Helicobacter pylori lipopolysakkarid modifikasjon, Lewis-antigen ekspresjon, og gastrisk kolonisering er kolesterol-avhengige

Helicobacter pylori
lipopolysakkarid modifikasjon, Lewis antigen uttrykk, og mage kolonisering er kolesterol-avhengige
Abstract
Bakgrunn
Helicobacter pylori
spesifikt tar opp kolesterol og inkorporerer den inn i bakteriemembranen, men lite er i dag kjent om kolesterol fysiologiske roller. Vi sammenlignet fenotyper og in vivo
kolonisering evne av H. pylori
dyrket i et definert, serumfritt vekstmedium, F12 med 1 mg /ml albumin inneholdende fra 0 til 50 ug /ml kolesterol.
Resultatene
Mens doblingstidene ble i stor grad upåvirket av kolesterol, ble observert andre utilslørt fenotypiske endringer. H. pylori
belastning SS1 vokst i definert medium med kolesterol vellykket kolonis magen av ørkenrotte, mens SS1 dyrket uten kolesterol ikke klarte å kolonisere. H. pylori
lipopolysakkarid viser ofte Lewis X og /eller Y-antigener. Ekspresjon av disse antigenene, målt ved helcelle-ELISA ble markert forbedret i respons til vekst av stamme SS1, 26695, eller G27 i kolesterol. I tillegg, elektroforetisk analyse av lipopolysakkarid i villtype G27 og i mutanter som mangler O-kjeden viste strukturelle endringer i de oligosakkarid-kjerne /lipid A-deler. Disse svarene i Lewis antigen nivåer og i lipopolysakkarid profiler til kolesterol tilgjengelighet var svært spesifikk, fordi ingen endringer skjedde da kolesterol ble erstattet av beta-sitosterol eller gallesalter. Forstyrrelse av genene som koder for kolesterol α-glukosyltransferase eller lipid A phosphoethanolamine transferase hadde ingen effekt på Lewis uttrykk, og heller ikke på lipopolysakkarid-profiler, og heller ikke på kolesterol responsen til disse egenskapene. Forstyrrelse av lipid A 1-fosfatase-genet elimineres effekten av kolesterol på lipopolysakkarid-profiler, men ikke dens effekt på Lewis uttrykk.
Konklusjoner
Sammen tyder disse resultater på at kolesterol uttømming fører til avvikende former for LPS som er avhengig av defosforylering av lipid A i 1-stilling. En tentativ modell for de observerte virkninger av kolesterol er omtalt i hvilken sekvensielle trinn av lipopolysakkarid biogenese og, uavhengig av hverandre, presentasjon av Lewis-antigen på celleoverflaten, avhengig av membransammensetning. Disse nye funnene viser at kolesterol tilgjengeligheten tillater H. pylori
å endre sin celle konvolutt på måter som kan påvirke kolonisering av verten vev in vivo
.
Bakgrunn
Helicobacter pylori
er en svært nisje -adapted patogen som bebor den menneskelige magen, sendes primært innenfor familier, og har ingen kjente miljø reservoaret. Kroniske infeksjoner kan være asymptomatisk eller forårsake gastritt, magesår, eller magekreft. For å etablere infeksjon, må bakterien å overleve transitt gjennom sur maverommet [1]. Det trenger og etablerer bosted i den beskyttende slimlaget, et lipid og kolesterol-rikt miljø [2, 3]. Innenfor denne nisjen bakterien benytter en rekke mekanismer for å unndra vertens immunrespons.
