Helicobacter pylori modificação lipopolissacarídeo, expressão de antigénios Lewis, e colonização gástrica são dependentes de colesterol

Helicobacter pylori
lipopolissacarídeo modificação, expressão de antigénios Lewis, e colonização gástrica are Abstract
Fundo dependente de colesterol
Helicobacter pylori
especificamente ocupa colesterol e incorpora-a na membrana bacteriana, ainda é pouco atualmente conhecida sobre as funções fisiológicas do colesterol. Nós comparamos fenótipos e in vivo
capacidade de colonização de H. pylori
crescido numa definido, meio de crescimento isento de soro, F12 com 1 mg /ml de albumina contendo 0 a 50 ug /ml de colesterol.
Resultados
Embora os tempos de duplicação foram em grande parte afetada pelo colesterol, foram observadas outras alterações fenotípicas evidentes. H. pylori
SS1 estirpe cultivada em meio definido com o colesterol colonizado com sucesso o estômago de gerbos, enquanto SS1 cultivados sem colesterol não conseguiu colonizar. H. pylori
lipopolissacarídeo frequentemente exibe Lewis X e /ou antígenos Y. A expressão destes antigénios medidos por ELISA de célula inteira foi marcadamente melhorado em resposta ao crescimento da estirpe SS1, 26695, ou G27 em colesterol. Além disso, a análise eletroforética de lipopolissacarídeo no tipo selvagem G27 e em mutantes que faltam a cadeia O revelaram mudanças estruturais dentro das porções de um núcleo oligossacárido /lipídicas. Estas respostas em níveis de antígeno de Lewis e nos perfis de lipopolissacarídeo a disponibilidade de colesterol eram altamente específico, porque nenhuma alteração ocorreu quando o colesterol foi substituído por sais de p-sitosterol ou biliares. O rompimento de genes que codificam o colesterol α-glicosiltransferase ou lípido A transferase fosfoetanolamina não teve nenhum efeito sobre a expressão de Lewis, nem sobre perfis de lipopolissacarídeos, nem na capacidade de resposta do colesterol destas propriedades. A ruptura do gene de lípido A 1-fosfatase eliminado o efeito de colesterol em perfis de lipopolissacáridos, mas não o seu efeito sobre a expressão de Lewis.

Conclusões Em conjunto, estes resultados sugerem que a depleção de colesterol conduz a formas aberrantes de LPS que são dependentes desfosforilação de lípido a na posição 1. Um modelo experimental para os efeitos observados de colesterol é discutida em que os passos sequenciais de biogénese lipopolissacárido e, de forma independente, a apresentação de antigénio de Lewis na superfície da célula, dependerá de composição da membrana. Estas novas descobertas demonstram que a disponibilidade de colesterol permite H. pylori
para modificar seu envelope de células de maneiras que podem impactar colonização do tecido hospedeiro in vivo
.
Fundo
Helicobacter pylori
é altamente nicho patógeno -Adaptado que habita o estômago humano, é transmitido principalmente no seio das famílias, e não tem conhecido reservatório ambiental. infecções crônicas pode ser assintomática ou causar gastrite, úlcera ou câncer gástrico. Para estabelecer a infecção, a bactéria deve sobreviver trânsito através do compartimento gástrico do ácido [1]. Ele penetra e estabelece residência na camada de muco protector, um ambiente de lipídios e rica em colesterol [2, 3]. Dentro deste nicho a bactéria emprega uma variedade de mecanismos de evasão resposta imune do hospedeiro.
