Helicobacter pylori lipopolisacharido modifikacija, Lewisas antigeno ekspresija ir skrandžio kolonizacija nėra cholesterolio dependent

Helicobacter pylori
lipopolisacharido modifikacija, Lewisas antigeno ekspresija ir skrandžio kolonizacija nėra cholesterolio priklauso
tezės
Background pervežimas Helicobacter pylori
specialiai užima cholesterolio ir apima jį į bakterijų membranos, dar mažai yra žinoma apie cholesterolio fiziologinius vaidmenis. Mes palyginti fenotipus ir rezultatai in vivo
kolonizacijos gebėjimas pašalinti H. pylori,
auginami apibrėžtą, serumo neturinti augimo terpe, F12 su 1 mg /ml albuminas, kurių sudėtyje yra nuo 0 iki 50 g /ml cholesterolio.

Nors besidubliuojančių laikai buvo labai nepaveikė cholesterolio, buvo pastebėtas kitų akivaizdžių fenotipo pokyčius. H. pylori
padermės SS1 auginami nustatytoje terpėje su cholesterolio sėkmingai kolonizavo iš smiltpelėms skrandį, o SS1 išaugo be cholesterolio nepavyko kolonizuoti. H.pylori
lipopolisacharido dažnai rodo Lewis X ir /arba Y antigenus. Išraiška šių antigenų išmatuotas visas ląstelių ELISA buvo žymiai patobulintas kaip atsakas į augimo padermės SS1, 26695, arba G27 į cholesterolio. Be to, elektroforezės analizė lipopolisacharidų į laukinio tipo G27 bei mutantų trūksta O grandinę atskleidė struktūrinius pokyčius per oligosacharidinėse branduolys /lipidų liekanomis. Šie atsakymai Lewis antigeno lygiais ir lipopolisacharidų profilių cholesterolio prieinamumą buvo labai specifinė, nes nėra jokių pokyčių įvyko, kai cholesterolio buvo pakeista beta-sitosterolio arba tulžies druskų. Sutrinka genų, koduojančių cholesterolio alfa-glucosyltransferase ar lipidų phosphoethanolamine transferazės neturėjo Lewis raiškos poveikį, nei ant lipopolisacharidų profilius, nei ant cholesterolio reagavimą šių savybių. Sutrinka lipidų 1-fosfatazės genas eliminavo cholesterolio poveikį lipopolisacharidų profilius, bet ne jos poveikį Lewis išraiška.
Išvados
Kartu šie rezultatai rodo, kad cholesterolio išeikvojimas sukelia neįprastos formos LPS, kurie yra priklausomi nuo dephosphorylation lipidų A prie 1-oje padėtyje. Preliminarią modelis stebimų reiškinių cholesterolio aptarta, kurios nuosekliųjų žingsniai lipopolisacharidų biogenetyczne ir, nepriklausomai, pristatymas Lewis antigeno prie ląstelės paviršiaus, priklauso nuo membranos sudėtį. Šie nauji duomenys rodo, kad cholesterolio prieinamumas leidžia H.pylori
pakeisti savo mobilųjį voką taip, kad gali paveikti kolonizaciją priimančiosios audinio in vivo
.
Background
Helicobacter pylori
yra labai nišą -adapted patogenas, kad gyvena žmogaus skrandį, perduodama pirmiausia šeimoje, ir nėra žinoma aplinkai rezervuarą. Lėtinės infekcijos gali būti besimptomė arba sukelti gastritas, opa, arba skrandžio vėžiu. Norėdami nustatyti infekcijos, bakterijos turi išgyventi tranzitą per rūgštus skrandžio skyrių [1]. Jis įsiskverbia ir nustato gyvenamąją vietą apsauginiu gleivių sluoksnio ir lipid- ir cholesterolio turtingas aplinka [2, 3]. Per šią nišą bakterija dirba mechanizmų išvengti šeimininko imuninio atsako įvairovė.
Lipopolisacharidais (LPS) dėl H. pylori pervežimas paviršiaus pakeistas į tam tikrus žmogaus kraujo grupių antigenams aptikti, pirmiausia Lewisas antigenų X ir Y [ ,,,0],4-7], ir rečiau H 1 tipas, I-antigenas, kraujo grupės A, arba Lewis antigenų A arba B [8-10]. Šie paviršius LPS antigenai yra būtini infekcijos nustatymo, nes mutantas padermių defektais LPS O antigeno sintezės arba Lewisas X /Y raiškos nesugeba kolonizuoti peles [11-13]. Yra įrodymų, kad Lewisas antigenų ekspresija pasireiškia ant bakterijų paviršiaus prisidėti prie laikytis H. pylori pervežimas skrandžio epitelinių ląstelių [10, 14], ir vaidina svarbų vaidmenį audinių tropizmą [15-17]. Skrandžio epitelio ląstelės taip pat išreikšti Lewis antigenus [18, 19], o tai rodo, kad Lewis ekranas antigenais bakterijų paviršiaus gali tarnauti kaip mimikrija strategiją. Tyrimai Klinikinių izoliatų [18, 20] ir eksperimentinių infekcijų gyvūnams [21] paremti šį vaidmenį bakterijų Lewisas antigenų imuninės vengimu. Infekcija žmogaus, H. pylori