Lipopolysakkarider (LPS) på overflaten av H. pylori
er modifisert for å vise visse humane blodgruppeantigener, i første rekke Lewis-antigener X og Y [ ,,,0],4-7], og sjeldnere H type 1, i-antigen, blodtype A, eller Lewis antigener A eller B [8-10]. Disse overflate LPS antigener er nødvendige for etablering av infeksjon, fordi mutantstammer defekte for LPS O-antigen syntese eller for Lewis X /Y-ekspresjon ikke klarer å kolonisere mus [11-13]. Det er dokumentert at Lewis antigener uttrykt på bakterieoverflaten bidra til etterlevelse av H. pylori
til mage epitelceller [10, 14], og spille en rolle i vev tropisme [15-17]. Gastriske epitelceller uttrykker også Lewis-antigener [18, 19], som tyder på at visningen av Lewis-antigener på bakterieoverflaten kan tjene som en etterligning strategi. Studier av kliniske isolater [18, 20] og eksperimentelle infeksjoner hos dyr [21] støtter denne rollen for bakteriell Lewis antigener i immununndragelser. I menneske-smitte, har H. pylori
Lewis antigener vært knyttet til alvorlighetsgraden av magesår og duodenitt [16, 22]. En annen viktig funksjon av H. pylori
LPS blir dens modifisert lipid A struktur, med redusert acylering og færre ladede grupper enn det som er typisk for enterobakterier [23]. Disse lipid A modifikasjoner minimal endotoksiske og inflammatoriske egenskaper av H. pylori
LPS (gjennomgått i [24]).
Kolesterol er et ikke-essensielt næringsstoff for H pylori
, selv om den fremmer vekst i serumfritt medium [ ,,,0],25, 26]. H. pylori
spesifikt innlemme kolesterol i det bakterielle membranen [27], som gjør et begrenset antall av patogene og kommensale bakterier som Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp
., Og Mycoplasma product: [ ,,,0],28-30]. Kolesterol kan forsterke membranen i disse organismene [30-32]. H. pylori
også entydig danne kolesterol α-glykosid [33, 34], og denne metabolitten kan bli ytterligere modifisert ved acylering eller phosphatidylation [34]. Alfa-glykosylerte kolesterol subverts vertsimmunrespons til bakterien i en musemodell, ved undertrykkelse av fagocytose og av T-celleaktivering [35]. Andre roller for kolesterol og kolesterol metabolitter i bakteriemembranen har ennå å bli utforsket. I denne rapporten, viser vi at biosyntesen av lipopolysakkarid, herunder Lewis-antigen ekspresjon og LPS kjerne /lipid A modifikasjon, blir endret ved tilgjengeligheten av kolesterol i vekstmediet. Vi presenterer data som indikerer at disse endringene i cellen konvolutten kan betydelig påvirke patogenet /verts samhandling i en dyremodell for infeksjon.
Metoder
Bakteriestammer og vekstvilkår
Stammer fra H pylori
inkluderte laboratorium stamme ATCC43504 (opprinnelse: Australia), 26695 (UK), klinisk isolat G27 (Italia [36], levert av N. Salama), og musen tilpasset belastningen SS1 (Australia, levert av Adrian Lee [37]). Bakteriene ble holdt ved 37 ° C i en microaerobic atmosfære av 5% O 2/10% CO 2 på Campylobacter blodagar (CBA). Bakterier ble passert hver 2 til 3 dager, og for ikke mer enn 25 dager, for å minimere genetisk drift. For vekst i kjemisk definert medium [26], ble bakterier inokulert fra CBA til vevsdyrkingskolber inneholder Hams F12 (Gibco) med 1 mg /ml bovint serumalbumin (fettsyre-fritt, Sigma A7906), referert til i hele som definert medium. Flytende kulturer ble passert daglig ved fortynning inn i friskt medium ved innledende densiteter på 1-2 x 10 6 /ml, og ble brukt ved passasje 3 til 5. Cellekultur grad kolesterol (mer enn 99%, Sigma) ble tilsatt til F12 som en stabil 10 x emulsjon inneholdende 500 ug /ml kolesterol dispergert i 10 mg /ml albumin, som ble fremstilt i henhold til [38]. De følgende medier tilsetninger ble utført på lignende måte: p-sitosterol (syntetisk, 95%), natrium taurocholat, natrium glykokolat, β-østradiol, progesteron (alle fra Sigma), dehydroepiandrosteronsulfat (Calbiochem), og β-koprostanol (Matreya) .
