Хеликобактерной модификация липополисахарида, экспрессия антигена Льюиса, и желудочный колонизация являются холестерин-зависимых

Хеликобактер пилори
липополисахарида модификация, экспрессия антигена Льюиса, и желудочный колонизация являются холестерин-зависимых
Аннотация
Справочная информация
хеликобактер пилори
специально берет холестерин и включает его в бактериальную мембрану, но мало в настоящее время известно о физиологической роли холестерина в. Мы сравнили фенотипы и в естественных условиях
колонизация способности антихеликобактерной
выращенных в определенной, не содержащей сыворотки среде роста, F12 с 1 мг /мл альбумина, содержащий от 0 до 50 мкг /мл холестерина.
Результаты <бр> удвоив времена были в значительной степени не зависит от холестерина, наблюдались другие явные фенотипические изменения. штамм H. Pylori
SS1 выращенных в определенной среде с холестерином успешно колонизировали желудок песчанок, тогда как SS1 выращены без холестерина не удалось колонизировать. H. пилори
липополисахарида часто показывает Льюиса X и /или Y антигены. Экспрессия этих антигенов, измеренных с помощью целых клеток ELISA был заметно усиливается в ответ на рост штамма SS1, 26695, или G27 холестерина. Кроме того, электрофоретический анализ липополисахарида в дикого типа G27 и у мутантов, лишенных O-цепи выявлены структурные изменения в пределах фрагментов ядра олигосахарид /липид А. Эти ответы на уровни антигена Льюиса и в липополисахаридными профилей к наличию холестерина были весьма специфичны, так как никаких изменений не произошло, когда уровень холестерина был заменен бета-ситостерин или солей желчных кислот. Срыв генов, кодирующих альфа-холестерина глюкозилтрансфераза или липида A фосфоэтаноламин трансферазы не оказывал влияния на экспрессию Льюиса, ни на профилях липополисахаридными, ни на холестерин отзывчивость этих свойств. Нарушение липидного гена A 1-фосфатазы устранено влияние холестерина на профилях липополисахаридными, но не его влияние на экспрессию Льюиса.
Выводы
Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что истощение холестерина приводит к аномальным формам LPS, которые зависят от дефосфорилирование липида А в 1-м положении. Предварительная модель для наблюдаемых эффектов холестерина обсуждается, в котором последовательные шаги липополисахарида биогенезом и, независимо друг от друга, презентации антигена Льюиса на поверхности клеток, зависит от состава мембраны. Эти новые данные показывают, что наличие холестерина позволяет H. Pylori
изменить свою клеточную оболочку таким образом, что может повлиять на колонизацию ткани хозяина в естественных условиях
.
Фон
хеликобактерной
является весьма нишевым -adapted патогенный микроорганизм, который обитает в желудке человека, не передается в первую очередь в семьях, и не известно, экологический резервуар. Хронические инфекции могут быть бессимптомными или вызывать гастрит, язва или рак желудка. Для того, чтобы установить инфекции, бактерия должна выдержать транзит через кислую отделение желудочного [1]. Он проникает и устанавливает место жительства в защитном слизистого слоя использовали липид и холестерина богатой среде [2, 3]. В этой нише бактерия использует различные механизмы для уклонения от иммунного ответа хозяина.
Липополисахаридов (LPS) на поверхности H. Pylori
модифицируются, чтобы отобразить определенные антигены группы крови человека, в первую очередь Льюиса антигены Х и Y [ ,,,0],4-7], и реже Н тип 1, я-антиген, группа крови а или Льюиса антигены а или В [8-10]. Эти поверхностные антигены LPS необходимы для установления инфекции, так как мутантные штаммы, дефектные для синтеза LPS O-антигена или для экспрессии Льюиса X /Y не колонизировать мышей [11-13]. Существует доказательство того, что антигены Льюиса экспрессируется на поверхности бактерии способствуют адгезии H. Pylori
к эпителиальных клеток желудка [10, 14], а также играть роль в тканевой тропизм [15-17]. Желудочный эпителиальные клетки также экспрессируют антигены Льюиса [18, 19], что свидетельствует о том, что дисплей Льюиса антигенов на поверхности бактерии, могут служить в качестве стратегии мимикрии. Исследования клинических изолятов [18, 20] и экспериментальных инфекций у животных [21] поддерживают эту роль бактериальных антигенов Льюиса в иммунной уклонения. В человеческой инфекции H. Pylori
антигены Льюиса были связаны с тяжестью язвенной болезни и дуоденит [16, 22]. Еще одной важной особенностью H. Pylori
LPS является его модифицированная структура липида А, с пониженной ацилирования и меньшим количеством заряженных групп, чем это характерно для энтеробактерий [23]. Эти модификации липида А минимизировать эндотоксина и противовоспалительными свойствами антихеликобактерной
