Helicobacter pylori lipopolisaharid modifikacija, izraz Lewis antigen, a želučani kolonizacija su kolesterol ovisan

Helicobacter pylori pregled lipopolisaharid modifikacija, izraz Lewis antigen, a želučani kolonizacija su kolesterol ovisna pregled apstraktne pregled pozadine pregled Helicobacter pylori pregled posebno zauzima kolesterol i uključuje ga u bakterijsku membranu, ali malo je trenutno poznato o kolesterol je fiziološka uloga. Usporedili smo fenotipa i in vivo
kolonizacije sposobnost H. pylori pregled uzgajaju u definiranom mediju za rast bez seruma, F12 s 1 mg /ml albumina koji sadrži 0 do 50 ug /ml kolesterola pregled. Rezultati
Dok dubliranje puta su bili u velikoj mjeri pod utjecajem kolesterola, uočene su drugi očiti fenotipske promjene. H. pylori pregled soj SS1 uzgaja u definiranom mediju s kolesterolom uspješno kolonizirali želudac od gerbila, dok SS1 uzgajati bez kolesterola uspjeli kolonizirati. H. pylori pregled lipopolisaharid često prikazuje Lewis X i /ili Y antigena. Izražavanje tih antigena mjerene cijela stanica ELISA značajno je poboljšana, kao odgovor na rast soja SS1, 26695 ili G27 u kolesterola. Osim toga, u elektroforetskome analiza lipopolisaharida u divljeg tipa G27 i na mutantima nedostaje O-lanac otkrila strukturne promjene unutar oligosaharida core /lipid A skupina. Ovi odgovori u razinama Lewis antigena i kod lipopolisaharidom profila na dostupnost kolesterola bile su visoko specifična, jer nema promjena dogodila kada je kolesterol bio supstituiran s beta-sitosterol ili žučnih soli. Poremećaj genima kolesterola a-glukoziltransferaze ili lipid A fosfoetanolamin transferaze nije imao učinka na Lewis ekspresiju, niti na lipopoli profila, niti na kolesterol odgovora na ta svojstva. Poremećaj lipida A 1-fosfataza gen eliminira utjecaj kolesterola u lipopolisaharid profila, ali ne utječe na Lewis ekspresiju.
Zaključci
Zajedno ovi rezultati ukazuju da kolesterol osiromašeni vodi aberantnih oblike LPS koji su ovisni o defosforiliranje lipida A na položaju 1. Pokusni model za opaženih učinaka kolesterola je objašnjeno u kojem uzastopne korake lipopolisaharid biogeneze i, neovisno, prezentacija Lewis antigena na staničnoj površini, ovisi o sastavu membrane. Ovi novi nalazi pokazuju da dostupnost kolesterola dopušta H. pylori pregled mijenjati svoje stanica omotnicu na načine koji mogu utjecati na kolonizaciju tkiva domaćina, in vivo pregled.
Pozadina pregled, Helicobacter pylori pregled je vrlo niša -adapted patogen koji nastanjuje ljudski želudac, prenosi prvenstveno unutar obitelji, a ne zna rezervoar okoliša. Kronične infekcije mogu biti asimptomatski ili uzrokovati gastritis, ulkus, ili raka želuca. Da bi se uspostavila infekcija, bakterija mora preživjeti tranzit kroz kiseli želučani kupe [1]. Ona prodire i utvrđuje prebivalište u zaštitnoj sluzi sloj, lipid- i kolesterolom bogate okoliš [2, 3]. U okviru ove niše bakterija zapošljava razne mehanizme da izbjegne odgovor imunog sustava domaćina.
