulsio, joka sisältää 500 ug /ml kolesterolia dispergoitiin 10 mg /ml albumiinia, joka oli valmistettu julkaisun [38]. Seuraavia elatusaineita lisäykset suoritettiin samalla tavalla: p-sitosterolia (synteettinen, 95%), natriumtaurokolaatti, natriumglykokolaatti, β-estradioli, progesteroni (kaikki Sigmalta), dehydroepiandrosterone (Calbiochem), ja β-koprostanoli (Matreya) .
Kahdentumisajat määritettiin aikana logaritmisessa kasvuvaiheessa määrän määrittäminen eläviin soluihin käyttämällä Cell Titer Glo-reagenssia (Promega) kuin validoitu ja kuvattu [39]. Mittaus biomassaa CFU, kuin solun tai ATP ovat kaikki tuotettu johdonmukaisia ​​tuloksia. Arvo 1 attomol ATP solua kohti [40] oletettiin tavanomaisesta kulkua. Mahdollinen epätarkkuus tämä arvo ei pohjimmiltaan vaikuta tietojen tulkinnassa.
Isogeenisiin geenin häiriöitä saavutettiin insertoimalla Campylobacter coli -bakteerien
kloramfenikoliresistenssi elementti (kissa
) strategian mukaisesti kuvanneet Chalker et al
[41]. Alukkeet huolellisesti suunniteltu niin, että kohdesekvenssin sisällä avointa lukukehystä, ja ne on lueteltu taulukossa 1. Fuusio-PCR-reaktioissa käyttäen PCR Extender System (5Prime) sisälsi 2,3 nM kutakin geelipuhdistettiin malli, 50 uM aluketta, 1 x viritys puskuria, 1,25 mmol ylimääräinen Mg ++, 0,2 mM kutakin dNTP: tä, ja 0,01 U /ul polymeraasia. Sulkujaksolla olosuhteet olivat seuraavat: 94 ° C 2,5 min, 10 sykliä [94 ° C 15 sekuntia, 45 ° C 60 sekuntia, 68 ° C 60 sekuntia per kb], 25 sykliä [94 ° C 15 sekuntia, alukkeen-specific Tm 30 sekuntia, 68 ° C 60 sekuntia per kb], lopullinen pidennys 68 ° C 6-8 min. Fusion tuotteet monistettiin uudestaan ​​Pfx50 (Invitrogen) lisätä määrä, puhdistettiin sitten käyttäen Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Resipienttikantoina kasvatettu 1 päivä CBA transformoitiin 500 ng lopullisen amplikonin käyttäen luonnon transformaatio [42, 43], jota seurasi valinta 7-10 päivää CBA, joka sisälsi 15 ug /ml kloramfenikolia. Varmistaa alleelinen vaihto, tuloksena kannoista arvioitiin PCR: llä genomisesta DNA: sta käyttäen GoTaq (Promega) alukkeiden kanssa, taulukossa 1 PCR-strategiaa ja tulokset on esitetty kuviossa 1.Table 1 Alukesekvenssit.
alukkeina alleelinen häiriöiden

CAT fwd [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5B
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
LPXe fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
lisäksi alukkeet vahvistus-geenin rikkoutumisen
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective geenin numerot julkisista tietokannoista 26695 ja G27 ovat seuraavat: [cgt: hp0421, G27_952
], [pmi
(rfbM
): hp0043, G27_38
], [LPXe: hp0021, G27_20
], [EPTA: hp0022, G27_21
].
bRighthand sarakkeessa luetellaan lyhyt pohjamaali käytettävien nimitysten kuvassa 1.