LPS (обзор в [24]).
Холестерин является несущественным питательной средой для H пилори
, хотя она способствует росту в бессывороточной среде [ ,,,0],25, 26]. H. пилори
специфически включают холестерин в бактериальной мембраны [27], как и ограниченное число патогенных и синантропных бактерий, включая Proteus Mirabilis, Lactobacillus ацидофильных
, Borrelia зр
., И Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Холестерин может усилить мембраны в этих организмов [30-32]. H. Pylori также изображения однозначно образуют холестерина альфа-гликозид [33, 34], и этот метаболит может быть дополнительно модифицирован путем ацилирования или phosphatidylation [34]. Альфа-глюкозилированных холестерина извращает иммунный ответ на бактерии в мышиной модели, путем подавления фагоцитоза и активации Т-клеток [35]. Другие роли для холестерина и холестерина метаболитов в бактериальной мембране еще предстоит исследовать. В этом отчете мы показали, что биосинтез липополисахарида, включая экспрессию антигена Льюиса и ядро ​​LPS /модификации липида А, изменяются при наличии холестерина в питательной среде. Мы представляем данные, свидетельствующие о том, что эти изменения в клеточной оболочки может существенно влиять на взаимодействие патоген /хозяина в животной модели инфекции.
Методы
Бактериальные штаммы и условия роста
штаммами H пилори
включали лабораторный штамм ATCC43504 (происхождение: Австралия), 26695 (Великобритания), клинический изолят G27 (Италия [36], при условии, Н. Салама), а мышь адаптированный штамм SS1 (Австралия, при условии, Адриан Ли [37]). Бактерии поддерживали при 37 ° С в микроаэробной атмосфере 5% O <суб> 2/10% СО <к югу> 2 на агаре Кампилобактер крови (КБА). Бактерии пассировать каждые 2 до 3 дней, и не более чем на 25 дней, чтобы свести к минимуму генетический дрейф. Для роста в химически определенной среде [26], бактерии были привиты из СВА в тканевых культуральных колбах, содержащих F12 Хэма (Gibco) с 1 мг /мл бычьего сывороточного альбумина (не содержащего жирных кислот, Sigma A7906), упоминаемый в качестве определенной среде. Жидкие культуры пересевали ежедневно разбавление в свежей среде при начальных плотностях 1-2 × 10 6 /мл, и использовали при прохождении от 3 до 5. клеточного холестерина сорта культуры (&GТ; 99%, Sigma) добавляли к F12 как стабильный 10 × эмульсии, содержащей 500 мкг /мл холестерина, диспергированные в 10 мг /мл альбумина, который был подготовлен в соответствии с [38]. Следующие дополнения средств массовой информации были проведены подобным образом: бета-ситостерин (синтетический, 95%), таурохолат натрия, гликохолат натрия, бета-эстрадиол, прогестерон (все от Sigma), дегидроэпиандростерон (Calbiochem), и бета-coprostanol (Matreya) . раз
Удвоение были определены в процессе роста фазы журнала путем количественного определения жизнеспособных клеток с помощью клеточного титра Glo реагента (Promega), как подтвержденный и описанный [39]. Измерение биомассы в качестве КОЕ, в качестве клеточного белка, или как АТФ все получены стабильные результаты. Значение 1 attomol АТФ на ячейку [40] предполагалось, для обычного прохода. Возможная неточность этого значения не существенно влияет на интерпретацию данных.
Изогенная срывов генов были достигнуты путем вставки Campylobacter палочки
устойчивости к хлорамфениколу элемент (кат
) в соответствии со стратегией, описанной Чалкер и др <бр> [41]. Праймеры были тщательно разработаны таким образом, чтобы целевой последовательности в пределах открытых рамок считывания, и перечислены в реакциях Таблица 1. Сплав ПЦР с использованием системы ПЦР-удлинитель (5Prime) содержит 2,3 нмоль каждый гель-очищенными шаблон, 50 мкМ праймера, 1 × буфер настройки, 1,25 мМ Mg дополнительный ++, 0,2 мМ каждого дНТФ и 0,01 ед /мкл полимеразы. условия Fusion циклов были следующие: 94 ° C 2,5 мин, 10 циклов [94 ° C 15 сек, 45 ° C 60 сек, 68 ° C 60 сек на кб], 25 циклов [94 ° C 15 сек, праймер конкретных Tm 30 сек, 68 ° C 60 сек на кб], последнее продление 68 ° C 6-8 мин. Гибридные продукты были повторно амплифицировали с Pfx50 (Invitrogen), чтобы увеличить количество, а затем очищали с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick (Qiagen). Штаммы-реципиенты выращены 1 день на CBA трансформировали 500 нг конечного ампликона с использованием естественной трансформации [42, 43] с последующей селекцией на 7-10 дней на CBA, содержащих 15 мкг /мл хлорамфеникола. Для обеспечения аллельного замены, полученные в результате штаммы были оценены с помощью ПЦР из геномной ДНК с использованием GoTaq (Promega) с использованием праймеров, указанных в таблице 1. Стратегия ПЦР и результаты показаны на рисунке 1 1.Table последовательности праймера.
<СОР> праймеры для разрушения аллельного
в