Lipopolisaharida (LPS) na površini H. pylori
su modificirani za prikaz određenih ljudskih krvnih grupa antigeni, u prvom redu Lewis antigene X i Y [ ,,,0],4-7], a rjeđe H tip 1, i-antigen, krvna grupa a ili Lewis antigene a ili B [8-10]. Ove površine LPS antigeni su potrebne za uspostavu infekcije, jer mutirani sojevi neispravna za sintezu LPS O-antigen ili Lewis X /Y izražavanja ne koloniziraju miševe [11-13]. Postoje dokazi da je ekspresiju antigena Lewis na bakterijske površinu doprinijeti pridržavanju H. pylori
do želučanih epitelnim stanicama [10, 14], i igra važnu ulogu u tropizma tkiva [15-17]. Želučani epitelne stanice također izražavaju Lewis antigene [18, 19], što ukazuje da je prikaz Lewis antigene na bakterijske površinu može poslužiti kao strategija mimika. Studije kliničkih izolata [18, 20] i eksperimentalnih infekcija u životinja [21] podržati ovu ulogu bakterijska Lewis antigeni u imunološkom evazije. U ljudskom infekcije H. pylori pregled Lewis antigeni su povezani s težini peptički ulkus duodenalne [16, 22]. Druga važna značajka H. pylori
LPS je njegova modificirana lipid A struktura, sa smanjenom acilacije i manje nabijenih skupina nego što je tipično za enterobakterija [23]. Ovi lipidi a izmjene se smanjila endogenski i protuupalna svojstva H. pylori pregled LPS (prikaz u [24]). Pregled Kolesterol je esencijalna hranjiva tvar za H pylori pregled, iako to potiče rast mediju bez seruma [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
posebno inkorporirati kolesterola u bakterijsku membranu [27], kao i ograničen broj patogenih i istim stolom bakterije, uključujući Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus Netlogu, Lyme sp
., Mikoplazme i pregled [ ,,,0],28-30]. Kolesterol može ojačati membranu u tih organizama [30-32]. H. pylori
i jedinstveno tvore kolesterola a-glikozid [33, 34], i to metabolit može se dalje modificirati ili acilacijom phosphatidylation [34]. Alfa-glucosylated kolesterol ruši domaćin imuni odgovor na bakteriju u mišjem modelu, kroz suzbijanje fagocitoze i aktivacije [35]. Ostale uloge kolesterola i kolesterola metabolita u bakterijsku membranu još treba istražiti. U ovom izvještaju, pokazujemo da biosinteza lipopolisaharida, uključujući ekspresiju Lewis antigenu i LPS jezgre /lipida A modifikacije mijenjaju dostupnost kolesterola u mediju za rast. Predstavljamo podatke koji ukazuju da su ove promjene u staničnoj omotnici može značajno utjecati na interakciju patogen /domaćin u životinjskom modelu infekcije.
Metode
bakterijskih sojeva i uvjetima rasta
sojeva H pylori pregled One se očituju u laboratorijski soj ATCC43504 (porijeklo: Australija), 26695 (Velika Britanija), klinički izolat G27 (Italija [36], pod uvjetom N. Salamom), miš prilagođen soj SS1 (Australija, pod uvjetom Adrian Lee [37]). Bakterije su održavane na 37 ° C u atmosferi s 5 microaerobic% O 2/10% CO 2 na Campylobacter krvnom agaru (CBA). Bakterije su pasažirane svaka 2 do 3 dana, a ne više od 25 dana, kako bi se smanjila genetike. Za rast u kemijski definiranom mediju [26], bakterije su inokulirane sa CBA u tikvice za kulturu tkiva koje sadrže Hamov F12 (Gibco) s 1 mg /ml goveđeg seruma albumina (masne kiseline, Sigma A7906), iz kojeg se u kao što je definirano mediju. Tekuće kulture su proslijeđene dnevno razrjeđivanjem u svježi medij pri početnim gustoći 1-2 × 10 6 /ml, a koristi se pri prolazu 3. do 5. stanične kulture grade kolesterola (99%, Sigma) dodaje se u F12 kao stabilan 10 × emulzije koja sadrži 500 ug /ml kolesterola koji je raspršen u 10 mg /ml albumina, koji je pripremljen u skladu s [38]. Sljedećih medija dodaci su izvedeni na isti način: P-sitosterol (sintetski, 95%), natrijev taurokolat, natrijev glikokolat, beta-estradiol, progesteron (sve od Sigme), dehidroepiandrosteron (Calbiochem) i P-koprostanolni (Matreya) . pregled dioba određena tijekom rasta logaritamske faze kvantitativnim vijabilnih stanica pomoću reagenta staničnog titra Glo (Promega), kao i potvrđeni su opisali [39]. Mjerenje biomase kao CFU, kao staničnog proteina, ili kao ATP svi su proizvedene dosljedne rezultate. Vrijednost od 1 attomol ATP po stanici [40] pretpostavljalo za rutinsko prolaz. Mogući netočnost ove vrijednosti ne bitno utjecati na interpretaciju podataka.