Lipopolissacarídeos (LPS) na superfície do H. pylori
são modificados para exibir certos antígenos do grupo sanguíneo humanos, principalmente Lewis antígenos X e Y [ ,,,0],4-7], e menos frequentemente H tipo 1, i-antigénio, grupo sanguíneo A, ou Lewis antígenos A ou B [8-10]. Estes antigénios de superfície LPS são necessárias para o estabelecimento da infecção, pois as estirpes mutantes defeituosos para a síntese de LPS O-antigénio ou para a expressão de Lewis X /Y não conseguem colonizar murganhos [11-13]. Há evidências de que Lewis antigénios expressos na superfície bacteriana contribuir para a adesão de H. pylori
às células epiteliais gástricas [10, 14], e desempenham um papel na tropismo de tecidos [15-17]. células epiteliais gástricas também expressam antigénios de Lewis [18, 19], sugerindo que a exibição de Lewis antigénios na superfície bacteriana pode servir como uma estratégia de mimetismo. Estudos de isolados clínicos [18, 20] e infecções experimentais em animais [21] apoiar este papel de Lewis bacteriana antígenos na evasão imune. Na infecção humana, H. pylori
antigénios de Lewis têm sido associadas com a gravidade da úlcera péptica e duodenite [16, 22]. Outra característica importante de H. pylori é a sua
LPS modificado lípido A estrutura, com acilação reduzida e menos grupos carregados do que é típico de enterobactérias [23]. Estas modificações lípido A minimizar endotóxico e inflamatórias propriedades de H. pylori
LPS (revisto em [24]).
O colesterol é um nutriente não essencial para H. pylori
, que promove o crescimento em meio isento de soro [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
especificamente incorporar colesterol na membrana bacteriana [27], assim como um número limitado de bactérias patogênicas e comensais incluindo Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
., E Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. O colesterol pode fortalecer a membrana nestes organismos [30-32]. H. pylori
também formam exclusivamente colesterol α-glicósido [33, 34], e deste metabolito podem ser ainda modificados por acilação ou phosphatidylation [34]. colesterol de alfa-glucosilada subverte resposta imune do hospedeiro à bactéria num modelo de rato, através da supressão da fagocitose e da activação das células T [35]. Outros papéis para metabólitos de colesterol e de colesterol na membrana bacteriana ainda têm de ser exploradas. Neste relatório, demonstra-se que a biossíntese de lipopolissacárido, incluindo a expressão de antigénio de Lewis e de núcleo de LPS /lípido A modificação, são alteradas pela disponibilidade de colesterol no meio de crescimento. Apresentamos dados que indicam que essas mudanças no envelope celular podem influenciar significativamente a interação patógeno /hospedeiro em um modelo animal de infecção.
Métodos
cepas bacterianas e condições de crescimento
Cepas de H. pylori
incluíram a cepa de laboratório ATCC43504 (origem: Austrália), 26695 (UK), G27 isolado clínico (Itália [36], desde que por N. Salama), eo rato estirpe adaptada SS1 (Austrália; fornecida por Adrian Lee [37]). As bactérias foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera de 5% microaeróbia O 2/10% CO 2 em agar de sangue de Campylobacter (CBA). As bactérias foram passadas a cada 2 a 3 dias, e não mais de 25 dias, para minimizar a deriva genética. Para o crescimento em meio quimicamente definido [26], as bactérias foram inoculadas a partir de CBA em frascos de cultura de tecido contendo F12 de Ham (Gibco) com 1 mg /ml de albumina de soro de bovino (livre de ácido gordo, Sigma A7906), referida ao longo de meio definido. As culturas liquidas foram passadas por dia por diluição em meio fresco com densidades iniciais de 1-2 × 10 6 /mL, e utilizado na passagem 3 a 5. celular grau de cultura de colesterol (> 99%, Sigma) foi adicionado a F12 como um 10 × emulsão estável contendo 500 ug /ml de colesterol disperso em 10 mg /ml de albumina, a qual foi preparada de acordo com [38]. Os seguintes adições media foram realizadas de modo semelhante: p-sitosterol (sintético, 95%), taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, β-estradiol, progesterona (todos de Sigma), a dehidroepiandrosterona (Calbiochem), e β-coprostanol (Matreya) .
tempos de duplicação foram determinadas durante a fase de crescimento logarítmico por quantificação de células viáveis ​​usando o reagente celular Titer Glo (Promega) como descrito validado e [39]. Medição da biomassa como CFU, tal como a proteína celular, ou como ATP foram todos produzidos resultados consistentes. Um valor de 1 attomol ATP por célula [40] foi assumida para a passagem de rotina. Possível imprecisão deste valor não influencia fundamentalmente interpretação dos dados.