Lewis antigenai buvo susijęs su pepsinė opa ir duodenitas [16, 22] sunkumo. Kitas svarbus bruožas H. pylori pervežimas LPS yra jo keistas lipidų struktūrą, riboto acilinant ir mažiau krūvio grupėmis nei yra tipiškas enterobakterijų [23]. Šie lipidų modifikacijos sumažinti endotoksinio ir uždegiminių savybių H. pylori
LPS (peržiūrėtas [24]).
Cholesterolis yra neesmine maistinės H.pylori
, nors ji skatina augimą žiniasklaidos serumo be [ ,,,0],25, 26]. H.pylori
specialiai įtraukti cholesterolio į bakterijų membranos [27], kaip tai daro ribotą skaičių patogeninių ir simbiotinėje bakterijų, įskaitant Proteus mirabilis, Lactobacillus acidophilus
, Borrelia sp pervežimas., Ir Mycoplasma
[ ,,,0],28-30]. Cholesterolis gali sustiprinti šiose organizmų [30-32] membraną. H. pylori taip pat
unikaliai sudaro cholesterolio alfa-glikozido [33, 34], ir šis metabolitas gali būti toliau pakeistas acilinimo arba phosphatidylation [34]. Alfa-glucosylated cholesterolio trukdanti imuninę reakciją į bakterijos į pelės modelį, per slopinimo fagocitozę ir T ląstelių aktyvacija [35]. Kiti vaidmenys cholesterolio ir cholesterolio metabolitų bakterijų membranos dar turi būti ištirta. Šioje ataskaitoje, mes rodo, kad lipopolisacharidų biosintezė, įskaitant Lewis antigenų ekspresijos ir LPS core /lipidų pakeitimo, yra pakeista prieinamumo cholesterolio augimo terpėje. Pristatome duomenų, rodančių, kad šie pokyčiai ląstelių apvalkalo gali ženkliai įtakoti patogeno /šeimininko sąveiką gyvūnų modelyje infekcijos.
Metodai
bakterijų padermių ir augimo sąlygas
padermių H.pylori
įtraukti laboratorija padermės ATCC43504 (kilmė: Australija), 26.695 (Jungtinė Karalystė), klinikinė izoliatas G27 (Italija [36], su sąlyga, N. Salama) ir pelė pritaikyta deformacijų SS1 (Australija, su sąlyga, Adrian Lee [37]). Bakterijos buvo palaikoma 37 ° C temperatūroje microaerobic atmosferoje 5% O 2 /ES 10% CO 2 d Campylobacter kraujo agaru (CBA). Bakterijos buvo passaged kas 2 iki 3 dienų, ir ne daugiau kaip 25 dienų, siekiant sumažinti genetinio pasyvumo. Augimo chemiškai apibrėžtos vidutinės trukmės [26], bakterijos buvo užsėti iš CBA į audinių kultūroje kolbose su Ham F12 (GIBCO) su 1 mg /ml galvijų serumo albumino (riebalų rūgščių be Sigma A7906), nurodyta visoje kaip apibrėžta terpėje. Skystos kultūros buvo passaged kasdien skiedžiant į šviežią terpę pradinėmis tankius, 1-2 × 10 6 /ml, o naudojamas plaukimo 3 iki 5. Ląstelių kultūros lygio cholesterolio (> 99%, Sigma), buvo įtraukta į F12 kaip stabili 10 × emulsija, kurios sudėtyje 500 g /ml cholesterolio, disperguotą 10 mg /ml albuminas, kurį naudojant buvo paruošta pagal [38]. Šie žiniasklaidos papildymai buvo atliekami panašiu būdu: beta-sitosterolio (sintetinis, 95%), natrio taurocholatas, natrio glikocholiatas ß-estradiolio, progesterono (visi nuo Sigma), Dehydroepiandrosterone (Calbiochem) ir ß-coprostanol (Matreya) .
dvigubinti kartų log fazių augimo metu buvo nustatyti kiekybiniam gyvybingų ląstelių naudojant Cell titras GLO reagento (PROMEGA), kaip įteisinti ir aprašyta [39]. Matavimo biomasės kaip KSV, kaip ląstelių baltymų, arba kaip ATP visi gaminami nuoseklių rezultatų. Pagal 1 attomol ATP vienoje ląstelėje vertė [40] buvo manoma, už kasdieninį ištrauka. Galimas netikslumas šios vertės nėra iš esmės įtakoti duomenų išaiškinimo.