CAT FWD [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT Rev [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd <бр> atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE FWD
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt <бр> eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
дополнительные праймеры для подтверждения разрушения гена
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective числа генов в общедоступных базах данных для 26695 и G27 являются следующие: [ВКТ: hp0421, G27_952
], [
PMI (rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [ЕАПЦ:. hp0022, G27_21
]
столбце BrightHand перечислены краткие обозначения праймер, используемый на рисунке 1. Рисунок 1
ПЦР проверка аллельных нарушений в H. Pylori штамма G27. Геномную ДНК получали из гена с разрушенным G27 штаммов следующих трех проходов под селекции хлорамфениколу, затем амплифицировали с помощью ПЦР, как показано на каждой схеме. Грунтовки последовательности приведены в таблице 1. A. Срыв ВКТ. Пять примеров показаны из семи индивидуальных клонов, каждый из которых давали одинаковые результаты в экране. B. Срыв ИМС (rfbM). Весь хлорамфеникол-резистентный население пассировать в каждом раунде отбора, без клональной селекции. С. Разрушение lpxE и ЕАПЦ. Весь хлорамфеникол-резистентный население пассировать в каждом раунде отбора, без клональной селекции.
Желудочный колонизацию
Эксперименты на животных были одобрены уходу и использованию животных комитета LSUHSCS Institutional путем. Женский монгольских песчанок были сохранены на обычной диете вволю
. Чтобы сохранить моторику, Н. Pylori
штамм SS1 культивировали в течение ночи в условиях микроаэробных в Т75 колбы, содержащие 40 миллилитров среды F12 с 0,4 мг /мл альбумина, и 0 или 50 мкг /мл холестерина. Эти подвижные планктонные бактерии собирали центрифугированием и ресуспендировали в изотоническом солевом растворе. Колониеобразующих единиц (КОЕ) были измерены в этих инокулятов последовательным разбавлением и высева на КБА, и эти измерения подтвердили, равной дозы, жизнеспособных бактерий между этими двумя условиями роста. Приблизительно 10 8 КОЕ на 30 мкл были даны в устной форме животных (п = 6 до 9 в каждой группе). Животные были умерщвлены через 11 дней, и желудки были удалены, и расчленены. H. Pylori
присутствует в желудочном антральном гомогенатах количественно оценивали путем последовательного разведения и высева на CBA, содержащего 5-фторцитозина (5 мкг /мл), ванкомицин (10 мкг /мл), амфотерицин В (5 мкг /мл), бацитрацин ( 30 мкг /мл), полимиксин В (10 ед /мл), и триметоприм (10 мкг /мл) [44]. Дубликат CFU определения выполняли для нескольких разведений каждого образца ткани.
Поклеточного ИФА
Результаты стандартных процедур [6, 7, 45], были адаптированы для использования конъюгированного с пероксидазой вторичных антител. Все антитела были получены из Calbiochem. Ночные культуры бактерий собирали центрифугированием при 3500 • g
в течение 10-15 мин, промывали в фосфатно-солевом буфере Дульбекко, и осаждают при 10000 × г
в течение 2 мин, а затем повторно суспендируют в 15% глицерина /0,9% NaCl. Суспензии клеток анализировали на содержание белка и хранили при -20 ° С. Образцы клеток, содержащие известные количества белка быстро разбавляют в 50 мМ бикарбоната натрия /карбоната рН 9,55 и распределяли непосредственно в лунки планшет для ELISA (Costar΅7). Планшеты герметизировали и охлаждают в течение ночи, затем блокировали в течение 90 мин в 3% бычьего сывороточного альбумина, растворенного в промывочном буфере, который состоял из 0,1 М натрий-фосфатного рН 7,4 /0,1 М NaCl /0,1% вес /об Твина-20. Первичные антитела, моноклональные анти-Льюис Х (Печатка клон Р12) или анти-Lewis Y (Печатка клон F3), разведенной 1: 500 в буфере для промывки /1% BSA, добавляли в течение 2-х часов, затем четыре смены буфера для промывки. Вторичное антитело, 1: 2500 разбавление конъюгированного с пероксидазой хрена козьего антитела против мышиного IgM в буфере для промывки /1% BSA, добавляли в течение 90 мин, затем четыре смены буфера для промывки. Хромогенный субстрат был 0,42 мМ тетраметилбензидином и 0,02% Н <югу> 2О <суб> 2 в 50 мМ ацетат /цитрат рН 5,5 [46]. Через 15 минут при комнатной температуре, реакцию останавливали с 1/5 т 2,5 Н Н <к югу> 2sO <суб> 4, и изменение цвета измеряли в планшет-ридере при 450 нм. В отрицательном контроле, минуя первичный или вторичный антитела, или E.coli,