Perturbações genéticas isogénicas foram alcançados pela inserção de um Campylobacter coli
elemento de resistência cloranfenicol (cat
) de acordo com a estratégia descrita por Chalker et al
[41]. Os iniciadores foram cuidadosamente concebidos de modo a alvejar sequência dentro de quadros de leitura abertos, e estão listadas na Tabela 1. Reacções de PCR de fusão utilizando o extensor PCR System (5Prime) continham 2,3 nM de cada modelo purificado em gel, 50 uM de iniciadores, 1 × tampão de sintonização, 1,25 mM de Mg adicional ++, 0,2 mM de cada dNTP, e 0,01 U /ul de polimerase. condições do ciclo de fusão foram como se segue: 94 ° C 2,5 min, 10 ciclos de [94 ° C 15 seg, 45 ° C 60 seg, 68 ° C 60 seg por KB], 25 ciclos de [94 ° C 15 seg, específicos do iniciador de Tm 30 segundos, 68 ° C 60 seg por kb], extensão final de 68 ° C 6-8 min. produtos de fusão foram novamente amplificados com Pfx50 (Invitrogen) para aumentar a quantidade, em seguida, purificado utilizando o kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen). estirpes receptoras cultivadas um dia em CBA foram transformadas com 500 ng do fragmento amplificado final utilizando transformação natural [42, 43] seguido por selecção de 7-10 dias na CBA contendo 15 ug /ml de cloranfenicol. Para assegurar a substituição alélica, as estirpes resultantes foram avaliadas por PCR do ADN genómico usando GoTaq (Promega) com os iniciadores indicados na Tabela 1. A estratégia de PCR e os resultados são mostrados na Figura 1 1.Table sequências de iniciadores.
primers para interrupção alélicas
um
CAT FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
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CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
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ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
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lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
iniciadores adicionais para confirmação da ruptura do gene
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
números de genes aRespective em bases de dados públicas para 26695 e G27 são os seguintes: [CGT: hp0421, G27_952
], [PMI
(RFBM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [EPTA:. hp0022, G27_21
]
coluna bRighthand lista as breves designações de primers utilizados na Figura 1. Figura 1
verificação PCR de rupturas alélicas em H. pylori linhagem G27. O ADN genómico foi preparado a partir de estirpes G27 interrompido por genes seguintes três passagens sob selecção de cloranfenicol, em seguida, amplificado por PCR, como mostrado em cada esquema. sequências de iniciadores são dadas na Tabela 1. A. Perturbação de CGT. Cinco exemplos estão apresentados de sete clones individuais, todas as quais deram resultados idênticos na tela. B. Perturbação do PMI (RFBM). A população resistentes ao cloranfenicol inteira foi passada em cada rodada de seleção, sem selecção clonal. C. Perturbação do lpxE e EPTA. A população resistentes ao cloranfenicol inteira foi passada em cada rodada de seleção, sem selecção clonal.