Kuva 1 PCR todentaminen alleeliset häiriöistä helikobakteeri kannan G27. Genominen DNA valmistettiin geeni-häiriintyy G27 kannoista kolme kanavaa alle kloramfenikoli valintaa, monistettiin PCR: llä, kuten on esitetty kussakin järjestelmässä. Alukkeita sekvenssit on esitetty taulukossa 1. A. Häiriöt cgt. Viisi esimerkkiä on esitetty seitsemästä Yksittäisten kloonien, jotka kaikki antoivat identtiset tulokset näytössä. B. Häiriöt PMI (rfbM). Koko kloramfenikoliresistenttien väestön läpivietiin kullakin valintakierroksella, ilman kloonivalinnan. C. Häiriöt LPXe ja EPTAn. Koko kloramfenikoliresistenttien väestön läpivietiin kullakin valintakierroksella, ilman kloonivalinnan.
Mahalaukun kolonisaation
Eläinkokeet oli hyväksynyt LSUHSCS Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Nainen Mongolian gerbiilit pidettiin tavalliseen ruokavalioon halun
. Jos haluat säilyttää liikkuvuus, helikobakteeri
kanta SS1 viljeltiin yön yli mikroaerobisissa olosuhteissa T75 pulloihin, jotka sisälsivät 40 ml F12-viljelyalustaa 0,4 mg /ml albumiinia ja 0 tai 50 ug /ml kolesterolia. Huomata liikkuvat planktonic bakteerit otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen isotoniseen suolaliuokseen. Pesäkkeitä muodostavien yksiköiden (CFU) mitattiin näiden siirrosten sarjalaimennuksella ja maljaamalla CBA, ja nämä mittaukset vahvistivat yhtä suuri annos elävien bakteereiden kahden kasvuolosuhteissa. Noin 10 8 CFU per 30 ui annettiin suun kautta eläimille (n = 6-9 ryhmää kohden). Eläimet lopetettiin 11 päivää myöhemmin, ja mahat poistettiin ja leikattiin. H. pylori
läsnä mahan antrum Homogenaatteja kvantitoitiin sarjalaimennuksella ja maljaamalla CBA, joka sisälsi 5-fluorosytosiinin (5 ug /ml), vankomysiiniä (10 ug /ml), amfoterisiini B: tä (5 ug /ml), basitrasiinia ( 30 ug /ml), polymyksiini B: tä (10 U /ml), ja trimetopriimi (10 ug /ml) [44]. Monista CFU määritykset tehtiin useita laimennuksia kustakin kudosnäytteestä.
Kokosolun ELISA
vakiomenettelyjä [6, 7, 45], jotka on sovitettu käytössä peroksidaasiin konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella. Kaikki vasta-aineet saatiin yhtiöstä Calbiochem. Yli yön viljelmiä bakteerit kerättiin sentrifugoimalla 3500 x g
10-15 min, pestiin Dulbeccon fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, ja pelletoitiin 10000 x g
2 min, sitten resuspendoitiin 15% glyserolia /0,9% NaCl. Solususpensiot analysoitiin proteiinipitoisuus ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Cell sisältävät näytteet tunnettuja määriä proteiinia nopeasti laimennettiin 50 mM natriumbikarbonaattia /karbonaattia, pH 9,55 ja annosteltiin välittömästi kuoppiin ELISA-levyn (Costar΅7). Levyt suljettiin ja jäähdytettiin yön yli, sitten blokattiin 90 min 3% naudan seerumin albumiinia liuotettiin pesupuskuria, joka koostui 0,1 M natriumfosfaatti, pH 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% paino /tilavuus Tween-20. Primaarisen vasta-aineen, monoklonaalisen anti-Lewis X (Signet klooni P12) tai anti-Lewis Y (Signet klooni F3), joka oli laimennettu 1: 500 pesupuskuriin /1% BSA: ta, lisättiin 2 tunnin ajan, minkä jälkeen neljä muutosta pesupuskuria. Toissijainen vasta-aine, 1: 2500 laimennos piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgM-pesupuskurissa /1% BSA: ta, lisättiin 90 min, jota seurasi neljä muutosta pesupuskuria. Kromogeenisubstraattia oli 0,42 mM tetrametyyli- ja 0,02% H 2O 2 50 mM asetaatti /sitraattia, pH 5,5 [46]. 15 minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa, reaktio pysäytettiin 1/5-tilavuus 2,5 N H 2SO 4, ja värin muutos mitattiin levylukijalla 450 nm: ssä. Vuonna negatiiviset kontrollit jättämällä pois joko primaarinen tai sekundaarinen vasta-aine, tai E. coli
HB101 korvata Helikobakteeri
, värin muutos oli vähäinen (A < 0,05). Tasot Lewis Y oli erittäin vähäistä (A < 0,1) Kannassa 26695 tai 43504, samoin kuin Lewis X tasoilla SS1.
