Helicobacter pylori lipopolysaccharid modifikation, Lewis-antigenekspression, og gastrisk kolonisering er cholesterol-afhængige

Helicobacter pylori
lipopolysaccharid modifikation, Lewis antigenudtryk, og gastrisk kolonisering er kolesterol-afhængige
Abstract
Baggrund
Helicobacter pylori
specifikt optager kolesterol og indarbejder det i den bakterielle membran, men lidt er øjeblikket kendskab kolesterol fysiologiske roller. Vi sammenlignede fænotyper og in vivo
etableringsevne af H. pylori
dyrket i et defineret, serumfrit vækstmedium, F12 med 1 mg /ml albumin indeholdt fra 0 til 50 ug /ml cholesterol.
Resultater
Mens fordobling tider var stort set upåvirket af kolesterol, der blev observeret andre åbenlyse fænotypiske ændringer. H. pylori
stamme SS1 dyrket i defineret medium med kolesterol held koloniseret maven af ​​ørkenrotter, mens SS1 dyrket uden kolesterol undladt at kolonisere. H. pylori
lipopolysaccharid ofte viser Lewis X og /eller Y-antigener. Ekspression af disse antigener målt ved helcelle-ELISA blev markant forøget som respons på væksten af ​​stamme SS1, 26.695, eller G27 i kolesterol. Desuden elektroforetisk analyse af lipopolysaccharid i vildtype G27 og i mutanter, der mangler den O-kæden afslørede strukturelle ændringer inden for de oligosaccharid kerne /lipid A-dele. Disse svar i Lewis antigen niveauer og i lipopolysaccharid profiler til kolesterol ledighed var meget specifik, fordi ingen ændringer fandt sted, da kolesterol blev udskiftet med beta-sitosterol eller galdesalte. Afbrydelse af de gener, der koder for cholesterol α-glucosyltransferase eller lipid A phosphoethanolamin transferase havde ingen virkning på Lewis-ekspression, eller af lipopolysaccharid profiler, ej heller om kolesterol reaktionsevne disse egenskaber. Afbrydelse af lipid A 1-phosphatase-gen elimineres virkningen af ​​kolesterol på lipopolysaccharid profiler men ikke dets virkning på Lewis-ekspression.
Konklusioner
Tilsammen tyder disse resultater på, at kolesterol udtynding fører til afvigende former af LPS der er afhængige af dephosphorylering af lipid A i 1-positionen. En tentativ model for de observerede virkninger af cholesterol er diskuteret i hvilken sekventielle trin lipopolysaccharid biogenese og uafhængigt præsentation af Lewis-antigen ved celleoverfladen, afhænge af membranen sammensætning. Disse nye resultater viser, at kolesterol tilgængelighed tillader H. pylori
at ændre sin celle kuvert på måder, der kan påvirke kolonisering af værtsvæv in vivo
.
Baggrund
Helicobacter pylori
er en meget niche -Bearbejdet patogen, der bebor den menneskelige mave, overføres primært inden for familier, og har ingen kendt miljømæssig reservoir. Kroniske infektioner kan være asymptomatiske eller forårsage gastritis, mavesår, eller gastrisk cancer. At etablere infektion, skal bakterien overleve transit gennem den sure gastrisk rum [1]. Det trænger og etablerer bopæl i den beskyttende slim lag, et lipid- og kolesterol-rige miljø [2, 3]. Inden for denne niche bakterien beskæftiger en række mekanismer til at unddrage sig værtens immunrespons.