Izogeninių genų sutrikimų buvo pasiekta įterpiant į Campylobacter coli
atsparumas chloramfenikolio elementas (kačių
) pagal aprašytą Chalker kt
strategijos> [41]. Gruntai buvo kruopščiai suprojektuotas taip, kad nukreipti seka per atvirų skaitymo rėmelių ir yra išvardyti 1 lentelėje sintezės PGR reakcijų naudojant PGR Extender sistema (5Prime) pateikta 2.3 mM kiekvieno gelio-išgrynintas šabloną, 50 mkm gruntas, 1 × Tuning buferis, 1,25 mm Daugiau Mg ++ 0,2 mM dNTP ir 0,01 V /mikrol polimerazė. Sintezės ciklo sąlygos buvo tokios: 94 ° C temperatūroje 2,5 min, 10 ciklų [94 ° C 15 sek, 45 ° C, 60 sek, 68 ° C, 60 sek KB], 25 ciklų [94 ° C, 15 sek, gruntas konkrečių TM 30 sek, 68 ° C, 60 sek KB], galutinis išplėtimas 68 ° C, 6-8 min. Fusion produktai buvo reamplified su Pfx50 (Invitrogen) padidinti kiekį, tada išgrynintas naudojant Qiaquick PGR gryninimo rinkinį (QIAGEN). Gavėjas kamienai auginami 1 dieną ENA buvo transformuota 500 ng galutinio amplikono naudojant natūralų transformaciją [42, 43], po atrankos 7-10 dienų ENA, kurių sudėtyje yra 15 mikrogramai /ml chloramfenikolio. Siekiant užtikrinti alelių pakeitimo, Gaunami kamienai buvo įvertintas PGR iš genomo DNR, naudodami GoTaq (PROMEGA) su nurodytomis 1 lentelėje PGR strategijos gruntų ir rezultatai rodomi 1.Table 1 pav gruntas sekas.
gruntai alelių sutrikdymo
į pervežimas pervežimas CAT Fwd [41]
GATATAGATTGAAAAGTGGAT
F5b
CAT aps [41]
TTATCAGTGCGACAAACTGGG
cgtfwd
atggttattgttttagtcgtgga
cgtM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatatggtggatatagcggtaatg
cgtM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAttaaaaacttgcaccctttatgt
cgtrev
ctctgatcgcttcttcataaact
pmifwd
atgaaaattaaaaatatcttactgagtggg
pmiM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCatctaaaccattagggctttcaatatac
pmiM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAActttagtgaacgaggtagaaacaaac
pmirev
ttttgtctgttaaaatcatcatcaat
lpxE Fwd
atgaaaaaattcttatttaaacaaaaattttgtgaaagc
lpxEM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCcccaaacgctgatcgttgat
lpxEM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAcgagcgcccttatggag
lpxErev
ttaaggctttttggggcttgtaaa
eptAfwd
ttggcatcattattccatctgaggt
eptAM3
ATCCACTTTTCAATCTATATCgcaacaccccaaaaacaacgata
eptAM5
CCCAGTTTGTCGCACTGATAAagcctgattaacgcctatgaca
eptArev
ttactcttttttgtgtttaagcagatctaaagaa
papildomų gruntai patvirtinimo genų sutrikimo
G27_951fwd
agtgattcaagatggcgtgaaaa
F1
G27_953rev
ccaagctcaatcatttctttgtcttt
R1
G27_37fwd
cggcatggggatcaatcaag
F2
G27_39rev
ctcccgtcttgcccggtaac
R2
G2719fwd
gggcgataaaatcgtgtttca
F3
G2721rev
tcccctttatcgtttatgctaatga
R3
G2720fwd
cccaaactgagcgctaaca
F4
G2722rev
aagaaatttcaaggtataatagtttccaag
R4
aRespective genų numeriai viešųjų duomenų bazių 26695 ir G27 yra taip: [CGT: hp0421, G27_952
], [SSD
(rfbM
): hp0043, G27_38
], [lpxE: hp0021, G27_20
], [EPTA:. hp0022, G27_21
]
bRighthand skiltyje nurodomi trumpi gruntas pavadinimų, naudojamų 1 pav
1 pav PGR patikra alelių sutrikimų H. pylori padermės G27. Genomo DNR buvo ruošiamas iš genų sutrikdė G27 padermių šiuos tris ištraukas pagal chloramfenikolio atrankos, tada PGR amplifikacijos, kaip parodyta kiekvieno schemą. Gruntai sekos yra pateikti 1 lentel A. sutrikimų CGT. Penki pavyzdžiai rodomi iš septynių atskirų klonų, kurie visi, identiški rezultatų ekrane. B. Sutrikimų SSD (rfbM). Visa chloramfenikolio atsparus gyventojai buvo passaged kiekviename atrankos turo, be klonų atranką. C. Sutrikimų lpxE ir EPTA. Visa chloramfenikolio atsparus gyventojai buvo passaged kiekviename atrankos turo, be klonų atranką.