штамма HB101 заменяющей H. Pylori
, изменение цвета было незначительным (A &л; 0,05). Уровни Lewis Y были незначительными (А &л; 0,1) в штамме 26695 или 43504, как и уровни Льюис X в SS1
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ анализ липополисахаридов
антихеликобактерную собирали
культур, как описано выше, и промывают. клеточные гранулы хранили при -70 ° С. Клетки лизируют в 60 мМ Трис-HCl, рН 6,8, содержащем 2% SDS при 95-98 ° С в течение 10 мин. Содержание белка измеряли с помощью анализа с применением бицинхониновой кислоты (Pierce). Образцы клеточных лизатов были отрегулированы на равное содержание белка (1 мг /мл), а затем proteolyzed в реакциях, содержащих (конечный) 60 мМ Трис-HCl рН 6,8, 0,67% SDS, и 0,67 мг /мл протеиназы К при 60 ° С в течение 2-х часов [47]. Для устранения электрофоретических артефактов из-за присутствия липид /детергентных комплексов, proteolyzed образцы экстрагировали с горячим фенолом [48]. Контрольные эксперименты подтвердили, что все LPS полосы были извлечены с помощью следующей процедуры экстракции качественно и без предвзятости. Proteolyzed Образцы смешивали с 1 объемом 90% -ного водного раствора фенола и инкубировали при 70 ° С в течение 20 мин. После охлаждения до 10 ° С в течение 1 мин, образцы центрифугировали при 12000 • g
в течение 20 мин при 10 ° С, и водную фазу собирали. Фазы фенольные были повторно экстрагируют 1 объемом H <суб> 2O при 70 ° С в течение 10 мин, и повторное центрифугирование. Объединенные водные экстракты доводили до 0,5 М NaCl и осаждают с помощью 10 об этаноле в холодильнике в течение ночи, а затем центрифугировали при 20000 • g
в течение 20 мин при 10 ° С и сушили на воздухе. Очищенные LPS образцы повторно растворяли в буфере Лэммли образца [49] при 95 ° С в течение 5 мин. Образцы наносили на 15% полиакриламид /0,9% бис minigels, содержащего 3,2 М мочевину с дисперсной композиции буфера Лэммли [49], и концентрирующий гель 5%. После электрофореза при 150 В в течение 75 мин, гели либо фиксировали в течение ночи для окрашивания серебром [50] или переданы polyvinylidenedifluoride мембрану с использованием буфера передачи Трис /глицина [51]. Пятна блокировали в течение ночи в 3% бычьего сывороточного альбумина и 0,03% NaN <суб> 3 в промывочном буфере, описанном выше для ELISA. Первичные антитела (анти-Льюис Х или анти-Lewis Y, 1: 200) и вторичное антитело (конъюгированного с пероксидазой козьего анти-мышиных IgM, 1: 1000), разводили в промывочном буфере, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Колориметрические обнаружения используется 3,3'-диаминобензидина с усилением кобальта [52]. Денситометрия осуществлялось с помощью публичного домена приложения Image J, доступна по адресу:.... //RSB Информация о NIH гов /И.Я.
Результаты
мало известно о физиологической роли холестерина в H . пилори
. Для исследования ответов антихеликобактерной
холестерину, мы приняли определенную бессывороточной культуральной среде F12 с 1 мг /мл альбумина, в которых эта бактерия может быть стабильно пассированного [26]. Эта скромная концентрация альбумина повышает рост [25, 26] и облегчает плотное присоединение к культуре поверхностей, что происходит в безбелковых средах [53]. В этой определенной среде, добавление 50 мкг холестерина /мл существенно не изменяет скорость роста (Рисунок 2). Отсутствие эффектов роста при выбранных условиях культивирования было выгодно для исследования физиологического значения холестерина в H. Pylori
. Таким образом, мы имели возможность сравнить желудка колонизацию песчанок штаммом SS1, которые культивировали в определенной среде, содержащей различные количества холестерина (Рисунок 3). Через одиннадцать дней после перорального прививки, H. Pylori
в желудочном антральном были выборочно гальванически и количественному. Поразительно, песчанок колонизирована только культур, выращенных в содержащих холестерин среде, но не хеликобактерной
выращенных в холестерине среде без (В каждом эксперименте Р &л; 0,0001 для сравнения лога (КОЕ /г) между группами с использованием Student Стьюдента-тест). Таким образом, холестерин является важным компонентом среды для роста с целью установления антихеликобактерную