Izogeni genske poremećaje postignuti su umetanjem Campylobacter coli
element za rezistenciju na kloramfenikol (mačka pregled) u skladu sa strategijom opisao Chalker sur
[41]. Prajmeri su pažljivo dizajnirani kako bi ciljali sekvence unutar otvorenih okvira čitanja, a navedeni su u tablici 1. Fuzijski PCR reakcije pomoću PCR ekstendera sustava (5Prime) sadržavala 2.3 nM svaki gel pročišćen predložak, 50 uM primera, 1 × podešavanje pufer 1,25 mm dodatna Mg ++, 0,2 mM svakog dNTP i 0,01 U /ul polimeraze. Uvjeti fuzijski ciklusa bili su kako slijedi: 94 ° C 2.5 min, 10 ciklusa [94 ° C 15 sek, 45 ° C 60 sekundi, 68 ° C 60 sek po kb], 25 ciklusa [94 ° C 15 s, primer specifičan Tm 30 sekundi, 68 ° C 60 sek po kb] finalne ekstenzije 68 ° C 6-8 min. Fuzijski produkti se ponovno pojača s Pfx50 (Invitrogen) da se poveća količina, zatim pročisti pomoću Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Sojevi primatelja uzgaja 1 dan na CBA transformira se s 500 ng konačnog produkta amplifikacije, koristeći prirodni transformaciju [42, 43], a zatim selekcijom 7-10 dana na CBA koji sadrži 15 ug /ml kloramfenikola. Da se osigura alela zamjenu, rezultirajući sojevi su ocijenjeni pomoću PCR genomske DNK GoTaq (Promega) s primerima navedenim u tablici 1. PCR strategija i rezultati prikazani su na slici 1. 1.Table sekvencijama. Pregled primeri za ometanje aleličke
u
CAT FWD [41] pregled GATATAGATTGAAAAGTGGAT pregled F5b pregled MAČKA okretaja [41] pregled TTATCAGTGCGACAAACTGGG pregled cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga pregled cgtM3 pregled ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg pregled cgtM5 pregled CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt pregled cgtrev pregled ctctgatcgcttcttcataaact pregled pmifwd pregled atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg pregled pmiM3 pregled ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac pregled pmiM5 pregled CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac pregled pmirev pregled ttttgtctgttaaaatcatcatcaat pregled lpxE fwd pregled atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc pregled lpxEM3 pregled ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat pregled lpxEM5 pregled CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag pregled lpxErev pregled ttaaggctttttggggcttgtaaa pregled eptAfwd pregled ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3 pregled ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata pregled eptAM5 pregled CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca pregled eptArev pregled ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
dodatne početnice za potvrdu prekida gena
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective brojevi gena u javnim bazama podataka za 26695 i G27 su kako slijedi: [CGT: hp0421, G27_952 pregled], [PMI pregled (rfbM pregled): hp0043, G27_38 pregled], [lpxE: hp0021, G27_20 pregled], [EPTA. hp0022, G27_21 pregled]
bRighthand stupac sadrži kratke primera oznake se koriste na slici 1. pregled, Slika 1 PCR provjera alelskih poremećaja u H. pylori soj G27. Genomska DNA je pripremljen iz genskoj poremećen G27 sojeva sljedeća tri prolaza pod izboru kloramfenikol, a zatim PCR-om, kao što je prikazano u svakoj shemi. Sekvence primera su dani u tablici 1. A. narušavanja CGT. Pet primjeri su prikazani od sedam pojedinačnih klonova, od kojih su svi dali identične rezultate u ekranu. B. Poremećaj PMI (rfbM). Cijeli kloramfenikol otporan populacija propušten u svakom kruga selekcije bez klonalne selekcije. C. Poremećaj lpxE i EPTA. Cijeli kloramfenikol-otporni populacija propušten je u svakom krugu izbora, bez klonske selekcije.