Dobling ganger ble bestemt under log fase vekst ved å kvantifisere levedyktige celler bruker Cell Titer Glo reagens (Promega) som validert og beskrevet [39]. Måling av biomasse som CFU, som cellulært protein, eller som ATP har alle produsert konsistente resultater. En verdi på 1 attomol ATP per celle [40] ble antatt for rutinemessig passasje. Mulig unøyaktighet av denne verdien ikke fundamentalt påvirke tolkning av data.
Isogene genet avbrudd ble oppnådd ved innsetting av en Campylobacter coli
kloramfenikol motstandselement (katt
) i henhold til strategien beskrevet av Chalker et al
[41]. Primere ble omhyggelig konstruert slik at target-sekvens i løpet av åpne leserammer, og er listet i tabell 1. Fusion PCR-reaksjoner ved bruk av PCR-utvid System (5Prime) inneholdt 2,3 nM hver gelrenset mal, 50 uM primer, 1 x tuning buffer, 1,25 mM ytterligere Mg ++, 0,2 mM av hver dNTP, og 0,01 U /pl polymerase. Fusjonssyklus var som følger: 94 ° C 2,5 minutter, 10 sykluser [94 ° C 15 sek, 45 ° C 60 sek, 68 ° C 60 sek per kb], 25 sykluser [94 ° C 15 sek, primer-spesifikk Tm 30 sek, 68 ° C 60 sek per kb], slutt forlengelse 68 ° C 6-8 min. Fusjonsprodukter ble reamplifisert med Pfx50 (Invitrogen) for å øke mengden, og deretter renset ved anvendelse av Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Mottaker stammer dyrket en dag på CBA ble transformert med 500 ng av den endelige amplicon ved hjelp av naturlig transformasjon [42, 43] etterfulgt av valg i 7-10 dager på CBA inneholder 15 mikrogram /ml kloramfenikol. For å sikre allelisk erstatning, ble de resulterende stammer undersøkt ved hjelp av PCR fra genomisk DNA ved bruk GoTaq (Promega) med primere som er angitt i tabell 1. PCR-strategi og resultatene er vist i figur 1.Table en primersekvenser.
primere for allel avbrudd
en
CAT fwd [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
LPXe fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
flere primere for bekreftelse av genet avbrudd
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective genet tall i offentlige databaser for 26695 og G27 er som følger: [CGT: hp0421, G27_952
], [PMI plakater (rfbM
): hp0043, G27_38
], [LPXe: hp0021, G27_20
], [EPTA. hp0022, G27_21
]
bRighthand kolonnen viser de korte primer betegnelser som brukes i Figur 1.
Figur 1 PCR verifikasjon av allele forstyrrelser i H. pylori belastning G27. Genomisk DNA ble fremstilt fra gen-forstyrret G27 stammer følgende tre passasjer i henhold kloramfenikol utvalg, deretter PCR forsterket som vist i hver ordning. Primere sekvenser er gitt i tabell 1. A. Forstyrrelse av cgt. Fem eksempler er vist med syv individuelle kloner, som alle ga identiske resultater i skjermen. B. Forstyrrelse av PMI (rfbM). Hele kloramfenikol-resistent befolkningen ble passert i hver runde av valget, uten klonal seleksjon. C. Forstyrrelse av LPXe og EPTA. Hele kloramfenikol-resistent befolkningen ble passert i hver runde av valget, uten klonal seleksjon.