Elektroforeettinen analysointi lipopolysaccharides
helikobakteeri
Viljelmät kerättiin edellä kuvatulla tavalla, ja pesty solupelletit säilytettiin -70 ° C: ssa. Solut lyysattiin 60 mM Tris HCI, pH 6,8, joka sisälsi 2% SDS 95-98 ° C: ssa 10 min. Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen bikinkoniini- happo-määrityksellä (Pierce). Näytteet solulysaatteja säädettiin yhtä suuri proteiinipitoisuus (1 mg /ml), sitten proteolysoidun reaktioissa, jotka sisältävät (lopullinen) 60 mM Tris-HCI, pH 6,8, 0,67% SDS, ja 0,67 mg /ml proteinaasi K: ta 60 ° C: ssa 2 tuntia [47]. Poistamaan elektroforeettisen esineitä läsnäolon takia rasva /pesuainetta komplekseja, proteolysoidun näytteet uutetaan kuumalla fenoli [48]. Ohjaus kokeita tarkistanut, että kaikki LPS-bändit saatiin talteen seuraavien uuttomenetelmä laadullisesti ja ilman ennakkoluuloja. Proteolysoidun näytteet sekoitettiin 1 tilavuus 90%: ista fenolia ja inkuboitiin 70 ° C: ssa 20 min. Kun oli jäähdytetty 10 ° C: ssa 1 min, näytteitä sentrifugoitiin 12000 x g
20 minuutin ajan 10 ° C: ssa, ja vesipitoinen faasi kerättiin. Fenoli- faasit uutettiin uudelleen 1 tilavuus H 2O 70 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja sentrifugoimalla toistetaan. Yhdistetyt vesipitoiset uutteet säädettiin 0,5 M NaCl ja saostetaan 10 tilavuusprosenttia etanolia jääkaapissa yön yli, sitten sentrifugoitiin 20000 x g
20 minuutin ajan 10 ° C: ssa ja kuivattiin ilmassa. Puhdistettu LPS-näytteet liuotettiin uudelleen Laemmli-näytepuskuriin [49] 95 ° C: ssa 5 min. Näytteet laitettiin 15% polyakryyliamidi /0,9% bis minigeeleissä joka sisälsi 3,2 M ureaa kanssa Laemmli epäjatkuva puskuriformulaatiossa [49], ja 5%: -vertailugeeliä. Elektroforeesin jälkeen 150 V 75 min, geelit joko kiinteitä yön yli hopeavärjäysproto- [50] tai siirtää polyvinylidenedifluoride kalvo käyttäen Tris /glysiini siirtopuskuriliuoksessa [51]. Blotit tukossa yön yli 3% naudan seerumialbumiinia ja 0,03% NaN 3. pesupuskurissa edellä kuvattua ELISA. Primaarista vasta-ainetta (anti-Lewis X ja anti-Lewis Y, 1: 200) ja sekundaarista vasta-ainetta (peroksidaasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri IgM: ää, 1: 1000) laimennettiin pesupuskuria, joka sisälsi 0,5% BSA: ta. Kolorimetrisesti käytetään 3,3'- diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia kanssa koboltti parannuksen [52]. Densitometria suoritettiin julkisia sovellus Image J, saatavilla osoitteessa http: //RSB. Info. NIH. Gov /ij.