želučane kolonizaciju pregled Eksperimenti na životinjama su odobreni od strane Njega životinja i korištenja odbora LSUHSCS Institucionalno. Ženski mongolskih gerbila su se održavale na običnoj dijeti ad libitum pregled. Sačuvati motilitet, H. pylori pregled soj SS1 je kultivirana preko noći u uvjetima microaerobic u T75 tikvice koje sadrže 40 mililitara F12 mediju s 0,4 mg /ml albumina i 0 ili 50 ug /ml kolesterola. Pokretljivih planktonske bakterije su sakupljene centrifugiranjem i ponovno suspendirane u izotoničnoj slanoj otopini. Formiranje jedinica kolonija (CFU) izmjerene su u tim inokuluma serijskim razrjeđivanjem i nanošenja na CBA, a ta mjerenja potvrdila jednaku dozu bakterija sposobnih za život dviju uvjetima rasta. Približno 10 8 CFU po 30 ul su dati oralno životinjama (n = 6 do 9 po skupini). Životinje su eutanazirane 11 dana poslije, želuci su uklonjeni i izrezana. H. pylori pregled prisutan antruma želuca homogenatima kvantificirane su razrjeđenja i nanošenja na CBA koji sadrži 5-fluorcitozin (5 ug /ml), vankomicin (10 ug /ml), amfotericin B (5 ug /ml), bacitracin ( 30 ug /ml), polimiksin B (10 U /ml), te trimetoprim (10 ug /ml) [44]. Dvostruke CFU determinante su napravljene za višestruka razrjeđenja svakog uzorka tkiva.
Cjelostanična ELISA pregled Uobičajene procedure [6, 7, 45], prilagođena je za upotrebu peroksidazno konjugiranim sekundarnim antitijelom. Sva antitijela su dobiveni iz Calbiochem. Preko noći kulture bakterije su sakupljene centrifugiranjem na 3500 × g
10-15 min, isprana u Dulbecco-vog fosfatnog pufera, a repelleted na 10,000 × g pregled 2 min, zatim se ponovno suspendiraju u 15% glicerol /0.9% NaCl. Stanične suspenzije su analizirani na sadržaj proteina i pohranjeni na -20 ° C. Uzorci stanica koje sadrže poznate količine proteina se brzo razrijeđena u 50 mM natrij-bikarbonat /karbonat pH 9,55 i odmah raspodijeljena su u jažice ELISA ploče (Costar΅7). Ploče su zapečaćene i u hladnjaku preko noći, a zatim blokirane tijekom 90 minuta s 3% albumina goveđeg seruma otopljen u puferu za ispiranje koja se sastojala od 0.1 M natrij fosfata pH 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% w /v Tween-20. Primarna antitijela, monoklonsko anti-Lewis X (pečatni klon P12) ili anti-Lewis Y (pečatni klon F3), razrijeđen u omjeru 1: 500 u puferu za ispiranje /1% BSA, doda se tijekom 2 sata, a zatim četiri promjene pufera za ispiranje. Sekundarna protutijela, 1 a: 2500 razrjeđenje peroksidaza-konjugiranog kozjeg anti-mišjeg IgM u puferu za ispiranje /1% BSA, doda se tijekom 90 minuta, a zatim četiri promjene pufera za ispiranje. Kromogenog supstrata je 0.42 mM tetrametilbenzidin i 0,02% H 2O 2 u 50 mM acetat /citrat pH 5.5 [46]. Nakon 15 minuta na sobnoj temperaturi, reakcija je zaustavljena s 1/5 vol 2.5 N 'H sub> 2SO 4, te promjenu boje izmjerena je u čitaču pločica na 450 nm. U negativnoj kontroli izostavljanje ili primarnog ili sekundarnog protutijela, ili E. coli
soja HB101 supstituirani za H. pylori pregled, promjena boje bio je zanemariv (A < 0,05). Razine Lewis Y su zanemarive (A 0.1) u soj 26695 ili 43504, kao što su Lewisova X razina u SS1 pregled Electrophoretic analize lipopolisaharida
H. pylori
kulture su prikupljeni na gore opisani način, i ispere. stanične pelete se čuvaju na -70 ° C. Stanice su lizirane u 60 mM Tris HCl pH 6,8 koji sadrži 2% SDS, na 95-98 ° C tijekom 10 minuta. Izmjeren je sadržaj proteina pomoću testa bicinkroniničnoj kiseline (Pierce). Uzorci staničnim lizatima namjesti na jednakim udjelom proteina (1 mg /ml), a zatim proteolizirati u reakcije s (konačna) 60 mM Tris HCl pH 6,8, 0,67% SDS, te 0,67 mg /ml proteinaze K na 60 ° C tijekom 2 sata [47]. Eliminirati elektroforetskih artefakti zbog prisutnosti lipid /detergentnih kompleksa proteolizirati uzorci se ekstrahiraju vrućom fenolom [48]. Kontrolni eksperimenti potvrdili su da se svi LPS bendova nadoknaditi sljedećim postupkom ekstrakcije kvalitativno i bez predrasuda. Proteolizirati uzorci su pomiješani s 1 volumenom 90% vodenoj otopini fenola i inkubirani na 70 ° C tijekom 20 minuta. Nakon hlađenja na 10 ° C kroz 1 min, uzorci su centrifugirani pri 12.000 x g