Gastric kolonisering
Dyreforsøk ble godkjent av LSUHSCS Institutional Animal Care og bruk komité. Kvinnelige mongolske ørkenrotter ble opprettholdt på vanlig diett ad libitum
. For å bevare motilitet, ble H.pylori
belastning SS1 dyrket over natten under microaerobic betingelser i T75-kolber inneholdende 40 ml F12-medium med 0,4 mg /ml albumin og 0 eller 50 ug /ml kolesterol. De bevegelige planktoniske Bakteriene ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i isotonisk saltvann. Kolonidannende enheter (CFU) ble målt på disse podestoffer ved seriell fortynning og utsåing på CBA, og disse målingene bekreftet lik dosering av levedyktige bakterier mellom de to vekstbetingelser. Omtrent 10 8 CFU per 30 mikroliter ble gitt oralt til dyr (n = 6 til 9 per gruppe). Dyrene ble avlivet 11 dager senere, og magene ble fjernet og dissekert. H. pylori
til stede i gastrisk antrum homogenater ble kvantifisert ved seriell fortynning og utsåing på CBA inneholdende 5-fluorcytosin (5 ug /ml), vancomycin (10 ug /ml), amfotericin B (5 ug /ml), bacitracin ( 30 ug /ml), polymyksin B (10 U /ml), og trimetoprim (10 ug /ml) [44]. Duplikat CFU bestemmelser ble gjort for flere fortynninger av hver vevsprøve.
Helcelle-ELISA
Standardprosedyrer [6, 7, 45], ble tilpasset for anvendelse av peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Alle antistoffer ble oppnådd fra Calbiochem. Over natten-kulturer av bakterier ble oppsamlet ved sentrifugering ved 3500 x g
i 10-15 min, vasket i Dulbeccos fosfatbufret saltløsning, og pelletert ved 10000 x g
i 2 minutter, deretter resuspendert i 15% glycerol /0,9% NaCl. Cellesuspensjonene ble analysert for proteininnhold og lagret ved -20 ° C. Celleprøver inneholdende kjente mengder av protein ble hurtig fortynnet i 50 mM natriumhydrogenkarbonat /karbonat pH 9,55 og fordeles umiddelbart i brønner på en ELISA-plate (Costar΅7). Platene ble forseglet og nedkjølt over natten, deretter blokkert i 90 minutter i 3% bovint serumalbumin oppløst i vaskebuffer som besto av 0,1 M natriumfosfat, pH 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% w /v Tween-20. Primært antistoff, monoklonalt anti-Lewis-X (Signet klonen P12) eller anti-Lewis-Y (Signet klon F3), fortynnet 1: 500 i vaskebuffer /1% BSA, ble tilsatt i 2 timer, etterfulgt av fire endringer i vaskebuffer. Det sekundære antistoff, en 1: 2500 fortynning av pepperrotperoksydase-konjugert geite-anti-muse-IgM i vaskebuffer /1% BSA, ble tilsatt i 90 min, etterfulgt av fire endringer i vaskebuffer. Den kromogent substrat var 0,42 mM tetrametylbenzidin og 0,02% H 2o 2 i 50 mM acetat /citrat pH 5,5 [46]. Etter 15 minutter ved romtemperatur ble reaksjonen stanset med 1 /vol femte 2,5 N H 2SO 4, og fargeendring ble målt i en plateleser ved 450 nm. I negative kontroller utelate enten primær eller sekundær antistoff, eller med E. coli-stamme HB101
substituert for H. pylori
, fargeendring var neglisjerbar (A < 0,05). Nivåer av Lewis Y var neglisjerbar (A < 0,1) i stamme 26695 eller 43504, som var Lewis X-nivåer i SS1
Elektroforetisk analyse av lipopolysakkarider
H. pylori
kulturer ble oppsamlet som beskrevet ovenfor, og vasket. cellepelletene ble lagret ved -70 ° C. Celler ble lysert i 60 mM Tris-HCl pH 6,8 inneholdende 2% SDS ved 95-98 ° C i 10 min. Proteininnholdet ble målt ved anvendelse av bicinchoninic syreanalyse (Pierce). Prøver av cellelysater ble justert til like proteininnhold (1 mg /ml), deretter proteolyserte i reaksjoner inneholdende (endelige) 60 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,67% SDS, og 0,67 mg /ml proteinase K ved 60 ° C i 2 timer [47]. For å eliminere elektroforeartifakter på grunn av tilstedeværelse av lipid /vaskemiddel-komplekser, ble proteolyserte prøvene ekstrahert med varm fenol [48]. Kontroll eksperimenter bekreftet at alle LPS band ble gjenvunnet gjennom følgende utvinning prosedyre kvalitativt og uten bias. Proteolyserte prøver ble blandet med ett volum av 90% vandig fenol og inkubert ved 70 ° C i 20 min. Etter avkjøling til 10 ° C i 1 minutt, ble prøvene sentrifugert ved 12.000 x g