Skrandžio kolonizaciją
Gyvūnų eksperimentai buvo patvirtinti LSUHSCS institucinių Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas. Moteris Mongolijos smiltpelės buvo išlaikyta įprasta mityba iki soties
. Siekiant išsaugoti judrumą H. pylori
padermės SS1 buvo išauginti per naktį microaerobic sąlygomis T75 kolbose su 40 MGL apie F12 terpėje su 0,4 mg /ml albuminu ir 0 arba 50 mikrogramai /ml cholesterolio. Į judrių Planktoninė bakterijos buvo surinktos centrifuguojant ir resuspenduota izotoniniu fiziologiniu tirpalu. Kolonijas sudarančių vienetų (KSV) buvo matuojamas šiose užkrato pagal serijos skiedimo ir dengimo ant ENA, ir šie matavimai patvirtina vienodas dozes gyvybingų bakterijų tarp dviejų augimo sąlygų. Maždaug 10 8 KSV per 30 įxL buvo pateiktas žodžiu gyvūnams (n = 6 iki 9 kiekvienai grupei). Gyvūnai buvo numarinti 11 dienų, ir skrandžiai buvo pašalinta ir išpjaustytų. H. pylori
esančių skrandžio Ertmė homogenatai buvo kiekybiškai serijos skiedimo ir dengimo ant ENA, kuriame 5-fluorocytosine (5 mikrogramai /ml), vankomicinu (10 mikrogramų /ml), amfotericino B (5 mikrogramai /ml), bacitraciną ( 30 mikrogramų /ml), polimiksino B (10 V /ml), ir trimetoprimas (10 mikrogramai /ml) [44]. Duplicate CFU matavimai buvo atlikti kelis skiedinių kiekvieno audinio mėginio.
Visa ląstelių IFA
standartines procedūras [6, 7, 45], buvo pritaikyta peroksidazės konjuguoto antrinio antikūno naudojimui. Visi antikūnai buvo gauti iš CalBiochem. Vienos nakties bakterijų kultūros buvo surinkti centrifuguojant 3500 × g
10-15 min, išplautos Dulbecco fosfatinio buferio druskų tirpalo, ir repelleted 10000 × g
2 min, po to vėl suspenduojamos 15% glicerolio /0,9% NaCl. Ląstelių suspensijos buvo tiriami baltymų kiekio ir laikomi -20 ° C temperatūroje. Mobilaus ryšio mėginiai, kuriuose yra žinomo kiekio baltymų buvo greitai praskiesti į 50 mM natrio hidrokarbonato /karbonato pH 9.55 ir apsieiti karto į duobutes ELISA plokštelės (Costar΅7). Plokštelės buvo uždaromos ir šaltai per naktį, po to blokuojamas 90 min 3% galvijų serumo albumino, ištirpintu plovimo buferio, kurį sudarė 0,1 M natrio fosfato pH 7,4 /0,1 M NaCl /0,1% w /v Tween-20. Pirminis antikūnas, monokloninis anti-Lewis X (Signet klonas P12) ar anti-Lewis Y (Signet klonas F3), skiesti santykiu 1: 500 plovimo buferio /1% BSA, buvo pridėta 2 valandas, po to keturių pokyčių plovimo buferio. Antrinis antikūnas, 1: 2500 praskiedimas krienų peroksidazės-konjuguoto ožkos anti-pelės IgM į plovimo buferio /1% BSA, buvo pridėta 90 min, o po to keturių pokyčių plovimo buferio. Chromogeninių substratas buvo 0,42 mmol tetramethylbenzidine ir 0,02% O 2O 2 50 mM acetatas /citratas, pH 5,5 [46]. Po to, kai 15 minučių kambario temperatūroje, reakcijos, kuri buvo sustabdyta su 1/5 tūrio 2,5 N H 2SO tirpale 4, ir spalvos pasikeitimas buvo išmatuotas esant plokštelių skaitytuvas esant 450 nm bangos ilgiui. Be neigiamos kontrolės praleidžiant arba pirminio arba antrinio antikūno arba E. coli padermės pervežimas HB101 pakeistų H. pylori
, spalvos pokytis buvo nežymus (< 0,05). Lygiai Lewis Y buvo nežymus (< 0,1) per padermė 26695 arba 43504, o buvo Lewisas X lygiai SS1
elektroforeziniai analizė lipopolisacharidais
H. pylori