Tulokset
tiedetään vain vähän fysiologista rooleista kolesterolin H . pylori
. Tutkia vasteita helikobakteeri
kolesteroli, hyväksyimme määritelty, seerumittomassa elatusaineessa F12 1 mg /ml albumiinia, jossa tämä bakteeri voi olla pysyvästi kuljetettiin [26]. Tämä vaatimaton keskittyminen albumiinin tukee kasvua [25, 26] ja lievittää tiukka noudattaminen kulttuurin pinnat esiintyy proteiinia alustassa [53]. Tässä määritellyssä alustassa, lisäämällä 50 ug /ml kolesterolia ei merkittävästi muuttanut kasvu (kuvio 2). Puuttuminen kasvun vaikutusten valituissa viljelyolosuhteissa oli edullista tutkimus fysiologisten merkitys kolesterolin helikobakteeri
. Siten pystyimme vertailemaan mahalaukun kolonisaatiota gerbiilit Kannan SS1 joka oli viljelty rajatulla alustalla, joka sisälsi vaihtelevia määriä kolesterolia (kuva 3). Yksitoista päivää suun kautta ymppäyksen helikobakteeri
mahalaukun antrum valikoivasti päällystetty ja kvantitoidaan. Silmiinpistävän gerbiilit olivat asuttaneet vain viljelmiä kasvatettiin kolesterolia sisältävässä väliaineessa, mutta ei helikobakteeri
kasvatettu kolesterolia väliaineessa (Kussakin kokeessa P < 0,0001 vertailussa log (CFU /g) ryhmien välillä käyttämällä Studentin kaksisuuntaista t-testi). Siksi kolesteroli oli olennainen osa kasvualustan selvittääkseen H. pylori
infektion tässä eläinmallissa. Kuva 2 Lisäys kolesterolin määriteltyyn väliaine ei vaikuta helikobakteeri kasvuvauhtia. Parallel viljelmiä kummastakin kannasta kasvatettiin yön yli F12 /albumiini (1 mg /ml) puuttuessa (avoimet pylväät) tai läsnä ollessa (varjostetut pylväät) ja 50 ug /ml kolesterolia. Alkuperäinen asukastiheys oli 2 x 106 /ml. Kaksinkertaistumisaikaa laskettiin mitatusta kasvua biomassan. Arvot esitetään edustavat keskiarvoa ± sd vähintään viisi riippumatonta mittausta. n
. s
. Opiskelijan kaksisuuntainen t-testi pairwise tiedot osoittivat tilastollisesti merkitseviä.
Kuvio 3 H. pylori kasvatettu ilman kolesterolia eivät asuttaa gerbiilit. Helikobakteeri
kanta SS1 kasvatettiin yön yli määritellyssä elatusaineessa, joka sisälsi 0 tai 50 ug /ml kolesterolia. Gerbiileille suullisesti inokuloitiin 3,5 × 108 CFU (koe A) tai 1 x 108 CFU (koe B). Helikobakteeri
mahalaukun antrum määrä määritettiin 11 päivää. Jokainen pystypalkki edustaa kahden rinnakkaisen määrityksen keskiarvoa yhden eläimen ja vaakaviivat antaa mediaani kussakin testiryhmässä. Jos ei pesäkkeet otettiin talteen, arvot kirjataan 5 × 102 PMY /g kudosta, arvioitu toteamisraja.