i 20 minutter ved 10 ° C, og den vandige fase oppsamlet. De fenoliske faser ble reekstrahert med 1 volumdel H 2o ved 70 ° C i 10 minutter, og sentrifugering gjentatt. De kombinerte vandige ekstraktene ble justert til 0,5 M NaCl og utfelt med 10 volum etanol i kjøleskap over natten og deretter sentrifugert ved 20 000 x g
i 20 minutter ved 10 ° C og lufttørket. Rensede LPS-prøver ble oppløst på nytt i Laemmli prøvebuffer [49] ved 95 ° C i 5 min. Prøvene ble påført på 15% polyakrylamid /0,9% bis Minigeler inneholdende 3,2 M urea med Laemmli diskontinuerlige bufferformulering [49], og en 5% stabling gel. Etter elektroforese ved 150 V i 75 minutter, ble gels enten løst over natten for sølvfarging [50] eller overføres til polyvinylidenedifluoride membran ved hjelp av Tris /glysin overføringsbuffer [51]. Blottene ble blokkert over natten i 3% bovint serumalbumin og 0,03% NaN 3 i vaskebufferen beskrevet ovenfor for ELISA. Primære antistoff (anti-Lewis-X eller anti-Lewis-Y, 1: 200) og sekundært antistoff (peroksydasekonjugert geit anti-mus IgM, 1: 1000) ble fortynnet i vaskebuffer inneholdende 0,5% BSA. Kolo deteksjon brukes 3,3'-diaminobenzidin med kobolt forbedring [52]. Densitometry ble utført med den offentlige sfæren søknad Bilde J, tilgjengelig på http:.... //RSB info nih gov /ij
Resultater
Lite er kjent om de fysiologiske rollene til kolesterol i H . pylori
. For å undersøke svarene av H. pylori
til kolesterol, vedtok vi en definert, serumfritt kulturmedium, F12 med 1 mg /ml albumin, som denne bakterien kan være stabilt passert [26]. Denne beskjedne konsentrasjonen av albumin øker vekst [25, 26] og lindrer stram tilslutning til kultur overflater som oppstår i proteinfrie medier [53]. I denne definerte medium, har tilsetning av 50 ug /ml kolesterol ikke vesentlig endre vekstrate (figur 2). Fraværet av veksteffekter ved de valgte dyrkningsforholdene var fordelaktig for undersøkelse av den fysiologiske betydningen av kolesterol i H. pylori
. Således, var vi i stand til å sammenligne gastrisk kolonisering av ørkenrotter av stammen SS1 som hadde blitt dyrket i definert medium inneholdende varierende mengder av kolesterol (figur 3). Elleve dager etter oral inokulering, ble H. pylori
i mage antrum selektivt belagt og kvantifisert. Påfallende, ørkenrottene kolonisert bare av kulturer dyrket i kolesterol-inneholdende medium, men ikke av H. pylori
dyrket i kolesterolfritt medium (I hvert eksperiment, P < 0,0001 for sammenligning av log (CFU /g) mellom grupper som bruker Student tosidige t-test). Derfor, kolesterol var en vesentlig komponent i vekstmediet for å etablere H. pylori-infeksjon
i denne dyremodell. Figur 2 Tilsetning av kolesterol til det definerte medium påvirker ikke H. pylori vekst. Parallelle kulturer av hver stamme ble dyrket over natten i F12 /albumin (1 mg /ml) i fravær (åpne søyler) eller nærvær (skraverte søyler) på 50 ug /ml kolesterol. Den opprinnelige befolkningstettheten var 2 x 106 /ml. Doblingstidene ble beregnet fra den målte økningen i biomasse. Viste verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av fem eller flere uavhengige målinger. n
. s
. Studentens tosidige t-test for parvise data viste ingen statistisk signifikans.