kultūrų buvo surinkti, kaip aprašyta aukščiau, ir išplauti. Mobilaus ryšio granulės buvo laikomi -70 ° C temperatūroje. Ląstelės buvo lizuojamos į 60 mmol Tris HCl, pH 6,8, kurioje yra 2% SDS ne 95-98 ° C temperatūroje 10 min. Baltymų kiekis buvo matuojamas naudojant bicinchoninic rūgšties tyrimą (Pierce). Mėginiai ląstelių lizato buvo pritaikytos prie vienodo baltymų kiekio (1 mg /ml), tada proteolyzed reakcijose, kurių sudėtyje yra (galutinis) 60 mM Tris HCl pH = 6,8, 0,67% SDS, ir 0,67 mg /ml proteinazės K, esant 60 ° C temperatūroje 2 valandas [47]. Norėdami pašalinti elektroforezės artefaktus dėl su lipidų /ploviklių kompleksų buvimas, proteolyzed mėginiai buvo paimti su karštu fenolio [48]. Kontrolės eksperimentai patvirtino, kad visi LPS juostos buvo išieškota per šią ekstrakcijos procedūra kokybiškai ir be šališkumo. Proteolyzed mėginiai buvo sumaišyti su 1 tūrio 90% vandeninio fenolio ir inkubuojami 70 ° C temperatūroje 20 min. Po to, kai atšaldytas iki 10 ° C temperatūroje 1 min, mėginiai buvo centrifuguojamas 12000 × g
20 min 10 ° C, o vandeninė fazė surenkama. Fenolio etapai buvo pakartotinai ekstrahuojamas 1 tūrio H 2O esant 70 ° C temperatūroje 10 min, ir centrifuguojama pakartotas. Deriniai, vandeniniai ekstraktai buvo koreguojamos iki 0,5 M NaCl ir nusodinamas 10 tūrio etanolio į šaldytuvą per naktį, po to centrifuguojamos 20.000 × g
20 min 10 ° C ir džiovinami ore. Išgrynintų LPS mėginiai buvo ištirpinama Laeminli pavyzdžių buferio [49], esant 95 ° C temperatūroje 5 min. Mėginiai buvo taikomas 15% poliakrilamido /0,9% bis minigels, kuriuose yra 3,2 m karbamido su Laemmli diskretinio buferio formavimo [49], ir 5% krovimas geliu. Po elektroforezės esant 150 V 75 min, geliai arba buvo nustatyta per naktį sidabrine žyme [50] arba perkelti į polyvinylidenedifluoride membraną naudojant tri /glicinas perdavimo buferio [51]. Dėmės buvo užblokuotas per naktį 3% albumino galvijų serumo ir 0,03% NaN 3 pirmiau aprašytą IFA plovimo buferio. Pirminis antikūnas (anti-Lewis X ar anti-Lewis Y, 1: 200) ir antrinė antikūnas (peroksidazės-konjuguoto ožkos anti-pelės IgM, 1: 1000) buvo praskiesti plovimo buferio, kurio sudėtyje yra 0,5% BSA. Kolorimetrinis aptikimo naudojamas 3,3'-diaminobenzidinas su kobalto stiprinimo [52]. Densitometry buvo atliktas su viešojo domeno Application image J, kurią galima rasti adresu: http:.... //RSB informacijos NIH valst /ij
rezultatai
mažai žinoma apie fiziologinių funkcijų cholesterolio H . pylori
. Ištirti atsakus H. pylori
cholesterolio, mes priėmė apibrėžtą, serumo neturinti kultūros terpė, F12 su 1 mg /ml albumino, kuriame ši bakterija gali būti stabiliai passaged [26]. Tai kuklus koncentracija albumino didina augimo [25, 26] ir švelnina nereguliaraus laikytis kultūros paviršių, įvyksta baltymų be žiniasklaidos [53]. Šiuo apibrėžtą terpę, papildymas 50 mikrogramų /ml cholesterolio reikšmingai nepakeitė augimo tempas (2 paveikslas). Augimo poveikį pagal pasirinktus kultūros sąlygomis nebuvimas naudingas tyrimo fiziologinės reikšmės cholesterolio H. pylori pervežimas. Taigi, mes galėjome palyginti skrandžio kolonizaciją smiltpelėms pagal deformacijų SS1, kurie buvo išauginti nustatytoje terpėje, turinčioje įvairius kiekius cholesterolio (3 paveikslas). Vienuolika dienų po skiepijimo burnos H. pylori
skrandžio antralinėje dalyje buvo selektyviai padengtą ir kiekybiškai. Stebėtinai, smiltpelės buvo kolonizuota tik kultūrų, auginamų cholesterolio-terpėje, turinčioje, bet ne H. pylori
auginami cholesterolio neturinčioje terpėje (Kiekvieno eksperimento metu, P < 0,0001 palyginimui rąsto (KSV /g) tarp grupių naudojant Studentas du-tailed t-testas). Todėl, cholesterolio buvo esminė augimo terpėje, siekiant nustatyti H. pylori