tijekom 20 minuta na 10 ° C, a vodena faza je sakupljena. Fenolni faze se ponovno ekstrahiraju s 1 volumenom H 2O na 70 ° C tijekom 10 minuta, te se centrifugiranje ponavlja. Spojeni vodeni ekstrakti se podesi na 0,5 M NaCl i istaložen s 10 vol etanola u hladnjaku preko noći, nakon čega se centrifugira pri 20.000 × g
tijekom 20 minuta na 10 ° C i osušena na zraku. Pročišćena LPS Uzorci su ponovo otopljene u Laemmli uzorka pufera [49] na 95 ° C tijekom 5 minuta. Uzorci su naneseni na 15% poliakrilamid /0.9% bis minigels sadrži 3.2 M ureu s Laemmli diskontinuirane pufer [49], a skupljeni gel 5%. Nakon elektroforeze na 150 V tijekom 75 min, gelovi su ili fiksni preko noći bojanje srebrom [50] i prenese polyvinylidenedifluoride membranu koristeći transfer Tris /glicin pufer [51]. Mrlje su blokirane preko noći u 3% albumina goveđeg seruma i 0.03% NaN 3 u puferu za ispiranje je gore opisan za ELISA. Primarna protutijela (anti-Lewis X ili anti-Lewis Y, 1: 200) i sekundarnih protutijela (peroksidaza konjugirani kozji anti-mišji IgM, 1: 1000) je razrijeđen u puferu za ispiranje koji sadrži 0,5% BSA. Kolorimetrijska otkrivanje koristi 3,3'-diaminobenzidinu s kobaltom pojašnjenje [52]. Denzitometrija je provedena s aplikacijskim slike iz javne domene J, dostupno na http:.... //RSB info NIH gov /ij pregled Rezultati
malo se zna o fizioloških uloga kolesterola u BiH . pylori pregled. Da bi istražili odgovore H. pylori
na kolesterol, usvojili smo definiranu, medij kulture bez seruma, F12 s 1 mg /ml albumina, u kojoj je ova bakterija može biti stabilno pasirati [26]. Ova skromna koncentracija albumina potiče rast [25, 26] i ublažava čvrsto pridržavanje za kulturu površinama koje se pojavljuje u medijima bez proteina [53]. U tom definiranom mediju s dodatkom 50 ug /ml, kolesterol se nije značajno promijenila rast (slika 2). Odsutnost utjecaja rasta pod odabranim uvjetima kulture bio je povoljan za istraživanje fiziološke važnosti kolesterola u H. pylori
. Na taj način, bili smo u mogućnosti usporediti želučane kolonizaciju gerbila sojem SS1 koje su kultivirane u definiranom mediju koji je sadržavao različite količine kolesterola (Slika 3). Jedanaest dana nakon oralnog inokulacije, H. pylori pregled kod želučanog antruma selektivno su stavljene i kvantificirane. Izrazito se gerbili su kolonizirani samo kultura uzgaja u mediju koji sadrže kolesterol, ali ne i H. pylori
uzgaja na kolesterol mediju (u svakom eksperimentu, P < .0001 za usporedbu log (CFU /g) između grupa koje koriste Student dvosmjerni t-test). Dakle, kolesterol je bitan dio medija za rast kako bi se uspostavila H. pylori pregled infekcije u ovom životinjskom modelu. Slika 2 Dodavanje kolesterola u definiranom mediju ne utječe na stopu rasta H. pylori. Paralelne kulture svakog soja su rasle preko noći u F12 /albumina (1 mg /ml) u odsutnosti (otvoreni bara) ili prisutnosti (zasjenjeni stupci), 50 ug /ml kolesterola. Početni gustoća naseljenosti bila 2 × 106 /ml. Vrijeme udvostručenja su izračunati iz izmjerene povećanja biomase. Vrijednosti prikazane predstavljaju srednja vrijednost ± SD od pet ili više neovisnih mjerenja. n pregled. a pregled. Studentski dvosmjerni t-test za parovima podataka nije pokazala statističku značajnost.