инфекции в этой модели на животных. Рисунок 2 Добавление холестерина к определенной среде, не влияет на скорость роста H. Pylori. Параллельные культуры каждого штамма выращивали в течение ночи в /F12 альбумина (1 мг /мл) в отсутствие (открытые бары) или в присутствии (закрашенным полосам) 50 мкг /мл холестерина. Начальная плотность населения составляла 2 × 106 /мл. Удвоение раз рассчитывали из измеренного увеличения биомассы. Значения, указанные представляют собой среднее ± стандартное отклонение пяти или более независимых измерений. п
. s
. Стьюдента-тест Стьюдента для парных данных не показал статистической значимости. Рисунок 3
H. Pylori выращены без холестерина не колонизируют песчанок. H. Pylori
штамм SS1 выращивали в течение ночи в определенной среде, содержащей 0 или 50 мкг /мл холестерина. Песчанки перорально засевают 3,5 × 108 КОЕ (эксперимент А) или 1 × 108 КОЕ (эксперимент В). H. пилори
в желудочном антральном были количественному в течение 11 дней. Каждая вертикальная полоска представляет собой среднее двух определений для одного животного, а горизонтальные линии придают медиану для каждой группы лечения. Там, где колонии не были восстановлены, значения были записаны как 5 × 102 КОЕ /г ткани, оцененного предела обнаружения.
Некоторых штаммов H. Pylori
выставлены значительные различия в приверженности к культуре сосудов следующий пассаж холестерина, предполагая изменения в их клеточной поверхности свойств (Хильдебрандтом &Amp; McGee, неопубликованные наблюдения). По этой причине мы решили исследовать липополисахариды, которые составляют основной компонент клеточной оболочки, и служат для представления биологически важные антигены Льюиса. Мы использовали хорошо организованной цельноклеточная процедуры ELISA для количественного определения преобладающих антигены Льюиса, Льюис Х и У (рисунок 4). В соответствии с литературными данными [54, 55], в первую очередь Льюис Х был обнаружен в штамме 26695, только Lewis Y был обнаружен в SS1, и значительные уровни обоих были обнаружены в G27. В каждом случае показания оптической плотности были нелинейной по отношению к образцу нагрузки, такое событие, которое не является необычным в ИФА [56], и что было отмечено другими исследователями с использованием этих же моноклональных антител [7]. Таким образом, для того, чтобы сравнить уровни антиген в образцах антихеликобактерной
культивируют в отсутствие или в присутствии холестерина, мы проводили параллельные титрование в диапазоне выборочных нагрузок, изменяющихся от 20 до 500 нг белка клеток на лунку. Эти титрование воспроизводимо показали заметное увеличение количества Льюиса X и /или Y Льюиса антигену, обнаруженному на поверхности клетки, когда Н. Pylori
штаммы 26695, SS1 или G27, культивировали в присутствии холестерина (Рисунок 4). В повторных независимых экспериментах, средние холестерина зависящих от увеличения были статистически значимыми (Таблица 2). Сравнимые результаты были получены также для Льюиса X в штамме 43504 (данные не показаны). Подкрепление образцы с холестерином в конце периода роста не изменила количество антигена Льюиса, обнаруженную ELISA (фиг.5А). В другом контрольном эксперименте мы проверили для всех четырех из этих штаммов, что количество клеточного белка связан с лунках не зависит от роста холестерина (Фиг.5В). ИФА результатов, полученных таким было установлено, что увеличение экспрессии поверхностных антигенов Льюиса является законным биологическим ответом на уровень холестерина, что происходило во всех исследованных штаммов. Этот ответ был специфическим для холестерина, так как замещение холестерина в питательной среде со структурными аналогами бета-ситостерол или натрия таурохолата не имели никакого влияния на Льюиса X или Y выражение с помощью G27 (рисунок 4, правая панели, и таблица 3). Реакция антиген Льюиса холестерина до сих пор остается после разрушения гена альфа-холестерина глюкозилтрансферазы (ВКТ
) в штамм G27 (таблица 2, и смотри ниже) и в 26695 (данные не показаны), что исключает участие α -glycoside метаболиты cholesterol.Table 2 Повышение экспрессии антигена Льюиса клеточной поверхности за счет роста культур в присутствии cholesterol.a
<й> <бр> кратное увеличение по сравнению с параллельным без холестерина культуры