infekcija šiame gyvūno modelio. 2 pav papildymas cholesterolio į apibrėžtą terpę neturi įtakos H. pylori augimo greitį. Paraleliniai kultūros kiekvienos padermės buvo auginami naktį F12 /albumino (1 mg /ml) nebuvimas (Open barų) arba buvimą (tamsesnės juostos) 50 mikrogramai /ml cholesterolio. Pradinė gyventojų tankumas buvo 2 × 106 /ml. Padvigubinti kartų buvo apskaičiuojamas pagal išmatuotą padidinti biomasės. Vertes, nurodytas atstovauti vidurkis ± SD penkerius ar daugiau nepriklausomų matavimų. N
. ai
. Studento du-tailed T-testas poravimas duomenys rodo, jog statistinis reikšmingumas.
3 paveikslas H. pylori išaugo be cholesterolio nesugeba kolonizuoti smiltpelėms. H. pylori
padermės SS1 buvo auginama per naktį apibrėžtą terpę, turinčią 0 arba 50 mikrogramai /ml cholesterolio. Smiltpelės buvo žodžiu pasėta 3,5 × 108 KSV (eksperimentas A) arba 1 × 108 KSV (eksperimentas B). H.pylori
skrandžio antralinėje dalyje buvo kiekybiškai ne 11 dienų. Kiekvienas vertikali juosta atstovauja dvigubo nustatymo reiškia vieno gyvūno, ir horizontalios linijos suteiks kiekvienai gydymo grupėje medianą. Jei nėra kolonijos buvo susigrąžinta, vertybės buvo registruojami kaip 5 × 102 KSV /g audinio, numatomą aptikimo riba.
Tam tikrų kamienų H. pylori pervežimas eksponuojami reikšmingų skirtumų laikytis kultūros laivams ištrauka cholesterolio, o tai rodo pakitimai jų ląstelių paviršiaus savybes (Hildebrandt & McGee, neskelbtų pastebėjimai). Dėl šios priežasties mes nusprendėme ištirti lipopolisacharidais, kurios sudaro pagrindinę komponentas ląstelės voką, ir tarnauti pristatyti biologiškai svarbių Lewis antigenus. Mes dirbo nusistovėjusias visa ląstelių ELISA procedūrą quantitate svarbiausius Lewis antigenus, Lewis X ir Y (4 paveikslas). Pagal literatūroje [54, 55], visų pirma Lewis X buvo aptikta štamo 26695, tik Lewis Y buvo aptikta SS1, ir didelių lygiai tiek buvo aptikta į G27. Kiekvienu atveju optinio tankio rodmenis buvo netiesinė atžvilgiu paragauti apkrova, įvykius, kurie nėra neįprasta ELISA testais [56], ir kad buvo pastebėta, kitų tyrėjų naudojant tuos pačius monoclonals [7]. Tokiu būdu, kad būtų galima palyginti antigenų kiekį mėginiuose, H. pylori
kultivuojamos nedalyvaujant arba dalyvaujant cholesterolio, mes atliekamas lygiagrečiai titravimo per atrankinių įkrovą nuo 20 iki 500 ng ląstelių baltymų vienoje gerai diapazone. Šie titravimas atkuria rodo žymų padidėjimą Lewis X ir /ar Lewisas Y antigeno kiekio aptikti ant ląstelės paviršiaus, kai H. pylori
padermių 26.695, SS1 arba G27 buvo auginamos cholesterolio akivaizdoje (4 paveikslas). Į kartotinių nepriklausomų eksperimentų, vidutinis cholesterolio-priklauso padidėja buvo statistiškai reikšmingas (2 lentelė). Palyginami rezultatai taip pat buvo gautas Lewis X padermės 43504 (duomenys neparodyti). Pakilo mėginius su cholesterolio ties augimo laikotarpio pabaigos nepakeitė Lewis antigeno kiekį aptiktas ELISA (5a pav.) Kitoje kontrolės eksperimento mes patikrinti per visą šių padermių, kad ląstelių baltymų kiekis jungiasi į šulinėlius dėl to nepasikeitė augimo cholesterolio (5B pav) keturių. Taigi IFA rezultatus nustatyta, kad padidėjo paviršius išraiška Lewis antigenus buvo teisėtas biologinis atsakas į cholesterolio, kad įvyko visų tirtų padermių. Šis atsakymas buvo konkretus cholesterolio, nes pakeitimas cholesterolio augimo terpėje su struktūriniai analogai beta-sitosterolio arba natrio taurocholato neturėjo Lewis X arba Y raiškos efektą G27 (4 pav, dešinioji plokštės ir lentelės 3). Lewis antigeno reakcija į cholesterolio liko po sutrikimo genų cholesterolio alfa-glucosyltransferase (CGT pervežimas) į padermės G27 (2 lentelė ir žiūrėti žemiau) ir 26695 (duomenys neparodyti), atmetant apie alfa dalyvavimą -glycoside metabolitų cholesterol.Table 2 Enhancement ląstelių paviršiaus Lewis antigenų ekspresijos kultūrų augimo ir cholesterol.a