Lipopolysaccharider (LPS) på overfladen af ​​H. pylori
ændres til at vise visse menneskelige blodtypeantigener primært Lewis antigener X og Y [ ,,,0],4-7], og mindre hyppigt H type 1, i-antigen, blodtype A, eller Lewis-antigener A eller B [8-10]. Disse overfladen LPS antigener er nødvendige for etablering af infektion, fordi mutante stammer defekte for LPS O-antigen syntese eller for Lewis X /Y udtryk undlader at kolonisere mus [11-13]. Der er beviser for, at Lewis antigener udtrykkes på den bakterielle overflade bidrager til adhærens af H. pylori
til gastriske epitelceller [10, 14], og spiller en rolle i vævstropisme [15-17]. Gastriske epitelceller udtrykker også Lewis-antigener [18, 19], hvilket antyder, at visningen af ​​Lewis-antigener på den bakterielle overflade kan tjene som en mimicry strategi. Undersøgelser af kliniske isolater [18, 20] og eksperimentelle infektioner hos dyr [21] støtter denne rolle for bakteriel Lewis antigener i immune skatteunddragelse. I human infektion har H. pylori
Lewis-antigener været knyttet til sværhedsgraden af ​​mavesår og duodenitis [16, 22]. Et andet vigtigt træk ved H. pylori
LPS sin lipid En struktur, med reduceret acylering og færre ladede grupper end det er typisk for enterobakterier [23]. Disse lipid A modifikationer minimere endotoksiske og inflammatoriske egenskaber af H. pylori
LPS (revideret i [24]).
Kolesterol er en ikke-essentiel næringsstof for H pylori
, selvom det fremmer væksten i serumfrit medium [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
specifikt inkorporere cholesterol i det bakterielle membran [27], som gør et begrænset antal patogene og kommensale bakterier, herunder Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
., Og Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Kolesterol kan styrke membranen i disse organismer [30-32]. H. pylori
også entydigt danner kolesterol α-glycosid [33, 34], og denne metabolit kan yderligere modificeres ved acylering eller phosphatidylering [34]. Alpha-glucosyleret kolesterol undergraver vært immunrespons på bakterien i en musemodel, gennem undertrykkelse af fagocytose og T-celle-aktivering [35]. Andre roller for kolesterol og kolesterol metabolitter i den bakterielle membran er endnu at blive udforsket. I denne rapport, viser vi, at biosyntesen af ​​lipopolysaccharid, herunder Lewis-antigenekspression og LPS-kernen /lipid A modifikation, er ændret ved tilgængeligheden af ​​cholesterol i vækstmediet. Vi præsenterer data, der indikerer, at disse ændringer i cellen kuvert kan influere betydeligt på patogen /vært interaktion i en dyremodel for infektion.
Metoder
Bakteriestammer og vækstbetingelser
Stammer af H pylori
omfattede laboratorie stammen ATCC43504 (oprindelse: Australien), 26.695 (UK), klinisk isolat G27 (Italien [36], leveret af N. Salama), og musen tilpasset stammen SS1 (Australien, leveret af Adrian Lee [37]). Bakterier blev opretholdt ved 37 ° C i en mikroaerob atmosfære af 5% O 2/10% CO 2 på Campylobacter blodagar (CBA). Bakterier blev passeret hver 2 til 3 dage, og i ikke mere end 25 dage, for at minimere genetisk drift. For vækst i kemisk defineret medium [26], blev bakterier podet fra CBA i vævskulturkolber indeholdende Hams F12 (Gibco) med 1 mg /ml bovint serumalbumin (fedtsyre-fri, Sigma A7906), refereret til i hele som defineret medium. Flydende kulturer blev passeret dagligt ved fortynding i frisk medium ved initiale densiteter på 1-2 x 10 6 /ml, og anvendes ved passage 3 til 5. cellekulturkvalitet kolesterol (> 99%, Sigma) blev tilsat til F12 som en stabil 10 × emulsion indeholdende 500 ug /ml cholesterol dispergeret i 10 mg /ml albumin, der blev fremstillet ifølge [38]. De følgende medier tilsætninger blev udført på lignende måde: p-sitosterol (syntetisk, 95%), natriumtaurocholat, natriumglycocholat, β-østradiol, progesteron (alle fra Sigma), dehydroepiandrosteron (Calbiochem), og β-coprostanol (Matreya) .