<й>
Льюис X

Lewis Y

<й>
среднее ± SEM (п)

P значение


среднее значение ± SEM (п)

P значение


26695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002

не сделано
SS1
не сделали
1,88 ± 0,08 (5)
0,0004

G27 дикого типа
2.85 ± 0,42 (8)
0,0033

2,22 ± 0,24 (8)
0,0016

G27 ВКТ :: кошка

3,69 ± 0,34 (5) <бр> 0,0013

2,88 ± 0,30 (5)
0,0034

G27 lpxE :: кошка

2,59 ± 0,50 (6)
0.025
<бр> 2,47 ± 0,43 (7)
0,014

а антигены Льюиса количественному воспроизводимо цельного клеточного ELISA-анализов спаренных образцов, выращенных в присутствии или в отсутствие 50 мкг /мл холестерина. Нагрузка антигена 300 нг клеточный белок на лунку. Коэффициенты для плюс: минус холестерина были рассчитаны из дублированных чистых значений оптической плотности в каждом анализе, и соотношения, определенные в пяти до восьми независимых опытов ELISA были усреднены. Значения Р были вычислены в двух хвостами Стьюдента-тесты для нулевой гипотезы о том, что отношение равно экспрессии антигена Льюиса 1.
Таблица 3 Enhanced клеточной поверхности представляет собой холестерин специфичные
<й>
кратное увеличение по сравнению с параллельным без холестерина культуры


<й>
Льюис X

Lewis Y
<бр> <й>
среднее значение ± SEM (п) завод
P значение


среднее значение ± SEM (п)