Slika 3 H. pylori uzgajati bez kolesterola ne kolonizirati gerbili. H. pylori pregled soj SS1 narasla je tijekom noći u definiranom mediju koji sadrži 0 ili 50 ug /ml kolesterola. Gerbila oralno inokulirane sa 3,5 x 108 CFU (Pokus A) ili 1 x 108 cfu (Pokus B). H. pylori pregled u želučanom antrumu se kvantificiraju u 11 dana. Svaka okomita traka predstavlja srednju ponovljenih određivanja za jednu životinju, a horizontalne linije daju prosječne vrijednosti za svaku grupu tretmana. Gdje se oporavio nema kolonije, vrijednosti su zabilježene kao 5 × 102 CFU /g tkiva, procijenjene granice detekcije.
Nekih sojeva H. pylori
izlagao značajne razlike u pridržavanju za kulturu plovila sljedeće prolaz u kolesterola, što ukazuje promjene u svojim staničnih površinskih svojstava (Hildebrandt & McGee, neobjavljeni opažanja). Iz tog razloga, odlučili smo istražiti lipopolisaharide, koji čine glavni sastojak stanične omotnica, a služe za predstavljanje biološki važne Lewis antigene. zaposleni smo dobro ustrojen cijele stanice ELISA postupkom kako bi se odredila vladajuća Lewis antigene, Lewis X i Y (Slika 4). Sukladno literaturi [54, 55], ponajprije Lewis X je otkriven u soj 26695 samo Lewis Y je otkriven u SS1 i značajne razine oba primijećeni u G27. U svakom slučaju, apsorpcija bila nelinearna u odnosu na uzorkovanje tereta, pojave koja nije neobično u ELISA [56], te da je navedeno od strane drugih istraživača koji koriste te iste monoklonski [7]. Tako, da bi se usporedila antigen razine u uzorcima H.pylori
kultivirane u odsutnosti ili prisutnosti kolesterola, izveli smo paralelne titracije u rasponu od uzorka punjenjima koja variraju od 20 do 500 ng staničnog proteina po jažici. Ovi titracije ponovljivo pokazalo značajno povećanje količine Lujzove X i /ili Lewis Y antigenom detektiran na površini stanice kada H. pylori pregled sojevi 26.695, SS1 ili G27 je uzgajan u prisutnosti kolesterola (Slika 4). U replikata neovisna pokusa, srednja kolesterola ovisna povećanja su statistički značajne (Tablica 2). Usporedivi rezultati postignuti su za Lewis X u soj 43504 (podaci nisu prikazani). Poraslo uzorke s kolesterolom na kraju razdoblja rasta ne mijenja količinu Lewisove antigena detektirana pomoću ELISA (Slika 5A). U drugom kontrolnom eksperimentu smo potvrdili za sve četiri od tih sojeva količina staničnog proteina vezanog na jažice ne utječe rast kolesterola (slika 5B). ELISA rezultati na taj način utvrdila da povećana ekspresija površina Lewis antigena bila legitimna biološki odgovor na kolesterol koji se dogodio u svim testiranih sojeva. Ovaj odgovor je bio specifično za kolesterol, zbog supstitucije kolesterola u mediju za rast s strukturni analozi p-sitosterola i natrij-taurokolatom nije imao učinka na Lewis X ili Y ekspresija G27 (slika 4, desnog panela, i Tablica 3). Odgovor Lewis antigen na kolesterol i dalje ostao nakon prekida gena za kolesterol a-glukoziltransferaze (CGT
) u soja G27 (Tablica 2, a vidi dolje) i 26695 (podaci nisu prikazani), što isključuje sudjelovanje a glikozidne metaboliti cholesterol.Table 2 Jačanje ekspresiju stanične površine Lewis antigena rastom kultura u prisustvu cholesterol.a pregled
povećanje puta u odnosu na paralelni kolesterola bez kulture
pregled Lewis X
Lewis Y
pregled, srednja vrijednost ± SEM (n)
P vrijednost
srednja vrijednost ± SEM (n)