Tietyt kannat helikobakteeri
näytteillä merkittäviä eroja noudattamista kulttuurin aluksille passage kolesteroli, mikä viittaa muutoksia niiden solun pinnan ominaisuuksien (Hildebrandt & McGee, julkaisemattomia havaintoja). Tästä syystä päätimme tutkia lipopolysaccharides, jotka muodostavat pääasiallisen komponentin solun kirjekuoren, ja palvella esittää biologisesti tärkeiden Lewis antigeenejä. Käytimme vakiintunut kokosolu-ELISA-menetelmä kvantitoimiseksi hallitseva Lewis-antigeenit, Lewis X ja Y (kuvio 4). Mukaisesti kirjallisuudessa [54, 55], ensisijaisesti Lewis X havaittiin kannan 26695, vain Lewis Y havaittiin SS1, ja merkittäviä määriä sekä havaittiin G27. Kussakin tapauksessa absorbanssilukemia olivat epälineaarinen suhteessa näyte kuorman, tapahtumaa, joka ei ole epätavallista ELISA-menetelmällä [56], ja että on todettu toiset tutkijat käyttävät näitä samoja monoklonaalisia [7]. Niinpä, jotta verrata antigeenin tasot näytteitä H. pylori
viljeltiin ilman tai läsnäolo kolesteroli, suoritimme rinnakkain titraustuloksiin laajalla näytteen kuormitukset vaihtelevat 20-500 ng solun proteiinia kuoppaa kohti. Nämä titrauksessa toistettavasti osoitti selvästi lisääntynyt määrä Lewis X ja /tai Lewis Y antigeenin havaitaan solun pinnalla, kun helikobakteeri
kannat 26695, SS1 tai G27 viljeltiin läsnä ollessa kolesteroli (kuva 4). Kaksoiskokeina itsenäisen kokeen keskiarvo kolesterolia riippuvaisia ​​nousuja olivat tilastollisesti merkittäviä (taulukko 2). Vastaavia tuloksia on saatu myös Lewis X-kannan 43504 (tuloksia ei ole esitetty). Lisäystasot näytteitä kolesterolin lopussa kasvun aikana ei muuttanut määrä Lewis-antigeeni havaitaan ELISA: lla (kuvio 5A). Eräässä toisessa ohjaus kokeessa me todentaa kaikki neljä näistä kannoista, että määrä solun proteiini sitoutui kuoppiin ei vaikuttanut kasvu kolesteroli (kuvio 5B). ELISA-tuloksia siten, että kasvanut pinta-ilmentyminen Lewis-antigeenien oli oikeutettu biologisen vasteen kolesteroli, joka tapahtui kaikissa testatuista kannoista. Tämä vastaus oli spesifinen kolesteroli, koska korvaaminen kolesterolin kasvualustaan ​​rakenteellisten analogien-sitosterolia tai natriumtaurokolaatti ei ollut vaikutusta Lewis X tai Y ilmentymisen G27 (kuva 4, oikea- paneelit, ja taulukko 3). Lewis antigeeni vastaus kolesteroli pysyi edelleen rikkomisen jälkeen geenin kolesterolia α-glukosyylitransferaasia (cgt
) kannassa G27 (taulukko 2, ja katso alla) ja 26695 (tuloksia ei ole esitetty), sulje pois osallistumista α glykosidi aineenvaihduntatuotteet cholesterol.Table 2 Enhancement solun pinnan Lewis antigeeniekspressiota kasvusta kulttuurien läsnäollessa cholesterol.a

kertainen lisäys verrattuna rinnakkain kolesteroliton kulttuuri

Lewis X
Lewis Y

keskiarvo ± SEM (n)
P-arvo
keskiarvo ± SEM (n)
P-arvo
26695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
ole tehnyt
SS1
ole tehnyt
1,88 ± 0,08 (5) B 0,0004
G27 villityypin
2,85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8) B 0,0016
G27 tasattua :: kissa
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 LPXe :: kissa
2,59 ± 0,50 (6) B 0,025

2,47 ± 0,43 (7) B 0,014
Lewis-antigeenit kvantitoitiin rinnakkaisia ​​koko solun ELISA-analyysit pariksi näytteitä kasvatettiin läsnä tai poissa ollessa 50 ug /ml kolesterolia. Antigeeni kuormitus oli 300 ng solun kuoppaa kohti. Tunnusluvut plus: miinus kolesteroli laskettiin kahtena netto absorbanssilukemia jokaisessa määrityksessä, ja suhteet määritettiin viisi vaille kahdeksan itsenäistä ELISA nousuja sitten keskiarvo. P-arvot laskettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testit hypoteesia, että suhde on yhtä suuri kuin 1.