Fordobling blev bestemt under den logaritmiske vækstfase ved kvantificering levedygtige celler under anvendelse af Cell Titer Glo-reagens (Promega) som validerede og beskrevet [39]. Måling af biomasse som CFU, som cellulært protein, eller som ATP har alle produceret ensartede resultater. En værdi på 1 attomol ATP per celle [40] blev antaget til rutinemæssig passage. Mulig unøjagtighed af denne værdi ikke fundamentalt påvirke fortolkningen af ​​data.
Isogene gen afbrydelser blev opnået ved indsættelse af en Campylobacter coli
chloramphenicol resistens element (cat
) i henhold til den beskrevet af Chalker et al
[41]. Primere blev omhyggeligt designet således, at målrette sekvens inden åbne læserammer, og er anført i tabel 1. Fusion PCR-reaktioner under anvendelse af PCR Extender System (5Prime) indeholdt 2,3 nM hver gel-oprenset skabelon, 50 pM primer, 1 × tuning puffer, 1,25 mM yderligere Mg ++, 0,2 mM af hver dNTP, og .01 U /pl polymerase. Fusion cyklus var som følger: 94 ° C 2,5 min, 10 cyklusser [94 ° C 15 sek, 45 ° C 60 sek, 68 ° C 60 sek pr kb], 25 cyklusser [94 ° C 15 sek, primer-specifik Tm 30 sek, 68 ° C 60 sek pr kb], endelige forlængelse 68 ° C 6-8 min. Fusionsprodukter blev reamplificeret med Pfx50 (Invitrogen) for at øge mængden, derefter oprenset ved anvendelse af Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Recipientstammer dyrket 1 Dagen CBA blev transformeret med 500 ng af det endelige amplicon hjælp af naturlige transformation [42, 43] efterfulgt af selektion for 7-10 dage på CBA indeholdende 15 ug /ml chloramphenicol. At sikre allelisk udskiftning de resulterende stammer, bedømt ved PCR af genomisk DNA ved anvendelse GoTaq (Promega) med primere, der er specificeret i tabel 1. PCR-strategi og resultaterne er vist i fig 1.Table 1 Primersekvenser.
primere til allel forstyrrelser
en
CAT fwd [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5B
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
yderligere primere til bekræftelse af gen forstyrrelser
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective gen numre i offentlige databaser for 26.695 og G27 er som følger: [kbt: hp0421, G27_952
], [PMI Hotel (rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [EPTA:. hp0022, G27_21
]
bRighthand kolonne viser de korte primer benævnelserne i figur 1.
Figur 1 PCR verifikation af allele afbrydelser i H. pylori stamme G27. Genomisk DNA blev fremstillet fra gen-forstyrret G27 stammer følgende tre passager under chloramphenicol selektion, derefter PCR-amplificeret som vist i hver ordning. Primere sekvenser er angivet i tabel 1. A. Afbrydelse af kbt. Fem eksempler er vist ud af syv individuelle kloner, som alle gav ens resultater i skærmen. B. Afbrydelse af PMI (rfbM). Hele chloramphenicol-resistent population blev passeret i hver selektionsrunde, uden klonselektion. C. Forstyrrelse af lpxE og EPTA. Hele chloramphenicol-resistent population blev passeret i hver runde af udvælgelse, uden klonselektion.
Gastrisk kolonisering
Dyreforsøg blev godkendt af LSUHSCS Institutional Animal Care og brug Udvalg. Kvindelige mongolske hoppemus blev opretholdt på almindelig kost ad libitum
. For at bevare motilitet blev H. pylori
stammen SS1 dyrket natten over under mikroaerobe betingelser i T75 kolber indeholdende 40 ml af F12 medium med 0,4 mg /ml albumin og 0 eller 50 ug /ml kolesterol. De motile planktoniske bakterier blev høstet ved centrifugering og resuspenderet i isotonisk saltvand. Kolonidannende enheder (CFU) blev målt i disse inokula ved seriel fortynding og udpladning på CBA, og disse målinger bekræftede lig dosis af levedygtige bakterier mellem de to vækstbetingelser. Ca. 10 8 CFU per 30 pi blev givet oralt til dyr (n = 6 til 9 pr gruppe). Dyr blev aflivet 11 dage senere, og maver blev fjernet og dissekeret. H. pylori
stede i gastriske antrum homogenater blev kvantificeret ved seriefortynding og udpladning på CBA indeholdende 5-fluorcytosin (5 ug /ml), vancomycin (10 ug /ml), amphotericin B (5 ug /ml), bacitracin ( 30 ug /ml), polymyxin B (10 U /ml), og trimethoprim (10 ug /ml) [44]. Duplicate CFU bestemmelser blev foretaget for flere fortyndinger af hver vævsprøve.