Colonização gástrica
Experiências com animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o LSUHSCS Institucional. gerbilos da Mongólia fêmeas foram mantidos em dieta normal ad libitum
. Para preservar a motilidade, o H. pylori
SS1 estirpe foi cultivada durante a noite sob condições microaeróbias em frascos T75 contendo 40 ml de meio F12 com 0,4 mg /ml de albumina e 0 ou 50 ug /ml de colesterol. As bactérias planctónicas motilidade foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em solução salina isotónica. unidades formadoras de colónias (UFC) foram medidos nestes inóculos por diluição em série e plaqueamento em CBA, e estas medições confirmaram igual dosagem de bactérias viáveis ​​entre as duas condições de crescimento. Aproximadamente 10 8 CFU por 30 ul foram administrados oralmente aos animais (N = 6-9 por grupo). Os animais foram sacrificados 11 dias mais tarde, e os estômagos foram removidos e dissecados. H. pylori
presente em homogenatos antro gástrico foram quantificados por diluição em série e plaqueamento em CBA contendo 5-fluorocitosina (5 ug /ml), vancomicina (10 ug /ml), anfotericina B (5 ug /ml), bacitracina ( 30 ug /mL), polimixina B (10 U /ml), e trimetoprim (10 ug /ml) [44]. Determinações em duplicado de CFU foram feitos para várias diluições de cada amostra de tecido.
-ELISA de célula inteira
procedimentos padrão [6, 7, 45], foram adaptados para a utilização de anticorpo secundário conjugado com peroxidase. Todos os anticorpos foram obtidos de Calbiochem. culturas durante a noite de bactérias foram recolhidas por centrifugação a 3500 × g
durante 10-15 min, lavadas em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, e sedimentadas a 10.000 x g durante 2 min
, depois ressuspensas em glicerol a 15% /0,9% NaCl. As suspensões de células foram ensaiadas quanto ao teor de proteína e armazenou-se a -20 ° C. amostras de células contendo quantidades conhecidas de proteína foram rapidamente diluída em bicarbonato de sódio 50 mM /pH 9,55 e carbonato de dispensado imediatamente para poços de uma placa ELISA (Costar΅7). As placas foram seladas e refrigerada durante a noite, depois bloqueadas durante 90 minutos em 3% de albumina de soro bovino dissolvido no tampão de lavagem que consistia em fosfato de sódio de pH 0,1 7,4 M /NaCl 0,1 M /0,1% w /v de Tween-20. O anticorpo primário, anticorpo monoclonal anti Lewis-X (Signet clone P12) ou anti-Lewis Y (Signet clone F3), diluído 1: 500 em tampão de lavagem /1% BSA, foi adicionada durante 2 horas, seguido de quatro mudanças de tampão de lavagem. O anticorpo secundário, uma diluição de 1: 2500 de peroxidase de rábano conjugada com anticorpo de cabra anti-IgM de rato em tampão de lavagem /BSA a 1%, foi adicionada durante 90 min, seguido de quatro mudanças de tampão de lavagem. O substrato cromogénico foi tetrametilbenzidina 0,42 mM e 0,02% H 2O 2 em 50 mM de acetato /citrato de pH 5,5 [46]. Após 15 minutos à temperatura ambiente, a reacção foi parada com 1/5 vol 2,5 N H 2SO 4, e mudança de cor foi medida num leitor de placas a 450 nm. Em controlos negativos omitindo qualquer anticorpo primário ou secundário, ou com E. coli HB101
estirpe substituído por H. pylori
, mudança de cor foi insignificante (A < 0,05). Níveis de Lewis Y eram insignificantes (A < 0,1) na estirpe 26695 ou 43504, como o foram os níveis de Lewis X em SS1 analisa
electroforética de lipopolissacáridos
H. pylori
culturas foram recolhidas como descrito acima, e lavou-se. os sedimentos celulares foram armazenados a -70 ° C. As células foram lisadas em 60 mM Tris-HCl pH 6,8 contendo 2% de SDS a 95-98 ° C durante 10 min. O teor de proteína foi medido usando o ensaio de ácido bicinconínico (Pierce). As amostras de lisados ​​de células foram ajustados para o conteúdo de proteína igual (1 mg /ml), em seguida, proteolisadas em reacções contendo (final), 60 mM de Tris HCl pH 6,8, 0,67% SDS, e 0,67 mg /ml de proteinase K a 60 ° C durante 2 horas [47]. Para eliminar artefactos electroforéticos, devido à presença de complexos de lípidos /detergentes, amostras proteolisadas foram extraídos com fenol quente [48]. As experiências de controlo verificou-se que todas as bandas de LPS foram recuperados através do procedimento de extracção seguinte qualitativa e sem viés. proteolisada amostras foram misturadas com um volume de fenol aquoso a 90% e incubou-se a 70 ° C durante 20 min. Após arrefecimento a 10 ° C durante 1 min, as amostras foram centrifugadas a 12000 × g