Figur 3 H. pylori dyrket uten kolesterol ikke klarer å kolonisere ørkenrotte. H. pylori stamme
SS1 ble dyrket over natten i definert medium inneholdende 0 eller 50 ug /ml kolesterol. Gerbils oralt inokulert med 3,5 × 108 CFU (eksperiment A) eller 1 x 108 CFU (eksperiment B). H. pylori
i mage antrum ble kvantifisert på 11 dager. Hver vertikal stolpe representerer gjennomsnittet av duplikate bestemmelser for ett dyr, og horisontale linjer gi medianen for hver behandlingsgruppe. Der ingen kolonier ble gjenvunnet, ble verdiene registrert som 5 × 102 CFU /g vev, estimert deteksjonsgrensen.
Visse stammer av H. pylori
utstilt signifikante forskjeller i tilslutning til kulturbeholdere følgende passasje i kolesterol, noe som tyder endringer i sine celleoverflateegenskaper (Hildebrandt & McGee, upubliserte observasjoner). Av denne grunn, bestemte vi oss for å undersøke lipopolysaccharides, som utgjør hoveddelen av cellen konvolutten, og tjener til å presentere de biologisk viktige Lewis antigener. Vi har anvendt en godt etablert helcelle-ELISA-fremgangsmåten for å kvantifisere de dominerende Lewis-antigener, Lewis-X og Y (figur 4). I henhold til litteraturen [54, 55], først og fremst Lewis X ble påvist i stamme 26695, bare Lewis Y ble påvist i SS1, og ble detektert signifikante nivåer av både G27. I hvert tilfelle, avlesninger var ikke-lineær med hensyn til prøve belastning, en hendelse som ikke er uvanlig i ELISA-analyser [56], og som er blitt notert av andre forskere som bruker de samme monoklonale antistoffer [7]. Derfor, for å sammenligne antigen-nivåer i prøver av H. pylori
dyrket i fravær eller nærvær av kolesterol, utførte vi parallelle titreringer over et område av prøvebelastninger varierende 20-500 ng av celleprotein per brønn. Disse titreringer viste reproduserbart en markert økning i mengden av Lewis-X og /eller Lewis Y antigen funnet på celleoverflaten når H. pylori
stammene 26695, SS1 eller G27 ble dyrket i nærvær av kolesterol (figur 4). I gjentatte uavhengige eksperimenter, var gjennomsnittlige kolesterol avhengig økning var statistisk signifikant (Tabell 2). Sammenlignbare resultater er også blitt oppnådd for Lewis X i stamme 43504 (data ikke vist). Spiking prøver med kolesterol ved slutten av vekstperioden endret ikke mengden av Lewis-antigenet påvist ved hjelp av ELISA (Figur 5A). I et annet kontrollforsøk bekreftet vi for alle fire av disse stammer at mengden av celleprotein bundet til brønnene var upåvirket ved vekst i kolesterol (figur 5B). ELISA resultatene således fastslått at øket overflate ekspresjon av Lewis-antigener var en legitim biologisk respons på kolesterol som forekom i alle de testede stammer. Denne reaksjon var spesifikk for kolesterol, fordi substitusjon av kolesterol i vekstmediet med de strukturelle analoger p-sitosterol eller natriumtaurocholat hadde ingen effekt på Lewis X- eller Y-ekspresjon ved hjelp av G27 (figur 4, høyre paneler, og tabell 3). Lewis-antigen respons på kolesterol forble etter avbrudd av genet for kolesterol α-glukosyltransferase (cgt
) i stammen G27 (tabell 2, og se nedenfor) og i 26695 (data ikke vist), utelukker deltakelse av α -glycoside metabolitter av cholesterol.Table 2 Forbedring av celleoverflaten Lewis antigen uttrykk ved veksten av kulturer i nærvær av cholesterol.a

gangers økning sammenlignet med parallell kolesterol-fri kultur

Lewis X
Lewis Y

gjennomsnitt ± SEM (n)
P-verdi
gjennomsnitt ± SEM (n)
P-verdi
26695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002 Book ikke gjort
SS1 ikke anbefale gjort
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004
G27 villtype
2,85 ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 CGT :: katt
3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 LPXe :: katt
2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± 0,43 (7) 0,014

en Lewis-antigener ble kvantifisert i replikat helcelle-ELISA-analyser av parede prøver dyrket i nærvær eller fravær av 50 pg /ml kolesterol. Antigenet belastningen var 300 ng cellulært protein per brønn. Forholdstall for pluss: minus kolesterol ble beregnet ut fra dupliserte netto avlesninger i hver analyse, og forholdstall fastsatt i fem til åtte uavhengige ELISA går var da i gjennomsnitt. P-verdier ble beregnet i to-tailed Student t-test for nullhypotesen at forholdet er lik 1.