Helcelle-ELISA
Standardprocedurer [6, 7, 45], blev tilpasset til anvendelse af peroxidase-konjugeret sekundært antistof. Alle antistoffer blev opnået fra Calbiochem. Overnatskulturer af bakterier blev opsamlet ved centrifugering ved 3500 x g
i 10-15 min, vasket i Dulbeccos phosphatbufferet saltvand, og repelleteret ved 10.000 x g
i 2 min, derefter resuspenderet i 15% glycerol /0,9% NaCl. Cellesuspensionerne blev analyseret for proteinindhold og opbevares ved -20 ° C. Celleprøver indeholder kendte mængder af protein blev hurtigt fortyndet i 50 mM natriumbicarbonat /carbonat pH 9,55 og dispenseres umiddelbart i brønde i en ELISA-plade (Costar΅7). Pladerne blev forseglet og afkølet natten over, derefter blokeret i 90 minutter i 3% bovint serumalbumin opløst i vaskepufferen, som bestod af 0,1 M natriumphosphat pH 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% vægt /volumen Tween-20. Primært antistof, monoklonalt anti-Lewis X (Signet klon P12) eller anti-Lewis Y (Signet klon F3), fortyndet 1: 500 i vaskebuffer /1% BSA, blev tilsat i 2 timer, efterfulgt af fire ændringer af vaskebuffer. Det sekundære antistof, en 1: 2500 fortynding af peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-muse-IgM i vaskebuffer /1% BSA, blev tilsat i 90 minutter, efterfulgt af fire ændringer af vaskebuffer. Det kromogene substrat var 0,42 mM tetramethylbenzidin og 0,02% H 2O 2 i 50 mM acetat /citrat pH 5,5 [46]. Efter 15 minutter ved stuetemperatur blev reaktionen standset med 1 /5th vol 2,5 N H 2SO 4, og farveændring blev målt i en pladelæser ved 450 nm. I negative kontroller udelade enten primær eller sekundær antistof, eller med E. coli
stammen HB101 stedet for H. pylori
, farveændring var ubetydelig (A < 0,05). Niveauer af Lewis Y var ubetydelig (A < 0,1) i stamme 26.695 eller 43504, som var Lewis X-niveauer i SS1
Elektroforetisk analyser af lipopolysaccharider
H. pylori Salg kulturer blev opsamlet som beskrevet ovenfor og vaskes. cellepellets blev opbevaret ved -70 ° C. Celler blev lyseret i 60 mM Tris HCI pH 6,8 indeholdende 2% SDS ved 95-98 ° C i 10 min. Proteinindhold blev målt ved anvendelse af bicinchoninsyre-assay (Pierce). Prøver af cellelysater blev justeret til samme proteinindhold (1 mg /ml), derefter proteolyseres i reaktioner indeholdende (endelig) 60 mM Tris-HCI pH 6,8, 0,67% SDS og 0,67 mg /ml proteinase K ved 60 ° C i 2 timer [47]. For at eliminere elektroforetiske artefakter som følge af tilstedeværelsen af ​​lipid /detergent-komplekser blev proteolyserede prøver ekstraheret med varmt phenol [48]. Kontrol eksperimenter kontrolleret, at alle LPS bands blev genvundet gennem følgende ekstraktionsprocedure kvalitativt og uden fordomme. Proteolyserede Prøverne blev blandet med 1 volumen 90% vandig phenol og inkuberet ved 70 ° C i 20 min. Efter afkøling til 10 ° C i 1 min blev prøverne centrifugeret ved 12.000 x g
i 20 minutter ved 10 ° C, og den vandige fase opsamlet. De phenoliske faser blev genekstraheret med 1 volumen af ​​H 2O ved 70 ° C i 10 minutter, og centrifugeringen gentages. De kombinerede vandige ekstrakter blev indstillet til 0,5 M NaCl og præcipiteret med 10 vol ethanol i køleskab natten over, derefter centrifugeret ved 20.000 x g