durante 20 min a 10 ° C, e a fase aquosa recolhida. As fases fenólicos foram re-extraídos com um volume de H 2O a 70 ° C durante 10 min, e repetida a centrifugação. Os extractos aquosos combinados foram ajustados para NaCl 0,5 M e precipitou-se com etanol a 10 vol no frigorífico durante a noite, depois centrifugada a 20000 × g
durante 20 min a 10 ° C e seco ao ar. amostras de LPS purificado foram redissolvidos em tamp de amostra de Laemmli [49] a 95 ° C durante 5 min. As amostras foram aplicadas a 15% de poliacrilamida /0,9% de bis minigels contendo 3,2 M de ureia com a formulação de tampão descontínuo Laemmli [49], e um gel de empacotamento a 5%. Após a electroforese a 150 V durante 75 min, os géis foram fixados durante a noite, quer por coloração com prata [50] ou transferidos para membrana polyvinylidenedifluoride utilizando tampão de transferência Tris /glicina [51]. As membranas foram bloqueadas durante a noite em 3% de albumina de soro bovino e 0,03% de NaN 3 no tampão de lavagem descrito acima para o ELISA. O anticorpo primário (anti-Lewis X ou anti-Lewis Y, 1: 200) e anticorpo secundário (conjugado com peroxidase de cabra anti-ratinho IgM, 1: 1000) foram diluídos em tampão de lavagem contendo 0,5% BSA. detecção colorimétrica utilizados 3,3'-diaminobenzidina com realce cobalto [52]. Densitometria foi realizada com a aplicação de domínio público Imagem J, disponível em http:.... //RSB Informação nih gov /ij
Resultados
Pouco se sabe sobre as funções fisiológicas de colesterol no H . pylori
. Para investigar as respostas de H. pylori
ao colesterol, adoptámos, um meio de cultura isento de soro definido, F12 com 1 mg /ml de albumina, em que esta bactéria pode ser passado de forma estável [26]. Esta concentração de albumina aumenta modesto crescimento [25, 26] e alivia a aderência apertada às superfícies de cultura, que ocorre em meio isento de proteínas [53]. Neste meio definido, a adição de 50 ug /ml de colesterol não alterou significativamente a taxa de crescimento (Figura 2). A ausência de efeitos de crescimento, sob as condições de cultura escolhidas era vantajosa para a investigação sobre a importância fisiológica de colesterol em H. pylori
. Assim, nós fomos capazes de comparar a colonização gástrica de gerbilos por estirpe SS1 que tinham sido cultivadas em meio definido contendo quantidades variadas de colesterol (Figura 3). Onze dias após a inoculação oral, H. pylori
no antro gástrico foram seletivamente banhado e quantificados. Surpreendentemente, os gerbos foram colonizados apenas pelas culturas cultivadas em meio contendo colesterol, mas não por H. pylori
cultivadas em meio isento de colesterol (Em cada experiência, P < 0,0001 para a comparação de registo (CFU /g) entre grupos usando Student bicaudal teste t). Por conseguinte, o colesterol era um componente essencial do meio de crescimento, a fim de estabelecer a infecção por H. pylori
neste modelo animal. Figura 2 A adição de colesterol para o meio definido não afecta a taxa de crescimento de H. pylori. Culturas paralelas de cada uma das estirpes foram cultivadas durante a noite em meio F12 /albumina (1 mg /ml) na ausência (barras a branco) ou na presença (barras sombreadas) de 50 ug /ml de colesterol. A densidade de população inicial foi de 2 × 106 /ml. Os tempos de duplicação foram calculados a partir do aumento medido na biomassa. Os valores apresentados representam a média ± DP de cinco ou mais medições independentes. n
. s
. t-teste bilateral de Student para dados de pares não apresentaram significância estatística.