Tabell 3 Forbedret celleoverflaten Lewis antigen uttrykk er kolesterol-spesifikk

gangers økning sammenlignet med parallell kolesterol-fri kultur

Lewis X
Lewis Y


gjennomsnitt ± SEM (n)
P-verdi
gjennomsnitt ± SEM (n)
P-verdi

kolesterol
2,96 ± 0,22 (5)
0,0008
2,48 ± 0,10 (4)
0,0007
β- sitosterol
1,80 ± 0,47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0,28
taurocholat
0,64 ± 0,16 (4)
0,12
0,84 ± 0,20 (3) 0,52

Lewis-antigener ble kvantifisert i replikat helcelle-ELISA-analyser av parvise kulturer av H. pylori
G27 dyrket i nærvær eller fravær av 130 pM kolesterol, eller en lik konsentrasjon av β-sitosterol eller natriumtaurocholat. Antigenet belastningen var 300 ng cellulært protein per brønn. Forholdstall for pluss: minus kolesterol ble beregnet ut fra dupliserte netto avlesninger i hver analyse, og forholdstall fastsatt i tre til fem uavhengige ELISA går var da i gjennomsnitt. P-verdier ble beregnet i to-tailed Student t-test for nullhypotesen at forholdet er lik 1.
Figur 4 Vekst i kolesterol spesielt forbedrer celleoverflaten visning av Lewis antigener. Hele celle ELISA-analyser ble utført på prøver av H. pylori
belastning 26695 (øverst til venstre), SS1 (nederst til venstre), eller G27 (øvre og nedre høyre). Parallelle kulturer ble dyrket over natten i definert medium inneholdende 130 pM av de følgende tilsetninger: sirkler, ingen tilsetning; torg, kolesterol; trekanter, β-sitosterol; X, taurocholat. Varierende mengder av cellesuspensjon som svarer til kjente mengder av cellulært protein, ble anvendt for å duplisere brønner i ELISA-plater, og immunoassayed for nærvær av Lewis X, eller Lewis Y antigenet som beskrevet i Methods
. Negative kontrollprøver av E. coli
HB101, eller buffer-bare blanks, falt på den stiplede linjen. Avlesninger for de enkelte brønner er plottet. Gjentatte forsøk med tre eller flere uavhengig av hverandre dyrket kulturer har gitt det vesentlige identiske resultater.