i 20 minutter ved 10 ° C og lufttørret. Renset LPS prøver blev genopløst i Laemmli prøvepuffer [49] ved 95 ° C i 5 min. Prøver blev påført på 15% polyacrylamid /0,9% bis minigeler indeholdende 3,2 M urinstof med Laemmli diskontinuerlige bufferformulering [49], og en 5% stacking gel. Efter elektroforese ved 150 V i 75 minutter, blev gelerne enten fikseret natten for sølvfarvning [50] eller overføres til polyvinylidenedifluoride membranen under anvendelse Tris /glycin transfer buffer [51]. Blots blev blokeret natten over i 3% bovint serumalbumin og 0,03% NaN 3 i vaskepufferen beskrevet ovenfor for ELISA. Primært antistof (anti-Lewis X eller anti-Lewis Y, 1: 200) og sekundært antistof (peroxidasekonjugeret gede-anti-muse-IgM, 1: 1000) blev fortyndet i vaskepuffer indeholdende 0,5% BSA. Kolorimetrisk påvisning anvendes 3,3'-diaminobenzidin med kobolt enhancement [52]. Densitometri blev udført med det offentlige domæne ansøgningen billede J, findes på http:.... //RSB info NIH gov /ij
Resultater
vides kun lidt om de fysiologiske roller kolesterol i H . pylori
. For at undersøge responser af H. pylori
til cholesterol, vedtaget vi et defineret, serumfrit dyrkningsmedium, F12 med 1 mg /ml albumin, hvori denne bakterie kan være stabilt passeres [26]. Denne beskedne koncentration af albumin øger vækst [25, 26] og lindrer den stramme tilslutning til kultur overflader, der opstår i protein-frie medier [53]. I denne defineret medium, havde tilsætning af 50 ug /ml cholesterol ikke signifikant ændrer væksthastighed (figur 2). Fraværet af vækstvirkninger under de valgte dyrkningsbetingelser var fordelagtige til undersøgelse af den fysiologiske betydning af cholesterol i H. pylori
. Således var vi i stand til at sammenligne gastrisk kolonisering af hoppemus efter stamme SS1 der var blevet dyrket i det definerede medium indeholdende forskellige mængder af cholesterol (figur 3). Elleve dage efter oral podning blev H. pylori
i gastrisk antrum selektivt belagt og kvantificeret. Påfaldende blev hoppemus koloniseret kun af kulturer dyrket i kolesterol-holdigt medium, men ikke ved H. pylori
dyrket i kolesterol-frit medium (I hvert forsøg P < .0001 til sammenligning af log (CFU /g) mellem grupper under anvendelse Student to-halet t-test). Derfor kolesterol var en essentiel komponent af vækstmediet for at fastslå H. pylori
infektion i denne dyremodel. Figur 2 Tilsætning af cholesterol til det definerede medium påvirker ikke H. pylori vækstrate. Parallelle kulturer af hver stamme blev dyrket natten over i F12 /albumin (1 mg /ml) i fravær (åbne søjler) eller tilstedeværelse (skraveret søjler) på 50 pg /ml kolesterol. Den oprindelige befolkningstæthed var 2 × 106 /ml. Fordoblingstider blev beregnet ud fra den målte stigning i biomasse. De viste værdier repræsenterer middelværdien ± SD af fem eller flere uafhængige målinger. n
. s
. Students to-halet t-test for parvise data viste ingen statistisk signifikans.