P значение


холестерина
2,96 ± 0,22 (5)
.0008

2,48 ± 0,10 (4)
.0007

β- ситостерин
1,80 ± 0,47 (4)
0,19

1,19 ± 0,13 (3)
0,28

таурохолат
0,64 ± 0,16 (4)
0.12

0,84 ± 0,20 (3)
0,52

антигены Льюиса количественному воспроизводимо цельноклеточной ELISA анализ попарных культур антихеликобактерной
G27, выращенных в присутствии или в отсутствие 130 мкМ холестерина, или равной концентрации бета-ситостерин или таурохолата натрия. Нагрузка антигена 300 нг клеточный белок на лунку. Коэффициенты для плюс: минус холестерина были рассчитаны из дублированных чистых значений оптической плотности в каждом анализе, и соотношения, определенные в течение трех-пяти независимых опытов ELISA были усреднены. Значения Р были вычислены в двух хвостатых Стьюдента-тесты для нулевой гипотезы о том, что отношение равно 1.
Рисунок 4 Рост холестерина специально повышает клеточной поверхности дисплея антигенов Льюиса. Цельноклеточные ELISA анализы были проведены на образцах H. штамма пилори
26695 (вверху слева), SS1 (внизу слева), или G27 (верхний и правый нижний угол). Параллельные культуры выращивали в течение ночи в определенной среде, содержащей 130 мкМ следующих дополнений: круги, без добавок; квадраты, холестерин; треугольники, β-ситостерин; X, таурохолат. Различные количества клеточной суспензии, соответствующие известным количеством клеточного белка, наносили на продублировать лунки ELISA пластин, и immunoassayed на присутствие Льюиса X или Lewis Y антигена, как описано в Methods
. Отрицательные контрольные образцы кишечной палочки
HB101 или буфер только для заготовок, упал на пунктирной линии. Показания абсорбцию для отдельных скважин построены. Повторные эксперименты с тремя или более независимо выращенных культур, дали по существу одинаковые результаты. На рисунке 5
контрольных экспериментов ELISA. А. Подкрепление холестерина в конце периода роста не изменяет экспрессии антигена Льюиса. Культуры антихеликобактерной
выращивали в течение ночи в определенной среде без (контроль), либо с 50 мкг /мл холестерина (липопротеинов выращены). Третья колба (холестерин шипами) выращивали в отсутствие холестерина, охлаждали на льду, и эквивалентное количество холестерина был добавлен до клетки собирали. антигены Льюиса количественному в двух экземплярах, по цельноклеточная ELISA, загрузка 300 нг клеточного белка на лунку. Коэффициенты для плюс: минус холестерина рассчитывали из средних чистых значений оптической плотности в каждом анализе, а сюжет показывает означают коэффициенты ± РЭМ в течение трех-пяти независимых работает ELISA. Значения Р были вычислены в двух хвостатых Стьюдента-тесты для нулевой гипотезы о том, что коэффициент равен 1. для сравнения меченые нс, P > .05. B. связывание клеток ELISA пластин Эквивалент. Образцы антихеликобактерной
, которые были выращены в параллельных культурах в отсутствие (белые столбики) или в присутствии 50 мкг /мл холестерина (серые полосы) наносили на луночные планшеты таким же образом, как и для анализов Льюиса антиген ELISA, добавляя 500 нг клеточного белка на лунку. После ночного прикрепления лунки дважды промывали фосфатно-буферным солевым раствором Дульбекко, а затем белок в адгезивных клеток количественно определяли с использованием реагента ВСА. Средние значения ± стандартное отклонение от учетверять скважин показаны.