Figur 5 ELISA-kontrollforsøk. A. Spike med kolesterol ved slutten av vekstperioden forandrer ikke Lewis-antigen ekspresjon. Kulturer av H. pylori
ble dyrket over natten i definert medium uten (kontroll) eller med 50 ug /ml kolesterol (kolesterol dyrket). En tredje kolbe (kolesterol tilsatt) ble dyrket i fravær av kolesterol, avkjølt på is, og en ekvivalent mengde av kolesterol ble tilsatt før cellene ble høstet. Lewis antigener ble kvantifisert i to eksemplarer av hel-celle ELISA, lasting 300 ng cellulært protein per brønn. Forholdstall for pluss: minus kolesterol ble beregnet ut fra gjennomsnittlig netto avlesninger i hver analyse, og plottet viser at forholdene ± sem for 3-5 uavhengige ELISA går. P-verdier ble beregnet i to-tailed Student t-test for nullhypotesen at forholdet er lik 1. For sammenligninger merket ns, P > 0,05. B. Tilsvarende binding av celler til ELISA-plater. Prøver av H. pylori
som ble dyrket i parallelle kulturer i fravær (hvite stolper) eller i nærvær av 50 ug /ml kolesterol (grå søyler) ble påført på multibrønnplater på samme måte som for Lewis-antigen ELISA-analyser, og legger 500 ng av cellulært protein per brønn. Etter over natten feste, ble brønnene vasket to ganger med Dulbeccos fosfatbufret saltløsning, deretter protein i adherente celler ble kvantifisert ved hjelp av BCA-reagens. Middelverdier ± SD fra kvadruplikat-brønner er vist.
Påvisning av Lewis X og Y ved immunoblotting med de samme monoklonale antistoffer fremstilt et annet resultat (figur 6). I flere forsøk ved hjelp av denne teknikken, gjorde vi ikke oppdage eventuelle kolesterol avhengige forskjeller i Lewis X eller Y nivåer, bortsett fra en liten økning i Lewis X i 43504 som var bare marginalt signifikant. Den blotting-prosedyre anvendt LPS-prøver ekstrahert fra cellelysatene, og i prinsippet bør detektere hele celle Lewis-antigen basseng, mens den helcelle-ELISA-metode er utviklet for å detektere bare som presenteres på den ekstracellulære overflaten. Den interessant forskjell i resultater mellom vår ELISA-analyser og immunoblot tyder på en endring i celle romoppdelingen av Lewis-antigenet, avhengig av tilgjengeligheten av kolesterol i vekstmediet. Figur 6 Lewis X og Y antigen profilering ved immunblotting. Prøver av LPS isolert fra parallelle kulturer dyrket i fravær (-) eller nærvær (+) av 50 ug /ml kolesterol ble løst i 15% urea-geler. Mengder lastet per bane, som ug innledende lysat protein, er gitt på toppen av hver bane. Etter overføring ble antigener immunpåvist med monoklonale antistoffer som er spesifikke for Lewis-X (øvre panel) eller Lewis Y (lavere panel). Et representativt eksempel på hver enkelt er vist. Side baner inneholde prestained proteinmarkører (M) eller 400 ng av E. coli
O111: B4 LPS. Antigen signal dukket opp bare i O-kjeden regioner i disse H. pylori
stammer; tomme områder har blitt beskjært ut deretter. De immunoblotter ble uavhengig replikert med flere prøvesett, og densitometry ble brukt for å kvantifisere antigen signal i hvert kjørefelt. Forholdstall for parvis pluss minus: kolesterol prøver ble beregnet, og det gjennomsnittlige forhold mellom ± SEM for (n) blotter er gitt i blått. Null-hypotesen at forholdet er lik 1 ble evaluert i en to-halet Student t-test.
I tillegg til Lewis-antigen måling, vi direkte sammenlignet lipopolysakkarid profiler mellom parallelle kulturer dyrket i nærvær eller fravær av kolesterol, ved hjelp av gel elektroforese og sølvfarging. I alle de H. pylori
stammer vi har undersøkt, LPS båndprofiler var identiske mellom kulturer dyrket i definert medium med kolesterol til det som oppnås i serumholdig medium eller på blodagar (data ikke vist), og som forventet [5 , 24, 55, 57] disse profilene var meget strekk-spesifikke. På disse geler, kolesterol-responsive LPS-bånd ble tydeligst løst for stammen G27, et klinisk isolat (figurene 7, 8).

• Nytten av cytokeratins 7 og 20 (CK7 /20) immunhistokjemi i æren av short-segmentet Barrett spiserøret fra mage intestinal metaplasi: Er det pålitelig
• Tilsetningen av et pH-følsomt gel forbedrer mikroemulsjon stabilitet for målrettet fjerning av colonic ammonia