kartus daugiau, palyginti su lygiagrečiai cholesterolio kultūros

Lewis X
Lewisas Y

vidurkis ± SEM (N)
P vertę
vidurkis ± SEM (N)
P vertę
26.695
4,32 ± 0,36 (6)
0,0002
nepadarė
SS1
nepadarė
1,88 0,08 (5)
0,0004
G27 laukinio tipo
2,85 ± ± 0,42 (8)
0,0033
2,22 ± 0,24 (8)
0,0016
G27 CGT :: katė

3,69 ± 0,34 (5)
0,0013
2,88 ± 0,30 (5)
0,0034
G27 lpxE :: katė

2,59 ± 0,50 (6)
0,025

2,47 ± 0,43 (7)
0,014

Lewis antigenai buvo kiekybiškai per ėminių kartotinę visos ląstelių IFA analizes suporuotas mėginių auginamų buvimą ar nebuvimą 50 mikrogramų /ml cholesterolio. Antigenas apkrova buvo 300 ng ląstelių baltymų vienam gerai. Rodikliai plius: minus cholesterolio buvo apskaičiuotos iš pasikartojančių grynojo optinio tankio rodmenų kiekviename tyrime, ir nustatytas penkerių iki aštuonerių nepriklausomų ELISA veikia santykiai buvo tada vidurkis. P vertės apskaičiuotos dviem-tailed Studentų t-testas hipotezei, kad santykis lygus 1.
3 lentelė Glaudesnis ląstelių paviršiaus Lewis antigenų ekspresijos išraiškas yra cholesterolio konkrečių

kartus padidėjo, palyginti su lygiagrečiai cholesterolio kultūros

Lewisas X
Lewisas Y


vidurkis ± SEM (n)