Figur 3 H. pylori dyrket uden cholesterol undlader at kolonisere hoppemus. H. pylori
stamme SS1 blev dyrket natten over i defineret medium indeholdende 0 eller 50 ug /ml cholesterol. Ørkenrotter blev oralt podet med 3,5 × 108 CFU (eksperiment A) eller 1 × 108 CFU (eksperiment B). H. pylori
i gastrisk antrum blev kvantificeret ved 11 dage. Hver lodret bjælke repræsenterer middelværdien af ​​dobbeltbestemmelser for et dyr, og vandrette linjer giver medianen for hver behandlingsgruppe. Når der ikke kolonier blev genvundet, blev værdier registreret som 5 × 102 CFU /g væv, den anslåede detektionsgrænse.
Visse stammer af H. pylori
udstillet signifikante forskelle i tilslutning til dyrkningsflasker følgende passage i kolesterol, hvilket tyder ændringer i deres celle overfladeegenskaber (Hildebrandt & McGee, upublicerede observationer). Derfor besluttede vi at undersøge lipopolysaccharider, som udgør den væsentligste bestanddel af cellen kuvert, og tjener til at præsentere de biologisk vigtige Lewis-antigener. Vi anvendte en veletableret helcelle ELISA-procedure til kvantificering de fremherskende Lewis antigener, Lewis X og Y (figur 4). I overensstemmelse med litteraturen [54, 55], primært Lewis X blev påvist i stamme 26.695, kun Lewis Y blev detekteret i SS1, og signifikante niveauer af begge blev påvist i G27. I hvert tilfælde absorbanslæsninger var ulineære med hensyn til prøve belastning, en hændelse, der ikke er usædvanligt i ELISA-assays [56], og det er blevet bemærket af andre forskere under anvendelse af disse samme monoklonale [7]. For således at sammenligne antigenniveauer i prøver af H. pylori
dyrket i fravær eller nærvær af cholesterol, udførte vi parallel titreringer over et område af prøven loadings nemlig fra 20 til 500 ng af celleprotein pr brønd. Disse titreringer reproducerbart viste en markant stigning i mængden af ​​Lewis X og /eller Lewis Y antigen påvises på celleoverfladen, når H. pylori
stammerne 26.695, SS1 eller G27 blev dyrket i nærvær af cholesterol (figur 4). I replikat uafhængige eksperimenter, var de gennemsnitlige kolesterol-afhængige stigninger var statistisk signifikante (tabel 2). Sammenlignelige resultater er også blevet opnået for Lewis X i stamme 43504 (data ikke vist). Spiking prøver med kolesterol i slutningen af ​​vækstperioden ikke ændrer størrelsen af ​​Lewis antigen detekteret ved ELISA (figur 5A). I et andet kontrolforsøg verificeret vi for alle fire af disse stammer, at mængden af ​​celleprotein bundet til brøndene var upåvirket af vækst i kolesterol (figur 5B). ELISA-resultaterne således konstateret, at stigningen overfladeekspression af Lewis-antigener var en legitim biologiske respons på kolesterol, der forekom i alle de testede stammer. Denne reaktion var specifik for kolesterol, fordi substitution af cholesterol i vækstmediet med de strukturelle analoger p-sitosterol eller natriumtaurocholat havde ingen virkning på Lewis X eller Y-ekspression ved G27 (figur 4, højre paneler, og tabel 3). Lewis antigen reaktion på kolesterol stadig tilbage efter afbrydelse af genet for kolesterol α-glucosyltransferase (CGT
) i stamme G27 (tabel 2, og se nedenfor) og i 26.695 (data ikke vist), udelukker deltagelse af α glycosid metabolitter af cholesterol.Table 2 Styrkelse af celleoverfladen Lewis antigen udtryk ved væksten af ​​kulturer i overværelse af cholesterol.a

stigning gange sammenlignet med parallel kolesterol-fri kultur

Lewis X
Lewis Y

gennemsnit ± SEM (n)
P-værdi
middel ± SEM (n)
P-værdi
26.695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
ikke gjort
SS1 ikke
gjort
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 vildtype
2,85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 kbt :: kat
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: kat
2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± 0,43 (7)
0,014
en Lewis-antigener blev kvantificeret i replikat helcelle-ELISA-analyser af parrede prøver dyrket i nærvær eller fravær af 50 pg /ml cholesterol. Antigenet belastning var 300 ng cellulært protein pr brønd. Nøgletal for plus: minus kolesterol blev beregnet ud fra duplikerede netto absorbanslæsninger i hvert assay, og nøgletal bestemt i fem til otte uafhængige ELISA kørsler blev derefter gennemsnit. P-værdier blev beregnet i to-halet Student t-test for nulhypotesen, at forholdet er lig 1.