Обнаружение Льюиса X и Y с помощью иммуноблоттинга с теми же моноклональных антител, продуцируемых другой результат (рисунок 6). В нескольких попыток, используя эту технику, мы не обнаружили каких-либо холестерина зависящие от различий в уровнях Льюиса х или у, за исключением небольшого увеличения Льюиса X в 43504, который был лишь незначительно значительным. Процедура блоттинга использовали образцы LPS выделенные из лизатов клеток, и, в принципе, должен обнаружить весь клеточный антиген Льюиса бассейн, в то время как поклеточного метод ELISA предназначен для обнаружения только что представленный на внеклеточном поверхности. Интересное различие в результатах между нашими ИФА анализов и иммуноблоты предполагает изменение клеточного компартментации антигена Льюиса в зависимости от наличия холестерина в среде роста. Рисунок 6 Льюис X и Y антиген профилирование с помощью иммуноблоттинга. Образцы LPS выделенные из параллельных культур, выращенных в отсутствии (-) или в присутствии (+) 50 мкг /мл холестерина разделяли на 15% гел мочевины. Количества загруженных на полосу, в мкг исходного белка лизата, приведены в верхней части каждой полосы. После переноса антигены иммунодетектировали с использованием моноклональных антител, специфичных для Льюиса X (верхняя панель) или Lewis Y (нижняя панель). Характерным примером каждого показан. Боковые полосы содержат предварительно окрашенные белковые маркеры (М) или 400 нг кишечной палочки
O111: B4 ЛПС. Антигенной сигнал появлялся только в O-цепи областей штаммов этих H. Pylori
; пустые участки были обрезанными соответствующим образом. Иммуноблотах были независимо друг от друга реплицируются с несколькими наборами образцов, и денситометрии был использован для количественного определения антигена сигнала в каждой полосе. Коэффициенты для попарно плюс: минус образцов холестерина были рассчитаны, и средние коэффициенты ± СКО для (п) клякс приведены в синий цвет. Нулевая гипотеза о том, что соотношение равно 1 оценивали в двухвостый Стьюдента.
В дополнение к измерению антигена Льюиса, мы непосредственно сравнили профили липополисахарида между параллельными культур, выращенных в присутствии или в отсутствие холестерина, с использованием геля электрофорез и окрашивания серебром. Во всех антихеликобактерную
штаммов рассмотренных нами, профили полосы LPS были идентичны между культурами, выращенных в определенной среде с холестерином, который получают в среде, содержащей сыворотку, или на кровяном агаре (данные не показаны), и, как и ожидалось [5 , 24, 55, 57] эти профили были весьма штаммоспецифической. На этих гелей, холестерин реагирующих LPS полосы были наиболее явно разрешены для штамма G27, клинический изолят (фиг.7, 8).

• Полезность цитокератины 7 и 20 (CK7 /20) иммуногистохимия в отличие от короткого сегмента пищевода Барретта из жел…
• Добавление рН-чувствительного гель улучшает стабильность микроэмульсии для целевого удаления ободочной ammon…