p reikšmė
vidurkis ± SEM (N)
P vertę

cholesterolio
2,96 ± 0,22 (5)
.0008 pervežimas pervežimas 2,48 ± 0,10 (4)
.0007
β- sitosterolio pervežimas 1.80 ± 0.47 (4)
0,19
1,19 ± 0,13 (3)
0,28
taurocholatas
0,64 ± 0,16 (4)
0,12
0.84 ± 0,20 (3)
0,52
Lewis antigenai buvo kiekybiškai ir pakartoja visa ląstelių ELISA analizė poravimas kultūrų H. pylori
G27 auginamų buvimą ar nebuvimą 130 mikromolių cholesterolio, ar tai lygi koncentracija beta-sitosterolio arba natrio taurocholato. Antigenas apkrova buvo 300 ng ląstelių baltymų vienam gerai. Rodikliai plius: minus cholesterolio buvo apskaičiuotos iš pasikartojančių grynojo optinio tankio rodmenų kiekviename tyrime, ir nustatytas trijų iki penkių nepriklausomų ELISA veikia santykiai buvo tada vidurkis. P vertės apskaičiuotos dviejų ledinių Studentų t-testas hipotezei, kad santykis lygus 4 1.
pav augimas cholesterolio specialiai padidina ląstelių paviršiaus rodyti Lewis antigenus. Sveikos ląstelės ELISA tyrimai buvo atliekami mėginių H. pylori
padermės 26695 (viršutinis kairėje), SS1 (apatinė kairėje) arba G27 (viršutinė ir apatinė dešinėje). Paraleliniai kultūros buvo auginamos per naktį apibrėžtą terpėje, turinčioje 130 mikronų iš šių papildymų: apskritimai, ne papildymas; kvadratų, cholesterolio; trikampiai, β-sitosterolio; X, taurocholatas. Įvairaus kiekio ląstelių suspensijos, atitinkantys žinomų kiekių ląstelių baltymų buvo taikomi dubliuoti duobutes ELISA plokštelės, ir immunoassayed už Lewis X ar Lewisas Y antigeno buvimą kaip aprašyta metodai
. Neigiami kontroliniai mėginiai E. coli pervežimas HB101 arba buferio-tik ruošiniai, krito ant punktyrinės linijos. Absorbcijos rodmenys individualių šulinių yra grafikas. Pakartokite eksperimentai su trimis ar daugiau nepriklausomai išaugo kultūrų davė iš esmės tokius pačius rezultatus.
5 paveikslas ELISA kontrolės eksperimentų. A. pakilo su cholesterolio ties augimo laikotarpio pabaigos nekeičia Lewis antigenų ekspresijos išraiškas. Kultūros ir H. pylori
buvo auginamos per naktį apibrėžtą terpę be (transportavimo kontrolė) arba su 50 mikrogramų /ml cholesterolio (cholesterolio auginami). Trečioji kolbą (cholesterolio koncentracija lygi) buvo auginamos cholesterolio nėra, atšaldyti ant ledo, ir lygiavertis cholesterolio kiekis buvo pridėta prieš ląstelės buvo nuimta. Lewis antigenai buvo kiekybiškai dviem egzemplioriais visa ląstelių ELISA, pakrovimo 300 ng ląstelių baltymų vienam gerai. Rodikliai plius: minus cholesterolio buvo apskaičiuotos iš vidutinių grynųjų optinio tankio rodmenis kiekvieno testo, o sklypas ekranų reiškia santykį ± SEM trijų iki penkių nepriklausomų IFA veikia. P vertės apskaičiuotos dviejų ledinių Studentų t-testas hipotezei, kad santykis lygus 1. palyginimų paženklinti ns P > 0,05. B. Ekvivalentinis privalomas ląstelių ELISA plokštelių. Mėginiai H. pylori
, kad buvo auginamos lygiagrečių kultūrų nesant (baltos juostos) ar dalyvaujant 50 mikrogramų /ml cholesterolio (pilkos juostos) buvo taikomas daugiaertmėse plokščių tuo pačiu būdu, kaip ir Lewis antigenas ELISA testus, pridedant 500 ng ląstelių baltymų vienam gerai. Taip nakties priedą, šulinių buvo plaunama du kartus Dulbecco fosfato-buferio druskų tirpalo, tada baltymas lipnių ląstelių buvo kiekybiškai naudojant BCA reagentą. Vidutinės vertės ± SD ir keturiais egzemplioriais šulinių rodomi.
Detection of Lewis X ir Y munoblotingu su tais pačiais monokloninių antikūnų pagamintų rezultatą kitą (6 paveikslas). Be kelių bandymų, naudojant šią techniką, mes neaptiko jokių cholesterolio priklauso nuo skirtumų Lewisas X arba Y lygių, išskyrus nedidelį padidėjimą Lewis X 43504, kuris buvo tik šiek tiek reikšminga. Blottingu tvarka buvo taikoma LPS pavyzdžius, išskirtus iš ląstelių lizato, ir iš esmės turėtų būti aptikti visą korinio Lewis antigeną baseinas, kadangi visas-ląstelių ELISA metodas yra skirtas aptikti tik, kad pateikiama ekstraląstelinio paviršiaus. Įdomus skirtumas rezultatus tarp mūsų IFA analizuoja ir immunoblots siūlo į ląstelių plitimui iš Lewis antigeno priklausomai nuo cholesterolio prieinamumą augimo terpėje. 6 pav Lewisas X ir Y antigenas profiliavimas munoblotingu. Mėginiai LPS išskirtos iš lygiagrečių kultūrų auginamų nesant (-) arba buvimo (+) 50 g /ml cholesterolio buvo išspręstas 15% karbamido geliai. Kiekiai pakrautas už juostos, kaip mikrogramų pradinio lizate baltymų, pateikiami kiekvienos juostos viršuje. Po perdavimo, antigenai buvo immunodetected su konkrečiais už Lewis X (viršutinė skydo) ar Lewisas Y (mažesnė grupė) monokloninių antikūnų. Tipinis pavyzdys kiekvienam yra parodyta. Šoninės juostos yra prestained baltymų žymekliai (M) arba 400 ng E. coli O111
: B4 LPS. Antigeninė signalas atsirado tik Ö grandinės regionuose šių H. pylori
padermių; tušti plotai buvo apkarpytos iš atitinkamai. Į immunoblots buvo savarankiškai pakartoti keletą pavyzdžių rinkiniai ir densitometrija buvo naudojamas quantitate antigeno signalą kiekvienai juostai. Rodikliai Porinis plius: minus cholesterolio mėginių buvo apskaičiuotos, o vidutinis santykis ± SEM už (N) dėmės pateikiami mėlynai. Null hipotezė, kad santykis lygus 1 buvo įvertintas dviejų tailed Studentų t-testą.
Be Lewis antigeno matavimo, mes tiesiogiai palygino lipopolisacharidų profilius tarp lygiagrečių kultūrų auginamų buvimą ar nebuvimą cholesterolio, naudojant gelį elektroforezės ir sidabro dažymo. Visais H. pylori
padermių mes išnagrinėjome, LPS band profiliai buvo identiški tarp auginamų apibrėžtą terpę su cholesterolio, kad gauti vidutinio serumo sudėtyje yra arba kraujo agaru (duomenys nerodomas) kultūrų ir, kaip tikimasi, [5 , 24, 55, 57] šie profiliai buvo labai padermė konkrečiai.

• Iš citokeratinams naudingumo 7 ir 20 (CK7 /20) imunohistocheminis į trumpalaikių segmento Barrett stemplės skrandžio žarnyno metaplazijos skirtumo: Ar tai patikimas
• PH--jautrus gelio papildymas pagerina mikroemulsija stabilumą tiksliniam pašalinus storosios žarnos amoniako