Tabel 3 Enhanced celleoverflade Lewis antigenekspression er cholesterol-specifik

fold stigning i forhold til parallel kolesterol-fri kultur

Lewis X
Lewis Y


middel ± SEM (n)
P-værdi
middel ± SEM (n)
P-værdi

kolesterol
2,96 ± 0,22 (5)
0,0008
2,48 ± 0,10 (4)
0,0007
β- sitosterol
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0,28
taurocholat
0,64 ± 0,16 (4)
0,12
0,84 ± 0,20 (3)
0,52
Lewis-antigener blev kvantificeret i replikat helcelle-ELISA-analyser af parvise kulturer af H. pylori
G27 dyrket i nærvær eller fravær af 130 uM cholesterol, eller en lige koncentration af β-sitosterol og natriumtaurocholat. Antigenet belastning var 300 ng cellulært protein pr brønd. Nøgletal for plus: minus kolesterol blev beregnet ud fra duplikerede netto absorbanslæsninger i hvert assay, og nøgletal bestemt i tre til fem uafhængige ELISA kørsler blev derefter gennemsnit. P-værdier blev beregnet i tosidige Student t-test for nulhypotesen, at forholdet er lig 1.
Figur 4 Vækst i kolesterol specifikt stimulerer celleoverflade visning af Lewis-antigener. Hele celle ELISA analyser blev udført på prøver af H. pylori
stamme 26.695 (øverst til venstre), SS1 (nederst til venstre), eller G27 (øvre og nedre højre). Parallelle kulturer blev dyrket natten over i defineret medium indeholdende 130 uM af følgende tilføjelser: cirkler, ingen tilsætning; kvadrater, kolesterol; trekanter, β-sitosterol; X, taurocholat. Varierende mængder af cellesuspension svarende til kendte mængder af cellulært protein blev anvendt til huller til dobbeltbestemmelse ELISA-plader, og immunoassayed for tilstedeværelsen af ​​Lewis X eller Lewis Y antigen som beskrevet i Methods
. Negative kontrolprøver af
E. coli HB101, eller buffer-only emner, faldt på den stiplede linje. Absorbansaflæsninger for individuelle brønde er plottet. Gentag forsøg med tre eller flere uafhængigt dyrket kulturer har givet væsentlige identiske resultater.