Taulukko 3 Enhanced solun pinnalla Lewis-antigeenin ekspressio on kolesterolia erityinen

kertainen lisäys verrattuna rinnakkain kolesteroliton kulttuuri

Lewis X
Lewis Y


keskiarvo ± SEM (n)
P-arvo
keskiarvo ± SEM (n)
P-arvo

kolesteroli
2,96 ± 0,22 (5)
0,0008
2,48 ± 0,10 (4) B 0,0007
β- sitosterolin
1,80 ± 0,47 (4) B 0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0.28
taurokolaatti
0,64 ± 0,16 (4) B 0,12
0,84 ± 0,20 (3)
0,52
Lewis antigeenejä kvantitoitiin rinnakkaisia ​​koko solun ELISA-analyysit pairwise viljelmistä H. pylori
G27 kasvatettiin läsnä tai poissa ollessa 130 uM kolesterolia, tai yhtä suuri pitoisuus β-sitosterolia tai natriumtaurokolaatti. Antigeeni kuormitus oli 300 ng solun kuoppaa kohti. Tunnusluvut plus: miinus kolesteroli laskettiin kahtena netto absorbanssilukemia jokaisessa määrityksessä, ja suhteet määritettiin kolmesta viiteen riippumatonta ELISA nousuja sitten keskiarvo. P-arvot laskettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testit hypoteesia, että suhde on yhtä suuri kuin 1.
Kuva 4 kasvu kolesteroli nimenomaan parantaa solun pinnalla näyttö Lewis antigeenejä. Kokosolu-ELISA-määritykset suoritettiin näytteillä H.pylorin
kannan 26695 (ylhäällä vasemmalla), SS1 (alhaalla vasemmalla), tai G27 (ylempi ja alempi oikea). Parallel viljelmiä kasvatettiin yön yli määritellyssä elatusaineessa, joka sisälsi 130 uM seuraavia lisäyksiä: piireissä, ei lisäystä; neliöt, kolesteroli; kolmiot, β-sitosterolia; X, taurokolaatti. Vaihtelevia määriä solususpensiota, joka vastaa tunnettuja määriä solun levitettiin kahtena ELISA-levyjen kuoppiin, ja immunoassayed läsnäolo Lewis X: n tai Lewis Y antigeenin, kuten on kuvattu menetelmät
. Negatiivisia valvontanäytteitä E. coli
HB101 tai puskuri vain aihioita, putosi katkoviiva. Absorbaatiolukemat yksittäisissä kuopissa piirretään. Toista kokeiluja kolmella tai useammalla itsenäisesti kasvanut kulttuureissa ovat tuottaneet pääosin samat tulokset.
Kuva 5 ELISA ohjaus kokeita. A. pisteväkevöimällä kolesteroli lopussa Kasvujakson ei muuta Lewis antigeeniekspressiota. Cultures of Helikobakteeri
kasvatettiin yön yli määritellyssä elatusaineessa ilman (kontrolli) tai 50 ug /ml kolesterolia (kolesteroli kasvatettu). Kolmas pulloon (kolesteroli piikki) kasvatettiin ilman kolesterolia, jäähdytettiin jäillä, ja vastaava määrä kolesterolia, lisättiin ennen kuin solut kerättiin. Lewis antigeenejä kvantitoitiin kahtena kappaleena koko solun ELISA, lastaus 300 ng solun kuoppaa kohti. Tunnusluvut plus: miinus kolesteroli laskettiin keskiarvo netto absorbanssilukemia jokaisessa määrityksessä, ja juoni näyttää keskimääräiset suhteet ± sem kolmesta viiteen itsenäistä ELISA kulkee. P-arvot laskettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testit hypoteesia, että suhde on yhtä suuri kuin 1. vertailuja merkitty ns, P > 0,05. B. Vastaava sitoutumisen solujen ELISA-levyille. Näytteet H. pylori
että kasvatettiin rinnakkain kulttuureissa puuttuessa (valkoiset pylväät) tai läsnä oli 50 ug /ml kolesterolia (harmaat pylväät) laitettiin monikuoppalevyille samalla tavalla kuin Lewis-antigeeni ELISA-määrityksissä, lisäämällä 500 ng solun kuoppaa kohti. Yön yli kiinnitys, kuopat pestiin kahdesti Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, sitten proteiini kiinnittyneet solut kvantitoitiin käyttäen BCA-reagenssia. Keskiarvoja ± SD neljän rinnakkaisen kaivot on esitetty.