Figura 3 H. pylori cultivadas sem colesterol não conseguem colonizar gerbos. H. pylori
SS1 estirpe foi crescida durante a noite em meio definido contendo 0 ou 50 ug /ml de colesterol. Gerbos foram inoculados oralmente com 3,5 × 108 CFU (experimento A) ou 1 × 108 CFU (experimento B). H. pylori
no antro gástrico foram quantificados em 11 dias. Cada barra vertical representa a média de determinações em duplicado para um animal, e as linhas horizontais dar a mediana para cada grupo de tratamento. Onde há colônias foram recuperados, os valores foram registrados como 5 × 102 CFU /g de tecido, o limite estimado de detecção.
Certas estirpes de H. pylori
apresentaram diferenças significativas na adesão aos vasos de cultura seguintes passagem em colesterol, sugerindo alterações nas suas propriedades de superfície celular (Hildebrandt & McGee, observações não publicadas). Por esta razão, nós decidimos investigar lipopolissacáridos, que constituem o principal componente do envelope celular, e servem para apresentar os antigénios de Lewis biologicamente importantes. Utilizou-se um procedimento de ELISA de célula inteira bem estabelecidos para quantificar os antigénios predominantes de Lewis, de Lewis X e Y (Figura 4). De acordo com a literatura [54, 55], principalmente de Lewis X foi detectado na estirpe 26695, apenas a Y de Lewis foi detectada em SS1, e níveis significativos de ambos foram detectados em G27. Em cada caso, as leituras de absorvância foram não-linear em relação à amostra de carga, um acontecimento que não é invulgar em ensaios ELISA [56], e que foi referido por outros investigadores usando estes mesmos anticorpos monoclonais [7]. Assim, a fim de comparar níveis de antigénio em amostras de H. pylori
cultivadas na ausência ou presença de colesterol, foi realizada titulações paralelas ao longo de um intervalo de cargas de amostra variando de 20 a 500 ng de proteína celular por poço. Estes titulações reprodutivelmente mostraram um aumento acentuado na quantidade de Lewis X e /ou o antigénio Y de Lewis detectada na superfície da célula quando H. pylori
estirpes 26695, SS1 ou G27 foram cultivados na presença de colesterol (Figura 4). Em experiências independentes em duplicado, a média de aumentos dependentes de colesterol foram estatisticamente significativas (Tabela 2). Resultados comparáveis ​​foram também obtidos para Lewis X na estirpe 43504 (dados não mostrados). Spiking amostras com colesterol no final do período de crescimento não alterou a quantidade de antigénio de Lewis detectado por ELISA (Figura 5A). Numa outra experiência de controlo verificou-se para todos os quatro destas estirpes que a quantidade de proteína ligada às células nos poços não foi afectada pelo crescimento em colesterol (Figura 5B). O ELISA resultados assim estabelecido que o aumento da expressão de superfície de Lewis antigénios foi uma resposta biológica legítima de colesterol que ocorreu em todas as estirpes testadas. Esta resposta era específico para o colesterol, porque a substituição de colesterol no meio de crescimento com os análogos estruturais p-sitosterol ou de sódio taurocolato não teve efeito sobre a expressão de Lewis X ou Y por G27 (Figura 4, os painéis do lado direito, e a Tabela 3). A resposta para o antigénio Lewis colesterol ainda permaneceu após a disrupção do gene da colesterol-α glicosiltransferase (CGT
) em G27 estirpe (Tabela 2, e ver abaixo) e em 26695 (dados não mostrados), o que exclui a participação de α metabólitos glicósido de cholesterol.Table 2 Melhoria da superfície celular Lewis expressão do antígeno pelo crescimento das culturas na presença de cholesterol.a

vezes maior em comparação com a cultura livre de colesterol paralelo

Lewis X
Lewis Y

significa ± sEM (n)
valor P
significa ± SEM (n)
valor P
26695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
não
feito
SS1 não
feito
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 tipo selvagem
2,85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 CGT :: gato
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: gato
2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± 0,43 (7)
0,014
a antigénios de Lewis foram quantificados em de célula inteira ELISA idêntico análises de amostras emparelhadas cultivadas na presença ou ausência de 50 ug /ml de colesterol. A carga de antigénio foi de 300 ng de proteína celular por poço. Relações para além de: colesterol negativo foram calculados a partir de leituras de absorção líquida duplicados em cada ensaio, e os rácios determinados em cinco a oito corridas de ELISA independentes foram, em seguida, em média. Os valores de P foram calculados em duas caudas t de Student testes para a hipótese nula de que a relação é igual a superfície da célula 1.