Figur 5 ELISA kontrolforsøg. A. Spiking med kolesterol i slutningen af ​​vækstperioden ændrer ikke Lewis antigen udtryk. Kulturer af H. pylori
blev dyrket natten over i defineret medium uden (kontrol) eller med 50 ug /ml cholesterol (kolesterol dyrket). En tredje kolbe (kolesterol spiked) blev dyrket i fravær af kolesterol, afkølet på is, og en ækvivalent mængde cholesterol blev tilsat før cellerne blev høstet. Lewis-antigener blev kvantificeret i to eksemplarer af hel-celle-ELISA, lastning 300 ng cellulært protein per brønd. Nøgletal for plus: minus kolesterol blev beregnet ud fra de gennemsnitlige netto absorbanslæsninger i hver analyse, og plottet viser betyde nøgletal ± sem for 04:57 uafhængig ELISA kører. P-værdier blev beregnet i tosidige Student t-test for nulhypotesen, at forholdet er lig 1. til sammenligninger mærkede ns, P > 0,05. B. Ækvivalent binding af celler til ELISA-plader. Prøver af H. pylori
der blev dyrket i parallelle kulturer i fravær (hvide søjler) eller nærvær af 50 pg /ml cholesterol (grå søjler) blev påført flerbrøndsplader på samme måde som for Lewis-antigen ELISA-assays, tilføjer 500 ng af cellulært protein pr brønd. Efter natten over fastgørelse blev brøndene vasket to gange med Dulbeccos phosphat-bufret saltvand, derefter protein i adhærerende celler blev kvantificeret under anvendelse af BCA-reagenset. Middelværdier ± SD for firdobbelte brønde er vist.
Påvisning af Lewis X og Y ved immunoblotting med de samme monoklonale antistoffer produceret et andet resultat (figur 6). I flere forsøg ved hjælp af denne teknik, har vi ikke afsløre eventuelle kolesterol-afhængige forskelle i Lewis X eller Y-niveauer, bortset fra en lille stigning i Lewis X 43504, der kun var marginalt signifikant. Proceduren for blotting ansat LPS prøver ekstraheret fra cellelysater, og i princippet skal afsløre hele cellulære Lewis antigen pool, mens hel-celle-ELISA-metoden er kun beregnet som præsenteres på den ekstracellulære overflade for at opdage. Det interessante forskel i resultaterne mellem vores ELISA analyser og immunblots foreslår en ændring i cellulær adskillelser af Lewis-antigenet afhængigt af tilgængeligheden af ​​kolesterol i vækstmediet. Figur 6 Lewis X og Y antigen profilering ved immunoblotting. Prøver af LPS isoleret fra parallelle kulturer dyrket i fravær (-) eller nærvær (+) af 50 ug /ml cholesterol blev opløst på 15% urea geler. Lastede mængder per bane, som ug indledende lysat-protein, er angivet i toppen af ​​hver bane. Efter overførsel blev antigener immunodetekteret med monoklonale antistoffer specifikke for Lewis X (øvre panel) eller Lewis Y (nederste panel). Et repræsentativt eksempel på hver er vist. Side baner indeholder prestained proteinmarkører (M) eller 400 ng af E. coli
O111: B4 LPS. Antigen signal optrådte kun i O-kæde regioner i disse H. pylori
stammer; tomme områder er blevet beskåret i overensstemmelse hermed. De immunoblots blev uafhængigt gentaget med flere prøvesæt, og densitometri blev brugt til at kvantificere antigen signal i hver bane. Nøgletal for parvise plus: minus kolesterol prøver blev beregnet, og det gennemsnitlige forhold mellem ± SEM for (n) blots er angivet i blåt. Nulhypotesen, at forholdet er lig med 1 blev evalueret i en to-halet Student t-test.
Foruden Lewis antigen måling, vi direkte sammenlignede lipopolysaccharid profiler mellem parallelle kulturer dyrket i nærvær eller fravær af cholesterol ved anvendelse af gel elektroforese og sølvfarvning. I alle de H. pylori
stammer vi har undersøgt, LPS band profiler var identiske mellem kulturer dyrket i defineret medium med kolesterol, der opnås i serumholdigt medium eller på blodagar (data ikke vist), og som forventet [5 , 24, 55, 57] disse profiler var meget belastning-specifikke. På disse geler blev kolesterol-responsive LPS bands tydeligst løst for stammen G27, et klinisk isolat (figurerne 7, 8).

• Nytten af ​​cytokeratiner 7 og 20 (CK7 /20) immunhistokemi i sondringen af ​​korte segment Barrett spiserøret fra gastrisk intestinal metaplasi: Er det rigtigt
• Tilsætningen af ​​en pH-følsom gel forbedrer mikroemulsion stabilitet for den målrettede fjernelse af colon ammonia