Detection of Lewis X ja Y immunoblottauksella samalla monoklonaalisia vasta-aineita on tuotettu eri tuloksen (kuvio 6). Useissa yritetty käyttää tätä tekniikkaa, emme havaitse mitään kolesterolia riippuvaisia ​​eroja Lewis X tai Y tasoja, lukuun ottamatta pientä lisäystä Lewis X 43504, joka oli vain marginaalisesti merkitsevä. Lyysimenettelyn palveluksessa LPS näytettä uutetaan solulysaateista, ja periaatteessa pitäisi havaita koko solun Lewis antigeeni allas, kun taas koko solun ELISA-menetelmää on suunniteltu havaitsemaan vain joka esitellään solunulkoiseen pinnalla. Mielenkiintoinen ero tulosten välillä ELISA-analyysit ja immunoblot ehdottaa muutosta solun osastointi Lewisin antigeenin riippuen saatavuudesta kolesterolin kasvualustan. Kuva 6 Lewis X ja Y antigeenin profilointia immunoblottauksella. Näytteet eristetty LPS rinnakkaisia ​​viljelmiä kasvatettiin ilman (-) tai läsnä ollessa (+), 50 ug /ml kolesterolia erotettiin 15% ureaa geelejä. Määrät ladattiin kaistaa kohti, kuten ug alkuperäisen lysaatin proteiinia, annetaan yläosassa kunkin kaistan. Siirron jälkeen antigeenejä immunologisesti monoklonaalisia vasta-aineita spesifisiä Lewis X (ylempi kuva) tai Lewis Y (alempi kuva). Tyypillinen esimerkki ryhmästä kukin on esitetty. Side kaistat sisältävät edeltäkäsin värjätyt proteiinimarkkereita (M) tai 400 ng E. coli
O111: B4 LPS. Antigeenisia signaali esiintyi vain O-ketjun alueisiin Näiden helikobakteeri
kantoja; tyhjät alueet ovat rajattu pois vastaavasti. Immunoblottauksia olivat itsenäisesti toistettu useita näytejoukoille ja densitometrisesti käytettiin kvantitointiin antigeenin signaali kussakin vyöhykkeessä. Tunnusluvut pareittain plus: miinus kolesteroli näytteet laskettiin, ja keskimääräiset suhteet ± SEM (n) blotteja esitetään sinisellä. Hypoteesi, että suhde on yhtä suuri kuin 1 arvioitiin kaksisuuntaista Studentin t-testi.
Lisäksi Lewis antigeenin mittaukseen, me suoraan verrata lipopolysakkaridin profiilit rinnakkaisten viljelmiä kasvatettiin läsnä ollessa tai ilman kolesterolia, käyttäen geeliä elektroforeesi ja hopeavärjäyksellä. Kaikki H. pylori
kantoja olemme tutkineet, LPS band profiilit olivat identtisiä välillä viljelmiä kasvatettiin määritellyssä elatusaineessa, jossa kolesteroli, joka on saatu seerumia sisältävässä väliaineessa tai veriagar (tuloksia ei ole esitetty), ja odotetusti [5 , 24, 55, 57] nämä profiilit olivat suuresti kannasta erityinen.

• Hyödyllisyyttä sytokeratiineja 7 ja 20 (CK7 /20) immunohistokemia ero lyhyen segmentin Barrett ruokatorven mahalaukun suoliston metaplasiaa: Onko se luotettava?
• Lisäämällä pH-herkän geeli parantaa mikroemulsion vakautta suunnattu poistamiseksi paksusuolen ammoniakin