Tabela 3 aprimorada Lewis expressão do antígeno é

vezes maior em comparação com a cultura livre de colesterol paralelo

Lewis X
Lewis Y


significa ± SEM (n)
valor P
significa ± SEM (n)
valor P

colesterol
2,96 ± 0,22 (5)
0,0008
2,48 ± 0,10 (4)
0,0007
β- sitosterol
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0,28
taurocolato
0,64 ± 0,16 (4)
0,12
0,84 ± 0,20 (3) 0,52

antigénios de Lewis foram quantificados em ELISA de célula inteira análises replicadas de culturas de pares de H. pylori G27
cultivadas na presença ou ausência de 130 uM de colesterol, ou um igual concentração de β-sitosterol ou do taurocolato de sódio. A carga de antigénio foi de 300 ng de proteína celular por poço. Relações para além de: colesterol negativo foram calculados a partir de leituras de absorção líquida duplicados em cada ensaio, e os rácios determinados em três a cinco corridas de ELISA independentes foram, em seguida, em média. Os valores de P foram calculados de t de Student testes bicaudais para a hipótese nula de que a relação é igual a 1.
Figura 4 Crescimento em colesterol aumenta especificamente visualização da superfície celular de antígenos de Lewis. Os ensaios de ELISA de célula total foram realizados em amostras de H. pylori
estirpe 26695 (superior esquerdo), SS1 (inferior esquerdo), ou G27 (superior e inferior direito). culturas paralelas foram cultivadas durante a noite em meio definido contendo 130 mM dos seguintes acréscimos: círculos, sem adição; quadrados, colesterol; triângulos, β-sitosterol; X, taurocolato. Quantidades variáveis ​​de suspensão de células correspondentes às quantidades conhecidas de proteína celular foram aplicadas a cavidades em duplicado de placas de ELISA, e imunoexpressão para a presença de antigénio de Lewis X ou Y de Lewis tal como descrito em Métodos
. amostras de controlo negativo de E. coli
HB101, ou tampão somente espaços em branco, caiu sobre a linha pontilhada. As leituras de absorvância para poços individuais são traçados. Repetir experimentos com três ou mais independentemente crescido culturas produziram resultados essencialmente idênticos.