P vrijednost
26.695 pregled 4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
ne obavlja pregled SS1 ne
obavlja pregled, 1,88 ± 0,08 (5) pregled 0,0004
G27 divlji tip pregled 2.85 ± 0,42 (8)
0.0033
2,22 ± 0,24 (8) pregled 0.0016
G27 CGT :: mačka
3,69 ± 0,34 (5)
0.0013
2,88 ± 0,30 (5)
0.0034
G27 lpxE :: mačka
2,59 ± 0,50 (6) pregled 0,025 pregled
2,47 ± 0,43 (7) pregled 0,014
Lewisove antigeni su kvantificirani u replicirati cijele stanice ELISA analize uparenih uzoraka uzgajaju u prisustvu ili odsustvu 50 ug /ml kolesterola. Opterećenje antigen 300 ng staničnih proteina po dobro. Pokazatelji za plus: minus kolesterola izračunate su iz ponovljenih neto apsorpcija u svakom pokusu, a odnosi određene u pet do osam nezavisnih ELISA staze su tada u prosjeku. P vrijednosti izračunate su na dva kraka Student t-testa za nultu hipotezu da je omjer iznosi 1. pregled Tablica 3 Enhanced na površini stanica Lewis izražavanje antigena je kolesterol specifičan pregled pregled struko povećanje u odnosu na paralelni kolesterola bez kulture
pregled Lewis X
Lewis Y pregled
pregled, srednja vrijednost ± SEM (n)
P vrijednost
srednja vrijednost ± SEM (n)
P vrijednost
pregled kolesterol pregled 2,96 ± 0,22 (5)
.0008
2,48 ± 0,10 (4) pregled, .0007
β- sitosterol
1,80 ± 0,47 (4) pregled, 0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0,28
taurokolata pregled 0,64 ± 0,16 (4) pregled 0.12
0,84 ± 0,20 (3)
0,52
Lewis antigeni su kvantificirani u repliciraju cjelostanično ELISA analize parovima kultura H. pylori pregled G27 uzgajaju u prisustvu ili odsustvu od 130 uM kolesterola, ili nekog jednaka koncentracija beta-sitosterol ili natrijev taurokolata. Opterećenje antigen 300 ng staničnih proteina po dobro. Pokazatelji za plus: minus kolesterola izračunate su iz ponovljenih neto apsorpcija u svakom pokusu, a odnosi utvrđeni u tri do pet nezavisnih ELISA staze su tada u prosjeku. P vrijednosti izračunate su za dvosmjerni Student t-testa za nultu hipotezu da je omjer iznosi 1. pregled Slika 4 rasta kolesterola posebno poboljšava staničnoj površini prikaz Lewis antigena. Cijela stanica ELISA testovi provedeni su na uzorcima H. ​​pylori pregled soj 26695 (gore lijevo), SS1 (dolje lijevo) ili G27 (gornji i donji desni). Paralelne kulture su rasle preko noći u definiranom mediju koji sadrži 130 uM slijedećim dodacima: krugovima, bez dodatka; trgovi, kolesterola; trokuta, β-sitosterol; X, taurokolata. Različite količine stanične suspenzije odgovaraju poznatim količinama staničnog proteina aplicira se na duple jažice ELISA ploče, a za immunoassayed prisutnosti Lewis X ili Lewis Y antigenom kao što je opisano u Methods
. Negativni kontrolni uzorci E. coli
HB101, ili tampon-samo praznine, pao na točkasta linija. Apsorpcija pojedinih bušotina nacrtane. Ponovljeni pokusi s tri ili više neovisno uzgajaju kulture dale su u biti identične rezultate.
Slika 5 eksperimente kontrole ELISA. A. vrhova sa kolesterola na kraju razdoblja rasta ne mijenja izraz Lewis antigena. Kulture H.pylori pregled su rasle preko noći u definiranom mediju bez (kontrola) ili s 50

• Korisnost Citokeratini 7 i 20 (CK7 /20) imunohistokemijski u razlici od kratkog segmenta Barrett jednjak od želuca intestinalne metaplazije: Je li to pouzdan
• Dodavanje gela pH-osjetljivih poboljšava stabilnost mikroemulzije za ciljanu uklanjanje kolona ammonia