Figura 5 experimentos de controle de ELISA. R. A cravação com colesterol no final do período de crescimento não alterar a expressão do antigénio de Lewis. As culturas de H. pylori
foram cultivadas durante a noite em meio definido sem (controlo) ou com 50 ug /ml de colesterol (colesterol cultivadas). Num terceiro balão (colesterol cravado) foi cultivada na ausência de colesterol, arrefecida em gelo, e uma quantidade equivalente de colesterol foi adicionado antes de as células foram recolhidas. antigénios de Lewis foram quantificados em duplicado por ELISA de célula inteira, de carga de 300 ng de proteína celular por poço. Relações para além de: colesterol negativo foram calculados a partir das leituras médias de absorção líquida em cada ensaio, eo enredo exibe significa rácios ± SEM para 3-5 independente ELISA é executado. Os valores de P foram calculados de t de Student testes bicaudais para a hipótese nula de que a relação é igual a 1. Para comparações rotulados ns, P > .05. B. ligação de células a placas de ELISA equivalente. As amostras de H. pylori
que foram cultivadas em culturas paralelas na ausência (barras brancas) ou na presença de 50 ug /ml de colesterol (barras cinzentas) foram aplicados a placas com múltiplas cavidades na mesma maneira que para os ensaios de ELISA de antigénio de Lewis, adicionando 500 ng de proteína celular por poço. Após fixação durante a noite, os poços foram lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, depois de proteínas em células aderentes foi quantificado utilizando o reagente BCA. valores médios ± DP de poços em quadruplicado são apresentados.
Detecção de Lewis X e Y por imunotransferência com os mesmos anticorpos monoclonais produzidos um resultado diferente (Figura 6). Em várias tentativas utilizando esta técnica, nós não detectou quaisquer diferenças dependentes de colesterol nos níveis de Lewis X ou Y, além de um pequeno aumento de Lewis X em 43504 que foi apenas marginalmente significativa. O procedimento empregue blotting amostras de LPS extraídos a partir de lisados ​​de células, e, em princípio, deveriam detectar todo o pool celular antigénio de Lewis, ao passo que o método de ELISA de célula inteira foi concebida para detectar apenas o apresentado na superfície extracelular. A diferença interessante entre os resultados de nossas análises e imunoblots de ELISA sugerem uma mudança na compartimentação celular do antigénio de Lewis, dependendo da disponibilidade de colesterol no meio de crescimento. A Figura 6 de Lewis X e Y antigénio perfis por imunotransferência. As amostras de LPS isolado a partir de culturas paralelas cultivadas na ausência (-) ou na presença (+) de 50 ug /ml de colesterol foram resolvidos em géis de ureia a 15%. Quantidades carregadas por pista, como ug de proteína de lisado inicial, são dadas na parte superior de cada pista. Após transferência, os antigénios foram imunodetectadas com anticorpos monoclonais específicos para Lewis X (painel superior) ou Y de Lewis (painel inferior). Um exemplo representativo de cada um deles é mostrado. pistas laterais contêm marcadores prestained proteína (M) ou 400 ng de E. coli O111
: LPS B4. sinal antigénico apareceu apenas nas regiões de cadeia O destes H. pylori
estirpes; áreas em branco foram recortadas em conformidade. Os imunoblots foram independentemente replicado com vários conjuntos de amostras, e densitometria foi usada para quantificar o sinal de antigénio em cada pista. Rácios de pares Plus: amostras de colesterol menos foram calculados, e os rácios médios ± SEM para (n) borrões são dadas em azul. A hipótese nula de que a proporção é igual a 1, foi avaliada num teste t de Student bicaudal.
Além de medição de antigénio de Lewis, foram comparados directamente os perfis lipopolissacarídeo entre culturas paralelas cultivadas na presença ou ausência de colesterol, usando gel electroforese e coloração com prata. Em todas as estirpes de H. pylori
que examinamos, os perfis de bandas de LPS foram idênticos entre as culturas cultivadas em meio definido com colesterol ao obtido em meio contendo soro ou em agar de sangue (dados não mostrados), e como esperado [5 , 24, 55, 57] esses perfis foram altamente específicos de tensão. Em relação a estes géis, bandas de LPS de colesterol-responsivos foram mais claramente resolvidas para a G27 estirpe, um isolado clínico (Figuras 7, 8).

• O utilitário de citoqueratinas 7 e 20 (/20 CK7) imuno-histoquímica na distinção de curto segmento de esôfago de Barrett de metaplasia intestinal gástrica: É confiável
• A adição de um gel sensível ao pH melhora a estabilidade da micro-emulsão para a remoção específica de ammonia